趙婷婷，盧思思，趙 麗,姚秋虹,陳 曦*

(1.廈門華廈學院，福建 廈門 361024；2.廈門大學 化學化工學院 化學系，譜學分析與儀器教育部重點實驗室，福建 廈門 361005)

綜 述

比率式熒光納米氧傳感器

趙婷婷1，盧思思2，趙 麗1,姚秋虹1,陳 曦2*

(1.廈門華廈學院，福建 廈門 361024；2.廈門大學 化學化工學院 化學系，譜學分析與儀器教育部重點實驗室，福建 廈門 361005)

比率式熒光傳感通過在同一傳感基質(zhì)中摻雜兩種或兩種以上對分析物具有不同響應的發(fā)光體，根據(jù)不同的光發(fā)射信號比值構建起來的光化學傳感體系，能更好滿足實際檢測的需要。近年來，比率式熒光納米傳感器的構建已引起了人們的廣泛關注。該文介紹了比率式熒光納米氧傳感器的制備方法、傳感特性和應用情況，并對其傳感檢測的發(fā)展和應用前景進行了分析和展望。

氧；納米傳感；比率熒光；制備方法；應用；綜述

氧是支持地球生命的重要物質(zhì)，無色無味，其含量的檢測在海洋、氣象、生物、化學、深空探索、環(huán)境和生命科學，工業(yè)生產(chǎn)、水產(chǎn)養(yǎng)殖以及食品包裝和儲藏、礦井安全等諸多領域有著非常重要的意義和價值。如氧作為支持生物體活動的必需物質(zhì)之一，是生物呼吸作用的第一保證，通過對體內(nèi)氧濃度的監(jiān)測，可以有效地對組織病變進行診斷和示蹤病變組織的轉(zhuǎn)移；在食品行業(yè)，特別是啤酒、飲料和乳制品的制造過程與封裝中，含氧量與酵母的發(fā)酵和產(chǎn)品的保質(zhì)息息相關。含氧量的高低，嚴重影響著產(chǎn)品質(zhì)量和保質(zhì)期；氧還是工業(yè)生產(chǎn)過程中的重要成分和控制參數(shù)，如火力發(fā)電廠必須對鍋爐給水系統(tǒng)、凝結(jié)水系統(tǒng)、回水系統(tǒng)和熱網(wǎng)水系統(tǒng)等中溶解氧含量進行監(jiān)測，是安全生產(chǎn)的重要保證。

圖1 氧對熒光試劑猝滅過程的雅布隆斯基圖[1]Fig.1 Jablonski diagram for the fluorescence quenching process between oxygen and fluorescence reagent[1]E:energy,A:absorption,F：fluorescence,P：phosphorescence,IC：internal conversion,ISC：intersystemcrossing,VR：vibrational relaxation,S：singlet state,T：triplet state

與大多數(shù)的分子不同，氧單質(zhì)基態(tài)下呈現(xiàn)電子自旋三重態(tài)，氧分子是常見的熒光和磷光猝滅劑，一般具有長熒光壽命的熒光探針對氧的響應比較靈敏，如芘及其衍生物和一些金屬有機配合物(如釕、銥、鉑貴金屬配合物)等。受激發(fā)的熒光探針的電子通過躍遷和系間竄越過程到達第一激發(fā)三重態(tài)，與單質(zhì)氧進行三重態(tài)-三重態(tài)的相互作用，此時基態(tài)氧被激發(fā)為單重態(tài)的氧，而探針的大部分能量以非輻射形式損耗，進而熒光被猝滅，所以可以通過氧敏感探針的熒光猝滅程度進行氧含量的測定。其猝滅過程可由雅布隆斯基圖[1](圖1)表示。

在均相介質(zhì)中，熒光強度與熒光壽命與氧的定量關系一般使用Stern-Volmer方程描述[2]：

I0/I=τ0/τ=1+Ksv[Q]

(1)

式中，I0和τ0分別表示無氧環(huán)境下的熒光強度和熒光壽命，I和τ為不同氧濃度下的熒光強度和熒光壽命，Ksv為Stern-Volmer猝滅常數(shù)，[Q]是猝滅劑氧的濃度。而當氧敏感探針被固定到相容性不好的基質(zhì)中時，探針所處的微觀環(huán)境則是非均相的。在不同的環(huán)境下，氧對熒光探針的猝滅效率Ksv也不同。此時，氧對熒光探針的猝滅行為偏離了常規(guī)的Stern-Volmer線性方程。在微觀非均相介質(zhì)中，熒光探針與氧之間的關系應該是各探針猝滅行為的整合，所以需使用多態(tài)模型方程來描述：

(2)

式中，fi表示處于第i種環(huán)境下的熒光指示劑分子占總指示劑分子的百分數(shù)，Ksv,i為第i種環(huán)境下指示劑的猝滅常數(shù)，m指微觀環(huán)境的總數(shù)。

事實上，氧分子的熒光猝滅過程十分復雜。激光閃光光譜技術證明氧單質(zhì)對熒光探針的猝滅行為主要是動態(tài)猝滅的過程，所以探針的熒光強度和熒光壽命通常隨氧濃度的升高而降低[3]。基于熒光強度變化的氧濃度檢測方法較簡單，器件易于集成小型化，但檢測的強度信號易受光源穩(wěn)定性、檢測器靈敏度、光路系統(tǒng)、探針的光穩(wěn)定性和濃度分布等影響。為校正這些干擾，一些研究對簡單熒光強度測定方法進行了一定改進，如采用雙光束法降低光源和光路波動造成的影響[4]，基于熒光壽命的檢測方法具有不受激發(fā)光強度、檢測器靈敏度、探針濃度和探針光學穩(wěn)定性等因素干擾的優(yōu)點。但熒光壽命的檢測需要依靠復雜且昂貴的設備儀器，這很大程度上限制了其在實際檢測中的應用。利用雙發(fā)射熒光探針或通過參比探針作為背景構建比率式熒光強度法，可對探針的濃度進行校正，并且可以有效地消除系統(tǒng)誤差[5]。本文將對目前已有的比率式溶氧傳感檢測的發(fā)展現(xiàn)狀(制備方法、傳感特性和應用情況)進行綜述。

1 比率式熒光納米氧傳感器的構建及其分類

光學氧傳感器一般由氧敏感探針和探針固定材料構成。所以制備和研發(fā)對氧響應靈敏、精確度高、穩(wěn)定性好的氧敏感探針，以及構建對氧通透性好、透光率高和光學性質(zhì)佳的固定化材料是光學氧傳感器發(fā)展的關鍵。通常單波長的熒光強度檢測模式易受環(huán)境和儀器本身的影響，所以基于雙發(fā)射的比率熒光強度檢測法，可以有效彌補單波長熒光檢測的不足，從而成為當前氧傳感器的研究熱點[1]。比率式光學氧傳感器的一般構造是在同一傳感基質(zhì)中固定對氧具有不同響應，而且發(fā)射光分屬于不同波段的兩種或兩種以上熒光發(fā)光體。通過兩種發(fā)射光的比值變化與氧濃度作Stern-Volmer曲線，進而得到實際檢測中氧的濃度。更重要的是，比率式熒光氧傳感在不同的氧濃度下呈現(xiàn)的顏色變化更加明顯，從而為可視化準確測定氧濃度提供了有效的手段。

通常固定氧敏感探針方法主要有化學鍵聯(lián)法和物理摻雜法兩種。通過化學鍵聯(lián)法制備的氧傳感器較穩(wěn)定，但是化學鍵聯(lián)的過程繁瑣，耗時耗力，重現(xiàn)性較差；最主要的是，單質(zhì)氧的熒光猝滅行為是一個動態(tài)猝滅的過程，當氧敏感分子通過化學鍵聯(lián)法固定到固定材料中時，探針分子的自由振動和自由轉(zhuǎn)動受到限制，與氧的動態(tài)碰撞效率減低，大大地影響了其對氧的響應性能。相對于化學鍵聯(lián)法，物理摻雜法具有制備方法簡單，易于重現(xiàn)，對氧響應靈敏等優(yōu)點，但是探針泄露是物理摻雜法普遍存在的問題。所以發(fā)展對探針分子兼容性好，光學性質(zhì)穩(wěn)定且易于成型的固定材料是解決此問題的努力方向。在廣大科研工作者的努力下，也取得了一定的進展。Chen等[6]通過對溶膠-凝膠法進行有機化改性，固定對氧無響應的綠色熒光量子點為參比背景，以發(fā)紅光的PtTFPP為氧敏感探針，構建了一種基于雙原色復合光的比色氧傳感膜。該傳感膜的穩(wěn)定性好，對氧完全可逆，可用于氧濃度的快速檢測且檢測精度達到0.5%。在此比色氧傳感膜上再固定一層葡萄糖氧化酶，通過二次傳感可實現(xiàn)對葡萄糖的可逆比色光學檢測(如圖2)[7]。

圖2 35 ℃下，制備的葡萄糖傳感膜在含不同濃度的葡萄糖緩沖液中呈現(xiàn)的顏色(上)，以及比色葡萄糖傳感器的構造示意圖(下)[7]Fig.2 Apparent colors of the prepared sensor in different concentrations of glucose buffer solution at 35 ℃(up),and schematic diagram of the colorimetric glucose sensor(down)[7]

目前，比率式氧光學傳感的方式主要有3種[8]，分別為平板式、光纖式、納米或微米粒子式(如圖3所示)。其中平板式氧傳感器[9]一般由透光基底(如石英或玻璃)、固定材料和氧敏感探針構成，該傳感器制備簡單且易于儀器化，對海水中氧濃度的檢測有著諸多應用。光纖式氧傳感器[10]一般是將氧敏感探針固定在光纖外壁上，多應用于環(huán)境中溶解氧的檢測，特別是對于長距離的實時監(jiān)測，光纖式傳感有著明顯的優(yōu)勢。而納米或微米粒子式氧傳感器也顯現(xiàn)諸多的優(yōu)點，如粒子式的氧傳感器具有較大的比表面積，對氧通透性好，響應靈敏迅速。傳感顆粒納米化后可有效地減少氧敏感探針的自猝滅現(xiàn)象，實現(xiàn)對探針的高濃度固定，大大地提高了氧傳感器的熒光發(fā)射強度，更有利于氧濃度的可視化檢測。重要的是，納米式的氧傳感可以應用到微米或納米尺寸的生物體系中，如細胞、組織和微生物生長環(huán)境等，可以通過直接的熒光成像，對生物體生長狀態(tài)進行監(jiān)測[11]。所以比率式納米氧傳感器的研制引起了研究者的高度重視。

圖3 比率式氧光學傳感模式Fig.3 Ratiometric fluorescence sensing models A.typical planar layer[9]；B.optical fiber [10]；C.nano or micro particles of luminescent oxygen sensor[11]

1.1 利用有機熒光小分子的比率式氧傳感

基于有機小分子的比率式熒光氧敏感探針的構筑一般是通過橋聯(lián)分子，將對氧敏感的發(fā)光分子和對氧無響應的參比分子連接起來，制備得到比率式分子探針。該方法可以使用單一激發(fā)光同時激發(fā)兩個發(fā)光團或者通過共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)效應達到熒光雙發(fā)射的效果，從而實現(xiàn)對氧的比率熒光檢測。

圖4 比率型氧敏感探針I(yè)r-PVP-RhB的化學結(jié)構(A)，以及不同培養(yǎng)時間下被Ir-PVP-RhB染色后SH-SY5Y細胞群落的共聚焦顯微鏡圖(B)[12]Fig.4 Chemical structure of Ir-PVP-RhB(A)，and confocal luminescence images of SH-SY5Y MCs after incubation with Ir-PVP-RhB(0.2 mg/mL) for different times(B)[12]

2015年，南京大學蔣錫群教授課題組[12]首次合成了對缺氧腫瘤微環(huán)境具有高度特異性的近紅外光學成像探針。探針分子結(jié)構如圖4A所示，對氧敏感的磷光銥配合物與親水的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)鍵連，然后再連接發(fā)綠光的參比指示劑羅丹明B(RhB)，構建了單一波長激發(fā)而雙發(fā)射的氧敏感探針分子(Ir-PVP-RhB)。Ir-PVP-RhB具有近紅外光發(fā)射，高度缺氧敏感性，良好的水溶性和生物相容性等優(yōu)點。利用該傳感探針，他們使用無損光學成像的手段，實現(xiàn)了對細胞及細胞群落的成像。圖4B顯示了SH-SY5Y細胞群落與Ir-PVP-RhB在不同培養(yǎng)時間下的熒光成像。由圖可見，隨著培養(yǎng)時間的增長，Ir-PVP-RhB逐漸擴散到細胞群落的中間，所發(fā)出的紅光越來越明顯，而綠光變化不大。實驗結(jié)果進一步證實細胞群落內(nèi)部的氧濃度較周圍的低。

Tobita等[13]利用發(fā)紅光的銥配合物[(btp)2Ir(acac),BTP]為氧敏感發(fā)光團，以發(fā)藍光的香豆素染料(Coumarin 343，C343)為參比信號發(fā)光團，中間通過剛性的四脯氨酸(PrO4)為橋梁分子，將兩發(fā)光團鏈接且保持合適的距離。構建的比率式分子探針(C343-PrO4-BTP，結(jié)構式見圖5A)能夠有效地通過FRET過程，將C343激發(fā)態(tài)的能量高效地傳遞給BTP，實現(xiàn)對氧濃度的高靈敏比率檢測。實驗表明，處于激發(fā)單線態(tài)的C343對基態(tài)的BTP的能量轉(zhuǎn)移效率最高可達98%。作者將此探針應用于Hela細胞中氧濃度的檢測，從圖5B可以看到，在氧濃度較低時，BTP發(fā)出明亮的紅光，而在氧濃度較高時，大部分紅光被猝滅。參比的藍光信號在不同的氧濃度下變化不大。

雙光子吸收(Two-photon absorption,2PA)的熒光探針具有細胞穿透性好、激發(fā)光利用率高等優(yōu)點，在生物體的檢測中有著巨大的應用前景。近些年，基于雙光子天線的氧敏感探針的構建也引起了研究人員的廣泛關注。2005年，Vinogradov等[14]在功能化的卟啉鉑(PtTMCPP)氧探針周圍修飾上雙光子吸收的天線分子香豆素343(C343)，制備了對氧有比率響應的樹狀分子PtTMCPP-C343。在780 nm的近紅外光激發(fā)下，C343通過分子內(nèi)能量轉(zhuǎn)移(ET)將能量轉(zhuǎn)移給PtTMCPP，間接實現(xiàn)對PtTMCPP的近紅外激發(fā)，以及對氧的比率檢測。隨后，他們利用PtTMCPP-C343探針分子，在雙光子熒光壽命顯微鏡上實現(xiàn)了對小鼠大腦中毛細血管中血流的氧分布成像。探針的成像效果較一般的單光子成像高，并且可檢測到的最大組織深度達300 μm[15]。2014年，該小組[16]對PtTMCPP-C343進行改進，制備得到磷光量子產(chǎn)率更高且靈敏度更好的雙光子天線的氧氣探針PtTCHP-C307，在同一效率的激發(fā)光下，PtTCHP-C307的亮度是PtTMCPP-C343的6倍，可直接用于活鼠骨髓造血干細胞內(nèi)氧氣壓強的檢測。

圖5 C343-PrO4-BTP的化學結(jié)構式(A)，以及染色后Hela細胞在氧濃度為20%和2.5%下的熒光成像圖(B)[13]Fig.5 Structures of the ratiometric probe C343-PrO4-BTP(A) and luminescence images of HeLa cells incubated under 20% and 2.5% O2 conditions(B)[13]

圖6 熒光探針dppe-Pt2P(A)及環(huán)金屬化的C^N Pt(Ⅱ)配合物Pt-1,Pt-2(B)的結(jié)構式[17，19]Fig.6 Structures of the fluorescent dye dppe-Pt2P(A) and fluorescence/phosphorescencedual emissive C^N Pt(Ⅱ)(acac) complexes Pt-1 and Pt-2(B) [17，19]

近些年，研究者還成功地研發(fā)了只包含單一發(fā)光體的比率式氧敏感探針分子，這種類型的分子比較少見。1998年，Pilato等[17]首次合成了具有雙波長發(fā)射性質(zhì)且對氧敏感的化合物dppe-Pt2P(分子結(jié)構式如圖6A所示)。由于存在配體內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移(ILCT*),dppe-Pt2P單重態(tài)的熒光壽命為0.5 ns，受激發(fā)后的三重態(tài)則達到15 μs。隨后該小組以dppe-Pt2P為氧敏感探針，采用塑膠為固定材料，構建了只需單一濾波片的比率式氧傳感器[18]。Zhao等[19]制備了兩種環(huán)金屬化的C^N Pt(Ⅱ)配合物(Pt-1,Pt-2)，其結(jié)構式見圖6B。該配合物室溫下具有穩(wěn)定的熒光/磷光雙發(fā)射光譜，可應用于比率熒光強度和比率熒光壽命雙模式的氧濃度檢測。

上述的探針分子均建立在以貴金屬配合物(如Ir或Pt配合物)為氧敏感發(fā)光體的基礎上?；诜琴F金屬元素構筑的比率式氧敏感探針分子也是研究者努力的方向。Hochreiner等[20]利用Ferron鐵試劑(8-Hydroxy-7-iodo-5-quinolinesulphonic acid)與鋁的螯合作用，制備了一種對氧敏感的金屬螯合物Al-Ferron。Al-Ferron具有單一波長激發(fā)而雙波長發(fā)射的特性且可用于水中溶解氧的檢測。2012年，Cheng課題組[21]合成了以吲哚衍生物為配體的中性亞銅配位化合物。這種亞銅配位化合物固定于剛性的基質(zhì)(如聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)或固態(tài)的CH2Cl2)中時，由于金屬-配體間的電荷轉(zhuǎn)移和配體間電荷轉(zhuǎn)移效應，表現(xiàn)出雙發(fā)射現(xiàn)象，當氧濃度增加時，411 nm波長處的熒光發(fā)射強度增大，而610 nm的熒光發(fā)射不斷降低，所以該探針分子對氧檢測的靈敏度和分辨率較一般分子的高。Fraser等[22]發(fā)展了一種基于碘代二氟硼化物(BF2dnm(Ⅰ)PLA)的氧敏感探針分子。這種硼化合物可以同時發(fā)出橘紅色和綠色的光，橘色光隨著氧濃度的增加被不斷猝滅，而綠色發(fā)射光則基本不受氧濃度變化的影響。將其制備成為納米粒子后，可穿透小鼠胸腺細胞，實現(xiàn)細胞內(nèi)的比率氧成像。

1.2 利用聚合物的比率式納米氧傳感

小分子氧傳感探針具有分子量小、易于控制等優(yōu)點,為生物學和環(huán)境學中氧氣的檢測提供了有效途徑。但由于大多數(shù)有機分子的水溶性較差,需要經(jīng)過繁瑣的化學修飾才能改善其水溶性，而且有機分子在體內(nèi)成像時存在較大的非特異吸附作用，抗光漂白能力差，不利于組織細胞中的檢測應用。有機聚合物具有延展性好、易于制備成型、種類多、光化學性質(zhì)穩(wěn)定等特點，在氧傳感探針的研制中起著非常重要的作用。氧敏感探針分子固定到聚合物后，可以有效地提高探針的水溶性和光穩(wěn)定性，避免染料的高濃度聚集，減少探針分子的自猝滅現(xiàn)象，增強探針的發(fā)光強度等。

聚苯乙烯(PS)具有光學穩(wěn)定性好、疏水性強、價格低廉等優(yōu)點，是納米氧傳感制備中最常見的聚合物固定材料。2011年，Sch?ferling課題組[23]將卟啉鈀配合物(PdTPTBP)和花青素(DY-635)通過溶脹過程吸附到氨基修飾的聚苯乙烯納米球(PS-NPs)上。制備的納米球可被635 nm的激光有效地激發(fā)，發(fā)出明顯的近紅外光和綠光。為提高PS-NPs的生物相容性，在其表面修飾一層生物分子聚乙二醇(PEG)，實現(xiàn)活體內(nèi)腫瘤組織的成像。同年，王旭東等[24]通過溶脹法，將氧敏感分子卟啉鉑(PtTF20PP)和參比分子萘二甲酰亞胺的衍生物吸附到商品化的PS-NPs上，構筑了具有自參比功能的納米粒子(RGB PEBBLE)，并對細胞內(nèi)的氧濃度分布進行了成像。但是，這種有機物之間的疏水吸附作用力較弱，染料容易脫落，導致制備的納米氧敏感探針的穩(wěn)定性不理想，限制了其發(fā)展。分散聚合法是制備氧敏感PS-NPs的另一種常見方法。Cywinski等[25]通過微乳液聚合法制備了粒徑為20 nm的單分散的氧敏感PS-NP，實驗以 PtTFPP為氧敏感分子，二萘嵌苯為參比分子。在聚合過程中，疏水的探針分子自動嵌入到PS-NPs內(nèi)部。制備的PS-NPs對氧響應迅速且靈敏，可用于細胞培養(yǎng)基中氧濃度的檢測。2011年，本課題組[26]制備了同時摻雜發(fā)紅光的PtOEP和發(fā)藍光的熒光增白劑(BBS)染料的微米PS球。兩種熒光分子均在紫外區(qū)激發(fā)，發(fā)射光在可見區(qū)。將其高濃度地固定到布簽上，構筑了一種新型的比色氧傳感布簽，可對氧濃度進行大面積的二維成像。但是，PS-NPs對生物體的副作用和作用機制至今還不清晰，有報道稱，粒徑為45～70 nm PS-NPs只有在高濃度下才會產(chǎn)生毒性，而帶正電的PS-NPs會直接導致細胞的自吞死亡[27-28]。所以，發(fā)展其他有效的聚合物固定材料是非常有必要的。

2004年，Kopelman小組[29]發(fā)展了一種基于聚甲基丙烯酸酯(PDMS)的比率式納米氧傳感。實驗中選用對氧響應非常靈敏的PtOEPK為氧敏感分子，以發(fā)紅光的卟啉衍生物(OEP)為參比指示劑，通過疏水作用，摻雜到粒徑為150～250 nm PDMS納米粒子中。構建的PDMS納米粒子在氧氣中的猝滅效率達到97.5%，線性范圍為0～45.2 ppm。由于PDMS具有良好的生物相容性，所以可利用制備的納米粒子檢測生物樣品中氧濃度。后來，該小組通過微乳液法[30]，將發(fā)近紅外光的樹狀氧探針PdTPTBP和參比染料分子Alexa 647或HiLyte 680一起載入到聚丙烯酰胺水凝膠(PAA)納米粒子中。在構建的PAA粒子表面修飾上細胞膜滲透多肽(TAT)和腫瘤特異識別多肽(F3)后，可有效地應用到細胞或者活體內(nèi)氧濃度的檢測中。但是，PAA粒子的合成單體丙烯酰胺(AA)是一種毒性大的神經(jīng)毒素，所以該方法不適合推廣到實際應用中。

兩親共聚物F127是一種商品化且具有良好生物相容性的三段嵌表面活性劑[14]。中間段由疏水的聚環(huán)氧丙烷(PPO)組成，兩端是親水的聚環(huán)氧乙烷(PEO)。與大多數(shù)的兩親活性劑類似，F(xiàn)127有穩(wěn)定分散到溶液中的聚合物的作用。最近，本課題組使用兩親共聚物F127為軟模板，制備了具有多孔結(jié)構的比率式氧敏感聚苯乙烯納米球[31]。實驗選用對氧不敏感的藍光聚芴型聚合物PFO作為穩(wěn)定的參比染料，以光學穩(wěn)定的5,10,15,20-4-(5-氟基)卟啉鉑(PtTFPP)為氧敏感探針。通過對這兩種熒光體的摻雜比例進行調(diào)控，可使制備得到的氧傳感粒子在無氧氛圍中顯紅色，而在空氣中呈現(xiàn)藍色。隨著氧濃度的增加，PtTFPP發(fā)出的紅光不斷被猝滅，而PFO的藍光基本不變。通過這兩種熒光探針熒光強度的比值對氧濃度做Stern-Volmer曲線，發(fā)現(xiàn)其在溶氧濃度為0～375 μmol/L范圍內(nèi)表現(xiàn)出良好的線性，且猝滅效率達到96%。

近幾年，π-共軛聚合物也被成功地引用到氧納米傳感的制備體系中。2009年，McNeill等[32]首次利用聚芴型π-共軛聚合物PDHF或PFO包埋氧敏感染料PtOEP，發(fā)展了基于能量傳遞的納米顆粒氧氣探針。在此，共軛聚合不僅作為氧探針的包埋材料，而且還是參比信號的指示劑。構造的納米粒子亮度高，可進行單粒子的熒光成像。2012年，Papkovsky等[33]以帶正電的丙烯酸樹脂RL-100為包埋材料，同時包裹染料PtTFPP和PFO，制備了毒性低、亮度高且生物相容性好的陽離子水凝膠納米粒子，可應用于神經(jīng)元細胞的2D和3D熒光強度和熒光壽命雙模式成像。Huang等[34]通過化學鍵聯(lián)法，將氧敏感的Ir配合物連接到聚芴聚合物的骨架上(WPF-Ir)，再通過共沉淀作用，制備得到粒徑小(6±2 nm)、耐光漂白能力好、水中分散性好的氧傳感粒子。實驗還以制備納米粒子為光敏劑，考察了三線態(tài)-三線態(tài)猝滅過程中產(chǎn)生的單線態(tài)氧對Hela細胞的光動力治療(PDT)效果，發(fā)現(xiàn)WPF-Ir可以加速癌細胞的凋零。隨后，該課題組利用類似的方法，在聚芴型聚合物上鍵聯(lián)卟啉鉑氧敏感分子，構建了另一種比率納米氧敏感粒子(FP-Pdots)[35]。

本研究小組發(fā)展了一種新型的比率型納米氧傳感，通過溫和的共沉淀作用，將氧敏感探針5,10,15,20-4-(5-氟基)卟啉鉑(Platinum(Ⅱ)-tetrakis(pentafluorophenyl) porphyrin,PtTFPP)和π-共聚物(Poly[(9,9-dioctyl-fluorenyl-2,7-diyl)-co-(1,4-phenylene)],PFO)包埋到疏水的聚苯乙烯(Polystyrene,PS)基質(zhì)中[36]。兩親共聚物聚苯乙烯-co-順丁烯酸酐(Poly(styrene-co-maleic anhydride,PSMA)是制備聚合物納米粒子(如聚合物點和金屬量子點)中常見的保護劑，而且PSMA中的酸酐可以水解成羧基，為納米粒子的進一步修飾提供了有利條件。在該研究工作中，將PSMA引入納米氧傳感的制備體系中，在含有定量多聚賴氨酸(Poly-L-lysine,PLL)的堿性水溶液中,PSMA將疏水聚合物包裹成粒徑小的疏水內(nèi)核，同時，PSMA中的酸酐自發(fā)水解成帶負電的羧基離子(-COO-)，使得制備的納米粒子表面布滿負電荷。生物大分子PLL則可通過帶正電的氨基與-COO-的靜電吸附作用，包覆到疏水內(nèi)核表面，形成具有良好生物相容性的核-殼結(jié)構的納米氧傳感粒子(簡稱PPMA/PLL NPs)。內(nèi)核PPMA表面的負電荷被中和，制備的氧敏感粒子最終呈現(xiàn)正電性。殼層PLL的修飾，對于納米傳感在細胞成像的應用有著重要意義。一方面，由于細胞膜略微顯電負性，通過非特異的電位差作用，帶正電的納米傳感更易于被細胞膜吸附內(nèi)吞，可提高粒子在細胞內(nèi)的負載量。此外，如果制備的納米粒子通過細胞內(nèi)吞途徑穿透細胞膜進入細胞后被束縛在溶酶體中，PLL上未帶電的氨基可協(xié)助粒子逃逸出溶酶體，分布到細胞質(zhì)中，使得傳感粒子對細胞的氧濃度分布成像更加可靠。實驗數(shù)據(jù)表明，制備得到的比率型納米氧傳感具備粒徑小(～40 nm)，水中分散性好，熒光強，對氧的比率響應理想和細胞負載量高等特點，可應用在細胞質(zhì)氧濃度分布成像中。

1.3 利用二氧化硅的比率式納米氧傳感

2001年，Kopelman課題組[37]首次通過改進的Stober方法，以聚乙烯醇為穩(wěn)定劑，四乙氧基硅烷(TEOS)為前驅(qū)體，制備了摻雜氧敏感探針鄰菲羅啉釕([Ru(dpp)3]Cl2)和參比染料俄勒岡州綠(Oregon green 488)的二氧化硅納米氧傳感(PEBBLE)。通過顯微注射法，將PEBBLE粒子導入小鼠膠質(zhì)瘤細胞，達到測定細胞內(nèi)氧濃度效果。隨后，為了提高納米粒子對氧的靈敏度，他們采用有機改性的烷苯基三甲氧基硅烷和甲基三甲氧基硅烷為前驅(qū)體[38]，包埋對氧更加靈敏的卟啉鉑探針(PtOEP或PtOEPK)和對氧不靈敏的染料3,3’-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate(DiO)。制備的PEBBLE粒子對氧響應很靈敏，猝滅比達97%，并在氧濃度為0～43 ppm范圍內(nèi)表現(xiàn)出良好的線性關系。由于二氧化硅帶有大量羥基，易于進行表面修飾，所以制備的粒子的疏水性、帶電性、粒徑大小和孔洞大小等可以有效地進行調(diào)節(jié)，并且可通過化學鍵聯(lián)方式將探針固定于表面或內(nèi)部。McShane等[39]在粒徑為10 μm的二氧化硅表面鍵聯(lián)上氧敏感探針PtTCPP和發(fā)近紅外光的量子點QD，構建了具有高穩(wěn)定性的氧敏感粒子。Leach等[40]通過溶脹法，將[Ru(dpp)3]Cl2和參比指示劑尼羅紅吸附到二氧化硅粒子上，為了防止探針的泄露，在二氧化硅粒子表面修飾了一層聚二甲基硅氧烷(PDMS)。制備的粒子可以分散到生物培養(yǎng)基中對培養(yǎng)液中的氧進行比率檢測。2012年，Peng等[41]構建了一種具有良好生物相容性的比率納米氧傳感。實驗以十二烷基三甲氧基硅烷(DTS)和PS為基質(zhì),PtOEP為氧敏感分子，Coumarin 6和Dinaphthoylmethane(DNM)為參比指示劑。通過簡單的共沉淀過程，將3種疏水染料固定到粒子內(nèi)部。硅氧烷在堿性溶液中失去質(zhì)子，使得粒子表面呈現(xiàn)電負性。通過靜電吸附，在表面包裹上一層生物大分子聚賴氨酸(PLL)以提高粒子的生物相容性。制備的粒子具有FRET效應且可有效地進行細胞成像。但是制備粒子的粒徑較大(130 nm)，細胞成像時會對細胞產(chǎn)生一定的壓力。

1.4 利用金屬半導體量子點的比率式納米氧傳感

圖7 構建的R-UiO納米材料的結(jié)構示意圖(左)；粒子染色后的CT26細胞在不同氧濃度下的比率熒光顯微成像圖(右，激發(fā)光為514 nm)[49]Fig.7 Schematic structures of the R-UiO(left);and the ratiometric luminescence imaging(λex=514 nm) of CT26 cells after incubation with R-UiO-2 under different concentration of oxygen(right)[49]

1.5 利用金屬-有機框架化合物的比率式納米氧傳感

金屬-有機框架化合物(MOF)具有納米多孔結(jié)構，在氧氣檢測中表現(xiàn)出很大的優(yōu)勢。2012年，F(xiàn)aulkner等[48]合成了一種對氧有比率熒光響應的雙金屬鑭系化合物。通過Ugi法，稀土金屬離子鋱和銪被固定到穩(wěn)定的有機骨架中，構成具有雙發(fā)光中心的化合物，其中鋱中心發(fā)出的綠光隨氧濃度增加而降低，而銪中心發(fā)出的紅光不受氧濃度影響。但是，通常制備得到的MOF框架化合物的粒徑較大且水溶性差，難以應用到生物樣品檢測。2015年，林文斌教授課題組[49]首次將MOF材料應用于細胞內(nèi)比率氧濃度的檢測，他們合成了羧基修飾的且與有機框架匹配的卟啉鉑氧敏感探針(H2DPB-Pt)，通過溶劑熱法，H2DPB-Pt可以有效地與鉿離子配位進而嵌入到納米尺寸的MOF骨架中。為了實現(xiàn)對氧的比率檢測，還在MOF配體上鍵聯(lián)參比染料羅丹B，制備得到的納米MOF材料(R-UiO)的結(jié)構示意圖如圖7所示。R-UiO具有很好的結(jié)晶度，呈現(xiàn)了規(guī)整的晶型結(jié)構。此外，R-UiO還可以透過細胞膜，對細胞體內(nèi)氧濃度進行有效的成像，擴展了納米MOF材料在生物傳感中的應用。

2 比率式熒光氧傳感的發(fā)展展望

比率式熒光納米傳感通過增加一個固定的背景光，可以有效地消除探針濃度分布不均勻和儀器不穩(wěn)定造成的干擾，在生物檢測中更加可靠。此外，利用二原色光復合的原理，比率式熒光納米傳感可將待測物濃度的變化轉(zhuǎn)化為肉眼可識別的光信號，從而實現(xiàn)快速且精確的比色檢測目的。

近年來，熒光納米氧傳感器的研制已取得長足的進步，但靈敏度低，光學穩(wěn)定性不好，制備方法不夠環(huán)保，生物穿透性弱等仍是這類傳感器不可忽視的問題。針對這些問題，為了降低生物發(fā)光的背景干擾和提高成像效果，發(fā)展具備近紅外激發(fā)和發(fā)射光譜性質(zhì)的納米傳感器是研究者努力的主要方向之一，這種趨勢會是近十年光學傳感器的研究熱點。此外，具備長熒光壽命的熒光納米傳感器的制備是光學傳感器另一主要發(fā)展方向。因為長熒光壽命的傳感器為使用時間分辨熒光測定目標分析物提供了非常有利的條件，時間分辨熒光測定法可以有效地避免周圍環(huán)境光的干擾，如生物背景、雜質(zhì)熒光等，在生物樣品的研究中有著很大優(yōu)勢。相信隨著納米技術的發(fā)展和光學作用機理的不斷完善，比率式納米熒光傳感器的應用領域?qū)粩啾粩U大，并最終走進人們的日常生活中。

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Nano Sensors for Oxygen Based on Ratiometric Fluorescence

ZHAO Ting-ting1,LU Si-si2,ZHAO Li1,YAO Qiu-hong1,CHEN Xi2*

(1.Xiamen Huaxia College,Xiamen 361024,China;2.Department of Chemistry and the MOE Key Laboratory of Spectrochemical Analysis & Instrumentation,College of Chemistry and Chemical Engineering,Xiamen University,Xiamen 361005,China)

Ratiometric sensing nanoprobes derivatized from luminescent dyes show great application in a nano or micro system as well as in a sensing material.Nowadays,a ratiometric nano sensing system has attracted a wide variety of attentions.In this review,the meaning of measuring oxygen concentration was introduced and the determination approaches for O2was discussed.The research progress of nanosensors for O2based on ratiometric fluorescence including their preparation,characteristics and applications,was systematically reviewed.

oxygen；nanosensing；ratiometric fluorescence；preparation；applications;review

2016-07-30；

2016-09-23

國家自然科學基金資助項目(21375112)

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.02.025

O657.3；G353.11

A

1004-4957(2017)02-0288-09

*通訊作者：陳 曦，博士，教授,研究方向：熒光分析，Tel:0592-2184562,E-mail:xichen@xmu.edu.cn