王小寧，曹 斌，張存勞，白佳怡

(1．西安醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，陜西 西安 710021；2．陜西醫(yī)藥控股集團(tuán)山海丹藥業(yè)有限責(zé)任公司，陜西 西安 710075)

牡丹(PaeoniasuffruticosaAndr.)為毛茛科芍藥屬木本植物，是我國特有的木本名貴花卉。牡丹籽油來源于牡丹的種籽，具有很豐富的藥用及食用價(jià)值[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，牡丹籽油在200～420 nm有強(qiáng)吸收，恰好能夠有效吸收紫外線中波長為320～420 nm的UVA，因此具有顯著的防曬美白功效[3-4]。據(jù)研究，牡丹籽油中發(fā)揮防曬功效的成分為不飽和脂肪酸亞油酸，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)可達(dá)19.09%～34.9%[5]。然而，牡丹籽油水溶解度低，直接使用易引起皮膚干燥、刺激等問題，因此開發(fā)牡丹籽油的新型經(jīng)皮給藥制劑具有重要意義。納米乳凝膠(nanoemulsion-based gels，NBGs) 是將藥物與納米乳液加入凝膠基質(zhì)中形成的透明、穩(wěn)定的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)膠體。納米乳能夠顯著改善藥物的刺激性，并具有良好的透皮性和穩(wěn)定性[6-7]，凝膠則能提高乳劑的黏度，增強(qiáng)其黏附性和涂布性，延長藥物滯留時(shí)間[8-9]。因此，作者制備了牡丹籽油納米乳凝膠，對其質(zhì)量進(jìn)行評價(jià)，并考察其體外透皮特性，為進(jìn)一步研究與開發(fā)牡丹籽油新劑型并促進(jìn)其在化妝品領(lǐng)域的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

牡丹籽油：壓榨提取，由陜西興森源生物科技有限公司提供；卡波姆-980、聚氧乙烯氫化蓖麻油、PEG400：藥用級，甲醇、乙腈：色譜純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；吐溫-80、異丙醇、三乙醇胺：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；亞油酸對照品：批號B21241，純度≥98.0%，上海源葉生物科技有限公司。

萬分之一電子分析天平：ALC-210.4，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；實(shí)驗(yàn)室高剪切均質(zhì)乳化機(jī)：ESR-500，上海易勒機(jī)電設(shè)備有限公司；超聲波清洗器：KQ5200E，昆山市超聲儀器有限公司；低速大容量離心機(jī)：TD5M，上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；馬爾文激光粒度儀：ZEN3600，英國馬爾文儀器有限公司；藥物透皮擴(kuò)散試驗(yàn)儀：RYJ-6B，上海黃海藥檢儀器有限公司；高效液相色譜儀：Agilent Tech-1260，安捷倫科技有限公司；數(shù)顯黏度計(jì)：SNB，上海方瑞儀器有限公司；差示掃描量熱儀：DSC1，梅特勒-托利多國際貿(mào)易(上海)有限公司。

1.2 牡丹籽油納米乳的處方篩選

以粒徑及多分散系數(shù)(polydispersity index,PDI)為指標(biāo)，按表1處方，取牡丹籽油、乳化劑、助乳化劑混勻，加入50 mL蒸餾水(純化水)，經(jīng)高剪切均質(zhì)乳化機(jī)乳化3 min，制得牡丹籽油納米乳。

表1 牡丹籽油納米乳處方

1.3 凝膠基質(zhì)的處方篩選

稱取卡波姆-980適量，加適量甘油潤濕后，加蒸餾水至100 g，攪拌均勻，靜置24 h使其充分溶脹，用體積分?jǐn)?shù)為20%三乙醇胺溶液調(diào)節(jié)pH至一定值，3 000 r/min離心10 min即得凝膠基質(zhì)[10]。以凝膠基質(zhì)的外觀性狀、成型性、黏稠度、涂布性為評價(jià)指標(biāo)，考察卡波姆-980的用量(0.3、0.5、0.8、1.0、1.5 g)、甘油用量(5、8、10、12、15 g)、pH值(4.0、5.0、6.0、7.0、8.0)對凝膠基質(zhì)的影響，篩選最優(yōu)凝膠基質(zhì)處方。其中，外觀包括凝膠的澄清透明度、有無光澤、有無沉淀等，涂展性分為快速鋪展、慢速鋪展與難以鋪展[11]。

1.4 牡丹籽油納米乳凝膠的制備

按“1.2”方法制備牡丹油納米乳，按“1.3”方法制備凝膠基質(zhì)，將牡丹油納米乳緩慢加入到已經(jīng)溶脹好的卡波姆-980凝膠基質(zhì)中，攪拌均勻，加蒸餾水至50 g，3 000 r/min離心10 min除氣泡，得牡丹油納米乳凝膠[12]。

1.5 牡丹籽油納米乳凝膠的質(zhì)量評價(jià)

觀察納米乳凝膠的外觀形態(tài)，采用黏度計(jì)測定凝膠黏度，采用馬爾文激光粒度儀測定粒徑及Zeta電位，采用高速離心法考察其物理穩(wěn)定性，通過涂布實(shí)驗(yàn)考察其皮膚涂布性。

1.6 牡丹籽油的含量測定方法學(xué)考察

色譜條件：Diamond C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相為乙腈-φ(磷酸)=0.1%溶液(體積比為90∶10)，流速為1.0 mL/min，檢測波長為203 nm，進(jìn)樣量為20 μL，柱溫為30 ℃[13]。

方法學(xué)考察：精密稱取亞油酸對照品7 mg，用甲醇定容至10 mL，配制成0.7 mg/mL的溶液，再量取1 mL至另一容量瓶中，用甲醇定容至10 mL，制得母液適量。分別量取母液0、2、4、6和8 mL，用甲醇定容至10 mL容量瓶，得質(zhì)量濃度分別為0.014、0.028、0.042、0.056和0.070 mg/mL的對照品溶液。按色譜條件依次進(jìn)樣。以峰面積(A)為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度(ρ)為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。同時(shí)，進(jìn)行精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性和加樣回收率考察。

1.7 體外透皮特性研究

離體皮膚的制備：斷頸法處死小白鼠，剝離小鼠皮膚后，取小鼠腹部皮膚，剪去多余皮毛，除去其皮下組織，仔細(xì)用棉簽擦去皮下脂肪，直到皮膚白皙為止，以少量生理鹽水濕潤后，4 ℃冰箱保存，24 h內(nèi)使用。

體外透皮實(shí)驗(yàn)：采用Franz擴(kuò)散池進(jìn)行體外透皮實(shí)驗(yàn)[14]。用手術(shù)剪將已處理好的小鼠皮剪成適量大小，固定于供給室和接受池之間(注意使皮膚表層面向供給室，皮膚內(nèi)側(cè)面向接受室)，分別量取牡丹籽油、牡丹籽油納米乳，牡丹籽油納米乳凝膠適量作為待測樣，保證其中含有的牡丹籽油質(zhì)量均為0.06g，在37 ℃、600 r/min的條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，分別在0.5、1、2、4、6、8、10、12 h取2 mL接收液(同時(shí)補(bǔ)充同溫等量生理鹽水)，按照“1.6”的色譜條件測其藥物濃度，并計(jì)算累積滲透量(Q，mg/cm2)，計(jì)算公式見式(1)。

(1)

式中，ρn為不同時(shí)間點(diǎn)時(shí)接收液質(zhì)量濃度，mg/mL；ρi為不同時(shí)間點(diǎn)時(shí)取樣液質(zhì)量濃度，mg/mL；V為接受池體積，mL；Vi為取樣體積，mL；A為擴(kuò)散面積，cm2。

差示掃描量熱(DSC)掃描：12 h后，將空白及凝膠組實(shí)驗(yàn)后皮膚置于流水下沖洗 60 s，取樣，用差示掃描量熱儀進(jìn)行差式掃描分析。DSC條件：40 μL 鋁坩堝，溫度在-20～200 ℃，升溫速率為20 ℃/min。

2 結(jié)果與討論

2.1 牡丹籽油納米乳的處方篩選

按表1中三個(gè)處方所制得納米乳的粒徑分別為161.7、274.4、779.7nm，PDI分別為0.180、0.973、1.000。經(jīng)比較，處方一所制得的納米乳粒徑較小且分布均勻，因此選定處方一作為納米乳處方。

2.2 凝膠基質(zhì)的處方篩選

卡波姆-980用量的篩選結(jié)果見表2。

表2 卡波姆-980 用量的篩選結(jié)果

由表2可見，當(dāng)卡波姆-980用量為1.5 g時(shí)，涂布性較差，難以鋪展，而在0.8 g時(shí)，形成的凝膠基質(zhì)透明、均勻細(xì)膩、黏稠度適中、易涂布，且成型性較好，因此，選擇卡波姆-980 用量為0.8 g。

甘油用量的篩選結(jié)果見表3。

表3 甘油用量的篩選結(jié)果

由表3可見，隨著甘油用量的增大，凝膠黏度隨之增大，黏稠度、油膩感也顯著增強(qiáng)，外觀結(jié)團(tuán)現(xiàn)象明顯，導(dǎo)致凝膠基質(zhì)難以涂展，在甘油用量為15 g時(shí)，基質(zhì)結(jié)團(tuán)現(xiàn)象明顯，黏度大，難以涂展，而在用量為10 g時(shí)，黏稠度適中，均勻細(xì)膩，易涂展，因此，選擇甘油用量為10 g。

pH值的篩選結(jié)果見表4。

表4 pH值的篩選結(jié)果

由表4可見，當(dāng)pH=4.0～5.0時(shí)，黏度低、流動(dòng)性強(qiáng)，皮膚黏附性差；當(dāng)pH=6.0時(shí)，黏稠度適中，皮膚黏附性好；當(dāng)pH=7.0～8.0時(shí)，有明顯的結(jié)團(tuán)現(xiàn)象，較為黏稠，影響皮膚涂展性。因此，選擇調(diào)節(jié) pH=6.0。

綜上，確定牡丹籽油納米乳凝膠的處方為牡丹籽油0.3 g、聚氧乙烯氫化蓖麻油0.6 g、PEG400 0.1 g，卡波姆-980 0.8 g，甘油10 g，最終調(diào)節(jié)pH值至6.0。

2.3 牡丹籽油納米乳凝膠的質(zhì)量評價(jià)

2.3.1 制劑的外觀、黏度

本實(shí)驗(yàn)所得樣品外觀為無沉淀、具有一定黏稠度的乳白色凝膠，膏體細(xì)膩均勻，黏稠度適中，經(jīng)測定，黏度為37 010 Pa·s。

2.3.2 粒徑及電位

粒徑與Zeta電位結(jié)果分別見圖1、圖2。

粒徑/nm圖1 牡丹籽油納米乳凝膠的粒徑分布圖

由圖1、圖2可知，牡丹籽油納米乳的平均粒徑約為160.0 nm，PDI為0.173，Zeta電位為-20.1 mV，說明納米乳粒徑分布均勻，物理穩(wěn)定性強(qiáng)。

2.3.3 物理穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

分別取牡丹油納米乳、納米乳凝膠各三份，分別放置24 h、48 h、72 h后，3 000 r/min離心10 min，觀察納米乳及納米乳凝膠是否出現(xiàn)分層、沉淀或渾濁。結(jié)果表明，納米乳及納米乳凝膠在離心期間未發(fā)生分層和沉淀現(xiàn)象，具有良好的穩(wěn)定性。

2.3.4 涂布性實(shí)驗(yàn)

取所制得牡丹籽油及牡丹籽油納米乳凝膠適量，分別涂布于雙硅紙(具有類似于皮膚的疏水性)上進(jìn)行觀察[15]。結(jié)果表明，涂布牡丹籽油之后，油滴很快出現(xiàn)聚集，不易涂布均勻，而牡丹籽油納米乳凝膠涂布后，無油滴聚集現(xiàn)象，說明將牡丹籽油納米乳凝膠劑涂布性好，減少了刺激性和油膩感。

2.4 含量測定方法學(xué)考察

按1.6的色譜條件進(jìn)樣，得到對照品溶液、樣品溶液、不含亞油酸的陰性溶液的色譜圖見圖3。

t/mina 亞油酸標(biāo)準(zhǔn)品

t/minb 樣品溶液

t/minc 陰性溶液圖3 各溶液色譜圖

由圖3可知，指標(biāo)成分亞油酸的亞油酸標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間為5.79 min(圖3a)，樣品溶液在5.65 min處出現(xiàn)了亞油酸的色譜峰(圖3b)，不含亞油酸的陰性溶液在相應(yīng)位置無色譜峰的出現(xiàn)(圖3c)，表明輔料對亞油酸的測定無干擾，本方法專屬性好。

按標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方法，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為A=4 439.3ρ+5.25，R=0.999 7，表明在質(zhì)量濃度為0.01～0.07 mg/mL線性關(guān)系良好。經(jīng)精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性考察，計(jì)算得RSD值分別為0.53%、0.49%、1.22%，加樣回收率在90%～110%，表明精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、加樣回收率均良好。

2.5 體外透皮特性考察

按照1.7的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行體外透皮特性考察，計(jì)算各組的皮膚累積滲透量，結(jié)果見圖4。

t/h圖4 體外透皮實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由圖4可知，三個(gè)實(shí)驗(yàn)組中，亞油酸的累積滲透量均隨著時(shí)間的增加而增加，12 h時(shí)累積滲透量由高到低依次為納米乳凝膠>納米乳>牡丹籽油，并且納米乳凝膠與牡丹籽油相比，累積滲透量具有顯著性差異(p<0.05)，而納米乳與牡丹籽油相比不具有顯著性差異(p>0.05)，說明納米乳凝膠具有更好的透皮性能，12 h時(shí)亞油酸的累積滲透量為0.05 mg/cm2。

將空白及凝膠組實(shí)驗(yàn)后皮膚置于流水下沖洗 60 s，取樣，用差示掃描量熱儀進(jìn)行差式掃描分析，結(jié)果見圖5。

t/℃圖5 DSC曲線

由圖5可知，空白皮膚的熔融峰出現(xiàn)在約140 ℃，而涂抹有納米乳凝膠的皮膚與空白皮膚相比，吸收熱量速率更快，在126 ℃處出現(xiàn)熔融峰，說明凝膠乳對皮膚的結(jié)構(gòu)有影響，這可能與皮膚角質(zhì)層的致密結(jié)構(gòu)被打開有關(guān)，證實(shí)了納米乳凝膠增強(qiáng)牡丹籽油透皮吸收的性能。

3 結(jié) 論

(1) 用聚氧乙烯氫化蓖麻油作為乳化劑，經(jīng)高速剪切乳勻法制備牡丹籽油納米乳，制得的納米乳細(xì)微、均勻，以卡波姆作凝膠基質(zhì)，制得的凝膠細(xì)膩、均勻，穩(wěn)定性好，質(zhì)地清爽，易于涂抹；

(2) 用Franz擴(kuò)散池進(jìn)行透皮吸收實(shí)驗(yàn)，能夠較好地模擬透皮制劑的藥物釋放過程。由透皮結(jié)果可以看出，牡丹籽油納米乳凝膠透皮速率顯著大于牡丹籽油及其納米乳，說明凝膠基質(zhì)的加入可能影響了皮膚的結(jié)構(gòu)，使角質(zhì)層細(xì)胞間隙增大，增強(qiáng)了牡丹籽油的透皮吸收。

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