王洋，周家華

(1.東南大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210009； 2.東南大學(xué) 附屬中大醫(yī)院，江蘇 南京 210009)

外周和門靜脈血中循環(huán)腫瘤細(xì)胞在胰腺癌診治中的研究現(xiàn)狀及應(yīng)用前景

王洋1，周家華2

(1.東南大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210009； 2.東南大學(xué) 附屬中大醫(yī)院，江蘇 南京 210009)

胰腺癌是惡性程度最高的腫瘤之一，早期診斷率及5年生存率低。目前胰腺癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測技術(shù)繁多，其靈敏度和特異性不盡相同，外周血和門靜脈血中循環(huán)腫瘤細(xì)胞數(shù)量及標(biāo)志物表達(dá)對(duì)胰腺癌的診斷、預(yù)后具有提示作用。本文作者對(duì)外周和門靜脈血中循環(huán)腫瘤細(xì)胞在胰腺癌診治中的研究現(xiàn)狀作一綜述。

循環(huán)腫瘤細(xì)胞; 胰腺癌; 門靜脈血; 檢測; 預(yù)后； 綜述

目前胰腺癌(pancreatic carcinoma，PC)是惡性程度最高的腫瘤之一，在西方國家為第四大癌癥相關(guān)的主要死亡原因，其5年生存率僅為1%～4%，中位生存期為4～6個(gè)月[1]。盡管對(duì)無淋巴結(jié)侵犯的胰腺癌患者行外科手術(shù)切除可使其5年生存率提高至20%～25%，但大多數(shù)患者就診時(shí)已存在肝臟或腹腔轉(zhuǎn)移。腹部增強(qiáng)CT、磁共振等影像學(xué)檢查是目前唯一可行的診斷方法，但無法顯示<5 mm的微小病灶或轉(zhuǎn)移灶。腫瘤標(biāo)志物包括CA19- 9、CEA等，其敏感性及特異性均有限[2]，僅具備一定參考價(jià)值。而近來出現(xiàn)的循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)、外泌體(exosome)等血清學(xué)指標(biāo)仍處于實(shí)驗(yàn)階段，尚未投入臨床應(yīng)用。目前胰腺癌的早期診斷在技術(shù)上難以實(shí)現(xiàn)，但對(duì)腫瘤細(xì)胞的早期發(fā)現(xiàn)將有利于減緩腫瘤進(jìn)展及病灶轉(zhuǎn)移，降低患者死亡率。大量研究[3- 6]證實(shí),腫瘤細(xì)胞存在于胰腺癌患者的外周血及門脈系統(tǒng)中。循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells， CTCs)是來源于原發(fā)腫瘤或轉(zhuǎn)移灶、獲得脫離細(xì)胞基底膜的能力并入侵通過組織基質(zhì)進(jìn)入血管的腫瘤細(xì)胞，其在腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移過程中的作用逐漸得到重視。隨著細(xì)胞檢測及鑒定技術(shù)的發(fā)展，對(duì)外周血及門靜脈中CTCs的檢測使胰腺癌的早期診斷、化療效果評(píng)估及預(yù)后判斷成為可能?，F(xiàn)就近年來胰腺癌CTCs的檢測技術(shù)、研究現(xiàn)狀及應(yīng)用前景進(jìn)行綜述。

1 CTCs檢測技術(shù)

1.1 分離和富集

CTCs與循環(huán)血細(xì)胞相比數(shù)量極少，在10 ml外周血中可能僅存在1～2個(gè)，而在同樣體積血液中存在107的白細(xì)胞和超過1010的紅細(xì)胞。因此對(duì)CTCs的分離須過濾掉血液中其他細(xì)胞的干擾，特定地篩選出這些數(shù)量稀少的腫瘤細(xì)胞。

1.1.1 物理富集方法

物理富集方法是根據(jù)CTCs與血細(xì)胞間密度、直徑等物理性質(zhì)不同而進(jìn)行分離的方法，目前最常用的物理富集方法為密度梯度離心法及濾過膜分離法。

1.1.1.1 密度梯度離心法 密度梯度離心法是一種較為傳統(tǒng)的細(xì)胞富集技術(shù)，利用特定介質(zhì)使不同密度的細(xì)胞在離心管內(nèi)通過重力作用分層、分離，其常用介質(zhì)為氯化銫、蔗糖等。CTCs較外周血單核細(xì)胞具有低密度特點(diǎn)，在此基礎(chǔ)上建立的OncoQuick系統(tǒng)較常規(guī)方法增加了多孔屏障，能使分離出的目的細(xì)胞更加純化，從而提高CTC的檢出率[7]，但仍有特異性低的缺點(diǎn)。

1.1.1.2 濾過膜分離法 ISET以及ScreenCell?過濾裝置根據(jù)細(xì)胞大小不同進(jìn)行分揀，其濾孔直徑在8.0 mm或以下，已能夠從結(jié)腸癌、肝癌、軟組織肉瘤、非小細(xì)胞肺癌等惡性腫瘤中的外周血中分離出CTCs[8- 11]。其優(yōu)勢在于能夠快速分離活細(xì)胞或固定細(xì)胞，不依賴于上皮標(biāo)志物，已被證實(shí)其靈敏度高于單純利用上皮標(biāo)志物抗體的檢測方法。該技術(shù)成本低廉，且分離過程中能保持細(xì)胞完整性，避免對(duì)細(xì)胞形態(tài)的破壞而影響進(jìn)一步的細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)分析。但其缺點(diǎn)仍為特異性不足，易致CTCs丟失或白細(xì)胞混入。

1.1.2 生物富集方法

生物富集方法是根據(jù)CTCs和血細(xì)胞間生物標(biāo)志物的差異進(jìn)行分離的方法。免疫磁珠分離法是最常用的生物富集方法，其利用特異性的單克隆標(biāo)記磁珠結(jié)合腫瘤細(xì)胞表面特異性抗原(通常為epithelial cell adhesion molecule,EpCAM)進(jìn)行細(xì)胞分選。唯一被FDA認(rèn)證的CellSearch系統(tǒng)現(xiàn)已應(yīng)用于轉(zhuǎn)移性乳腺癌、結(jié)腸癌及前列腺癌的檢測和治療中，但對(duì)胰腺癌的檢測應(yīng)用較少。該技術(shù)受限于在外周循環(huán)中存在非腫瘤的上皮細(xì)胞[12]，這種現(xiàn)象甚至已經(jīng)在健康受試者體內(nèi)得到證實(shí)，并且上皮標(biāo)志物通常在腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial- mesenchymal transition,EMT)過程中丟失，因此該法同樣存在假陽性和假陰性的缺陷。

1.2 檢測和鑒定

1.2.1 細(xì)胞計(jì)數(shù)

細(xì)胞計(jì)數(shù)法是根據(jù)細(xì)胞的抗原表達(dá)來分離和計(jì)數(shù)CTCs，大多使用抗上皮特異性抗原的抗體。其優(yōu)點(diǎn)在于保證了CTCs完整性，能進(jìn)一步分析其細(xì)胞形態(tài)學(xué)和分子學(xué)特征，而缺點(diǎn)在于缺乏腫瘤特異性抗體。

流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM)是通過單克隆抗體對(duì)腫瘤細(xì)胞特異性標(biāo)志物的識(shí)別實(shí)現(xiàn)分選和計(jì)數(shù)，并且該技術(shù)可同時(shí)檢測CTCs多種生物學(xué)特性，包括細(xì)胞內(nèi)DNA含量、細(xì)胞活力以及細(xì)胞內(nèi)或表面特異標(biāo)志物等，但其缺點(diǎn)是靈敏度偏低。Catenacci等[13- 14]使用FACS(fluorescence activated cell sorting)系統(tǒng)成功將胰十二指腸切除術(shù)中采集的門靜脈CTCs進(jìn)行計(jì)數(shù)，證實(shí)其數(shù)量多于同時(shí)采集的外周血中CTCs。

1.2.2 免疫熒光染色

免疫熒光染色基于腫瘤相關(guān)抗原或特異性標(biāo)志物與單克隆抗體結(jié)合,通過顯色反應(yīng)來判斷目的細(xì)胞特性，常用標(biāo)志物有EpCAM、CK、CA19- 9等。使用雙重免疫熒光染色還能夠證明兩種標(biāo)志物在同一細(xì)胞中表達(dá)，并對(duì)其定位加以區(qū)分。該檢測方法較為簡便，且敏感性和特異性較高。但在一些良性上皮增殖性疾病、手術(shù)、炎癥和組織創(chuàng)傷等情況下，部分上皮細(xì)胞可進(jìn)入外周血，這些細(xì)胞表面存在同樣的特異性抗原，易致假陽性發(fā)生；同時(shí)，在發(fā)生EMT過程中，部分CTCs表面特異性標(biāo)志物表達(dá)減弱甚至丟失，導(dǎo)致假陰性的發(fā)生。Poruk等[15]通過對(duì)46例PDAC患者外周血CTCs的CK、Vimentin及CD45進(jìn)行染色，將其分為上皮樣CTCs和間質(zhì)樣CTCs，得出兩者數(shù)量分別與腫瘤總體生存期(overall survival,OS)及早期復(fù)發(fā)有關(guān)。基于該技術(shù)改進(jìn)的iFish(immunostaining- fluorescence in situ hybridization)染色在胰腺癌、胃癌中也得到應(yīng)用[16- 17]。

1.2.3 核酸檢測

逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcriptase- polymerase chain reaction,RT- PCR)檢測腫瘤的過表達(dá)或突變基因的mRNA，相對(duì)于復(fù)雜的DNA檢測是一種很好的替代方法。腫瘤細(xì)胞死亡后，RNA在血液中快速降解，對(duì)其檢測可以代表腫瘤細(xì)胞的完整特性，而細(xì)胞碎片或游離RNA則不具備這一優(yōu)勢。RT- PCR采用熒光探針與擴(kuò)增序列特定寡核酸序列相結(jié)合，從而使擴(kuò)增時(shí)出現(xiàn)假陽性的可能最小化，并可以同時(shí)對(duì)多種突變進(jìn)行定量檢測。相對(duì)于免疫細(xì)胞化學(xué)(immunocytochemistry,ICC)來說，該方法更為客觀，并且更易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，RT- qPCR已逐漸應(yīng)用于胰腺癌CTCs檢測中[18- 19]。

1.2.4 微流體芯片

微流體芯片技術(shù)(CTC- chip)是基于微流體學(xué)和免疫學(xué)的CTCs檢測技術(shù)，由Nagrath等[20]首先報(bào)道。芯片表層包被EpCAM抗體，當(dāng)外周血樣本通過芯片時(shí)，EpCAM+細(xì)胞附著于微流體柱表面。通常將CK(cytokeratin)和DAPI(4′,6- diamidino- 2- phenylindole)作為陽性分選，CD45作為陰性分選，因此其敏感性和特異性均非常高。在其基礎(chǔ)上改進(jìn)的人字形芯片(herringbone- chip，HBChip)，增加了目的細(xì)胞和芯片的交互數(shù)量，可以處理更大容量血液樣本，提高了腫瘤細(xì)胞的分離效率。Wen等[21]利用CMx系統(tǒng)將胰十二指腸切除術(shù)中采集的門靜脈血中符合panCK+/CD45-/DAPI+條件的細(xì)胞篩選出，并得出其數(shù)量與腫瘤肝轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

2 CTCs在胰腺癌中的應(yīng)用

2.1 CTCs與胰腺癌診斷

CTCs作為生物標(biāo)志物在胰腺癌中的作用與其他實(shí)體瘤中相似，其在外周血中數(shù)量稀少，大量腫瘤晚期患者檢測率仍偏低，而鮮有文獻(xiàn)報(bào)道其檢測假陽性，因此檢測特異性明顯優(yōu)于敏感性。但如前所述，目前檢測方法繁多，對(duì)CTCs細(xì)胞定義也不盡相同，使得各方法間很難比較。

CTCs對(duì)于胰腺癌的診斷價(jià)值，各研究結(jié)論不一。Allard等[12]利用CellSearch系統(tǒng)在16例PDAC患者外周血中6例檢測出CTCs(37.5%)。Rhim等[22]使用GEM- chip法對(duì)32例胰腺病變患者外周血進(jìn)行檢測，在11例PC患者中8例檢測出CTCs(73%)，21例囊性病變患者中7例檢測出CTCs(33%)，而在19例健康對(duì)照者中均未檢測出CTCs。Poruk等[15]利用ISET系統(tǒng)在44例可切除PDAC患者中40例檢測出CTCs(90%)，得到間質(zhì)樣CTCs與患者術(shù)后短期復(fù)發(fā)相關(guān)(P=0.043)。Yang等[16]利用密度梯度離心及iFish法在25例PDAC患者中檢測出103個(gè)CTC細(xì)胞，而其數(shù)量與腫瘤分期及CA19- 9水平并無關(guān)聯(lián)。

CTCs對(duì)胰腺癌的診斷陽性率仍明顯低于超聲內(nèi)鏡穿刺(endoscopic ultrasonography- fine needle aspiration,EUS- FNA)，但其特異度普遍在95%以上，與內(nèi)鏡取得活檢病理結(jié)果相一致，進(jìn)一步行分子生物學(xué)研究可提高其診斷準(zhǔn)確性，并且其在費(fèi)用以及安全性方面明顯優(yōu)于超聲內(nèi)鏡。因此,CTCs檢測可作為潛在的輔助檢查手段，在將來投入臨床應(yīng)用。

2.2 CTCs與胰腺癌預(yù)后

現(xiàn)有眾多證據(jù)表明，CTCs的存在提示胰腺癌患者較差的預(yù)后。Kurihara等[23]利用CellSearch法在26例PC患者中11例檢測出CTCs(42%)，這部分患者具有較短的總體生存期(P<0.001)。Poruk等[15]利用ISET系統(tǒng)在44例可切除PDAC患者中40例檢測出CTCs(90%)，得到上皮樣CTCs與患者預(yù)后相關(guān)(P=0.008)。Yang等[16]利用密度梯度離心及iFish法在25例PDAC患者中檢測出103個(gè)CTCs，而CTC≥3·(7.5 ml)-1提示腫瘤較差預(yù)后(P=0.037)。

盡管有研究得出CTCs數(shù)量與胰腺癌預(yù)后無顯著性關(guān)聯(lián)，但結(jié)果仍提示存在這一趨勢，若將其較少樣本量納入考慮，則該結(jié)論的可信度將有所增加，因此仍須進(jìn)行大樣本研究及長期跟蹤隨訪來提高其準(zhǔn)確性。

2.3 CTCs與門靜脈系統(tǒng)

Jiao等[24]利用CellSearch系統(tǒng)對(duì)29例結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者肝切除術(shù)中獲取的7.5 ml門靜脈血CTCs進(jìn)行計(jì)數(shù)，發(fā)現(xiàn)其中位數(shù)[87·(7.5 ml)-1]多于同時(shí)采集的外周靜脈血[1·(7.5 ml)-1]。Catenacci等[13]最近利用超聲內(nèi)鏡及細(xì)針穿刺對(duì)18例胰腺膽管癌(PBCs)患者門靜脈血CTCs進(jìn)行獲取和計(jì)數(shù)，同樣發(fā)現(xiàn)其中位數(shù)[111.8·(7.5 ml)-1]顯著多于同時(shí)采集的外周血[0.7·(7.5 ml)-1]，且在不可切除PBCs患者中數(shù)量多于可切除PBCs患者。

肝臟對(duì)消化道腫瘤CTCs具有過濾作用，使CTCs進(jìn)入全身循環(huán)的數(shù)量明顯減少，其機(jī)制類似于肝臟對(duì)藥物的“首過消除”效應(yīng)。胰十二指腸切除術(shù)中收集的門靜脈血CTCs數(shù)量與術(shù)后肝轉(zhuǎn)移相關(guān)，其陽性預(yù)測值達(dá)到84.6%，陰性預(yù)測值達(dá)到87.2%[21]，而外周血中CTCs的低檢測率限制了其提示作用。這一結(jié)論對(duì)門靜脈血高水平CTCs患者術(shù)后進(jìn)行輔助治療具有指導(dǎo)意義。近來有學(xué)者嘗試將轉(zhuǎn)移起始細(xì)胞(metastasis- initiating cells,MICs)作為預(yù)后指標(biāo)，然而其僅存在于具有高水平CTCs數(shù)量的血液中，于單個(gè)血液樣本中難以捕獲，且缺少特異性標(biāo)志物，因此并沒有實(shí)際應(yīng)用意義[21]。

Arnoletti等[14]對(duì)21例PDAC患者術(shù)前及術(shù)后外周血、術(shù)中腫瘤切除前后門靜脈血中CTCs性質(zhì)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)門靜脈血CTCs具有更高水平K- RASmutmRNA轉(zhuǎn)錄以及組蛋白乙?；?，且在腫瘤切除后進(jìn)一步升高，預(yù)示著腫瘤切除后CTCs仍具有一定轉(zhuǎn)錄活性，且可以被M- MDSC(myeloid- derived suppressor cells with immature monocytic nature)所誘導(dǎo)的免疫抑制環(huán)境所增強(qiáng)。而在門靜脈血中CTCs數(shù)量也與M- MDSC水平密切相關(guān)，提示門靜脈的免疫抑制微環(huán)境對(duì)CTCs的免疫逃逸具有促進(jìn)作用。門靜脈系統(tǒng)中存在的渦流對(duì)其內(nèi)腫瘤細(xì)胞具有滯留作用，增加細(xì)胞和細(xì)胞間、細(xì)胞和血管間物質(zhì)交換，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞活化和其在局部組織中的駐留。這也解釋了門靜脈相對(duì)于外周血中CTCs的特殊性。

在胰腺癌手術(shù)當(dāng)中對(duì)門靜脈血的獲取將有利于檢測其中活化且具有轉(zhuǎn)移潛能的腫瘤細(xì)胞，而這項(xiàng)技術(shù)也將隨著超聲內(nèi)鏡的應(yīng)用得到進(jìn)一步推廣。

3 結(jié) 語

就目前胰腺癌的早期診斷和轉(zhuǎn)移監(jiān)測而言，CTCs(尤其門靜脈CTCs)具有重要意義，利用循環(huán)血CTC實(shí)時(shí)檢測來代替腫瘤組織活檢，將能極大程度改善患者治療的適應(yīng)性及減少創(chuàng)傷，避免不必要的有創(chuàng)性檢查及過度治療。此外，有研究證實(shí)CTCs可通過一種“腫瘤自身種植”機(jī)制完全復(fù)制原發(fā)腫瘤的特性，在浸潤血管中自由出入，即能夠從血液中重新返回原位灶繼續(xù)生長引起腫瘤復(fù)發(fā)，并促進(jìn)血管形成及基質(zhì)募集[25]。而在部分PDAC癌前病變模型中，CTC檢測可在腫瘤形成之前即呈現(xiàn)陽性，因此其釋放入血可認(rèn)為是發(fā)生在腫瘤形成中的早期事件，這也支持了CTCs檢測能夠用于監(jiān)測胰腺癌進(jìn)展的觀點(diǎn)。進(jìn)一步行癌細(xì)胞特異性基因突變研究，在未來可能實(shí)現(xiàn)以CTCs為目標(biāo)的靶向治療。相較乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌等其他上皮腫瘤來說，胰腺癌仍然缺乏特異性足夠高的腫瘤標(biāo)志物，且CTCs檢測率相對(duì)較低，檢測成本相對(duì)較高，目前尚缺少大規(guī)模、前瞻性研究來指導(dǎo)其臨床應(yīng)用。胰腺癌術(shù)中采集的門靜脈血CTCs相較外周血檢測率明顯升高，且對(duì)胰腺癌轉(zhuǎn)移具有提示作用，在超聲內(nèi)鏡進(jìn)一步推廣后其安全性及實(shí)用性將大為提高。

總而言之，作為新興的“液體活檢”項(xiàng)目，CTCs檢測對(duì)于腫瘤的無創(chuàng)實(shí)時(shí)監(jiān)測、個(gè)體化治療或?qū)⒋笥兄?，個(gè)體化用藥也將更多依賴于CTCs而非腫瘤活檢組織的細(xì)胞學(xué)及分子生物學(xué)分析。

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2017- 01- 27

2017- 05- 20

江蘇省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(7790000085)

王洋(1991-)，男，江蘇南京人，在讀碩士研究生。E- mail:840238489@qq.com

周家華 E- mail:zhoujh@seu.edu.cn

王洋,周家華.外周和門靜脈血中循環(huán)腫瘤細(xì)胞在胰腺癌診治中的研究現(xiàn)狀及應(yīng)用前景[J].東南大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2017，36(4)：673- 677.

R44; R735.9

A

1671- 6264(2017)04- 0673- 05

10.3969/j.issn.1671- 6264.2017.04.037