俞佳斌，王宸，王善正，陳翔溆，馬良彧，賈軍，郭玉冬，馬雪倩

(1.東南大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210009； 2.東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院 骨科，江蘇 南京 210009；3.浙江大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州 310029)

兔椎間盤退變體內(nèi)模型建立的最新進(jìn)展

俞佳斌1，王宸2，王善正2，陳翔溆2，馬良彧1，賈軍1，郭玉冬2，馬雪倩3

(1.東南大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210009； 2.東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院 骨科，江蘇 南京 210009；3.浙江大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州 310029)

椎間盤退變模型是研究椎間盤退變的病因和治療的基礎(chǔ)。目前兔是最適合構(gòu)建椎間盤退變模型的動(dòng)物，它具有操作簡(jiǎn)單、飼養(yǎng)方便、價(jià)格合適、可重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。兔椎間盤退變體內(nèi)模型建立的方式主要分為異常應(yīng)力模型、機(jī)械損傷模型以及化學(xué)損傷模型三大類。本文作者綜述了最近關(guān)于兔的椎間盤退變體內(nèi)模型的建立方法，并介紹各個(gè)模型退變的特點(diǎn)，以便于后期實(shí)驗(yàn)?zāi)芨玫膩?lái)選擇椎間盤退變模型。

椎間盤退變； 兔； 模型建立; 綜述

椎間盤(intervertebral disk)是脊柱中連接兩個(gè)相鄰椎體的纖維軟骨盤，其中央部為富含彈性膠狀物質(zhì)的髓核(nucleus pulposus)，周圍部是由多層纖維軟骨環(huán)按同心圓排列而成的纖維環(huán)(annulus)。椎間盤具有承受壓力、緩沖震蕩沖擊、保護(hù)脊髓等作用。椎間盤的退變與病變往往會(huì)引起一系列的臨床癥狀，也是引起下腰痛最主要的原因之一。長(zhǎng)期以來(lái)，盡管研究者對(duì)椎間盤退變做了大量的研究，但到目前為止，椎間盤疾病的發(fā)病原理依然不十分清楚，這對(duì)于研究者和臨床醫(yī)生都是一個(gè)重大的挑戰(zhàn)。良好的動(dòng)物模型的建立，可以最大限度地復(fù)制臨床上椎間盤退變的各種組織病理學(xué)的發(fā)生發(fā)展與轉(zhuǎn)歸，是探索這一問(wèn)題事半功倍的方法，為此研究者嘗試做出了多種動(dòng)物模型來(lái)探索椎間盤病變的潛在的機(jī)制[1]。

目前，被用來(lái)建立椎間盤退變模型的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物包括羊[2]、豬[3]、狗[4]、小鼠[5]等，每一種各有其優(yōu)缺點(diǎn)。綜合考量實(shí)驗(yàn)成本、操作難度、成功率、復(fù)制病變的相似程度等問(wèn)題，采用兔作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物具有更大的優(yōu)勢(shì)。相對(duì)于其他大型動(dòng)物，如羊、豬、狗而言，兔的成本低廉，容易獲得，實(shí)驗(yàn)條件要求不高。而與大鼠和小鼠相比，兔的體型比較適合，容易操作，建模成功率高[6]。因此，兔是目前建立椎間盤退變模型中最常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。

常見(jiàn)的兔椎間盤退變模型按照其建立方式主要分為異常應(yīng)力模型、機(jī)械損傷模型以及化學(xué)損傷模型三大類。

1 異常應(yīng)力模型

脊柱的異常應(yīng)力和椎間盤退變之間有一定聯(lián)系[7]。異常應(yīng)力模型是指對(duì)兔椎間盤施加異常的應(yīng)力，其應(yīng)力超過(guò)了椎間盤原本的生理負(fù)荷，引起椎間盤結(jié)構(gòu)和細(xì)胞的一系列的改變，最終導(dǎo)致椎間盤的退變。許多動(dòng)物模型的研究也分析了應(yīng)力和椎間盤退變的關(guān)系[8]。

1.1 軸向加壓模型

Kroeber等[9]在兔的L4和L5上打入2根克氏針，再接入加壓裝置，給予兔5倍質(zhì)量的恒定的力加壓，分別持續(xù)7、14、28 d以及持續(xù)28 d后，再撤銷加壓，自愈28 d后與假手術(shù)組對(duì)比。通過(guò)X線攝片、組織及細(xì)胞病理切片的觀察發(fā)現(xiàn)，隨著持續(xù)時(shí)間的增加，兔椎間盤高度逐漸降低，退變逐漸加重，得出軸向加壓裝置可以高效誘發(fā)椎間盤退變。之后，Kroeber等[10]繼續(xù)給椎間盤退變的兔加了一個(gè)拉伸力，與撤銷壓力的兔子相比，加上拉伸力之后的兔椎間盤高度增加，退變明顯緩解，說(shuō)明應(yīng)力所導(dǎo)致的椎間盤退變是可逆的。Huang等[11]也創(chuàng)建了軸向加壓裝置，最終也導(dǎo)致兔椎間盤不同程度的退變。

1.2 剪切應(yīng)力模型

Xia等[8]給兔裝上了剪切力裝置，該裝置通過(guò)4根基于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物脊柱樣式的3D模型的不銹鋼直接連于兔子的L4/L5椎體上，并沒(méi)有通過(guò)克氏針。此外，該裝置上還有1個(gè)帶刻度的彈簧，能提供固定的壓力，使L4/L5產(chǎn)生一個(gè)恒定50 N的剪切力，分別持續(xù)1、2個(gè)月，并與假手術(shù)組及未手術(shù)組比較，通過(guò)X線、磁共振成像(MRI)及組織切片觀察，發(fā)現(xiàn)隨著持續(xù)時(shí)間的增加，兔椎間盤高度逐漸降低，退變逐漸加重，鄰近椎間盤也出現(xiàn)不同程度的退變。

1.3 脊柱融合模型

脊柱融合模型是指通過(guò)固定相鄰階段的脊柱來(lái)使椎間盤產(chǎn)生退變。當(dāng)某2個(gè)節(jié)段融合固定后，本應(yīng)發(fā)生在固定節(jié)段的活動(dòng)將被分配到上下2個(gè)節(jié)段，導(dǎo)致鄰近節(jié)段的活動(dòng)度增加，椎間盤壓力增大，從而導(dǎo)致鄰近椎間盤的退變。許斌等[12]使用鋼絲對(duì)L4- L6行8字內(nèi)固定，然后用骨水泥包裹鋼絲，即融合L4- L6。結(jié)果顯示,3個(gè)月后L3到L4椎間盤即有退變，退變程度為Miyamoto 2級(jí)，至6個(gè)月時(shí)退變更加明顯，達(dá)到Miyamoto 3級(jí)。

1.4 脊椎不穩(wěn)模型

脊柱的生物力學(xué)穩(wěn)定性是指脊柱在生理載荷下不出現(xiàn)異常改變，這種穩(wěn)定性是由脊柱各個(gè)部分的合作而完成，任何部分的損傷或者缺損都可能破壞脊柱的穩(wěn)定性。而破壞脊椎穩(wěn)定性后，會(huì)造成椎間盤的受力不平衡，從而導(dǎo)致退變。有許多研究者建立了脊椎不穩(wěn)而導(dǎo)致椎間盤退變的模型。呂存賢等[13]從兔腰3棘突至腰6棘突，沿著棘突兩側(cè)切斷髂棘肌附著，沿棘突、椎板行骨膜下剝離，顯露棘突、椎板和關(guān)節(jié)突，切除腰3～6棘間、棘上韌帶及兩側(cè)關(guān)節(jié)突關(guān)節(jié)外1/2，造成椎間失穩(wěn)。創(chuàng)口愈合后，給兔背部加壓1/10體質(zhì)量物品2 h。對(duì)照組切開(kāi)皮膚后直接縫合。術(shù)后用MRI及組織切片評(píng)估，顯示術(shù)后2個(gè)月后兔椎間盤出現(xiàn)明顯退變。

2 機(jī)械損傷模型

椎間盤是人體最大的無(wú)血管組織，屬于完全封閉的免疫豁免器官，由內(nèi)層的髓核、外層的纖維環(huán)及上下軟骨終板構(gòu)成。破壞其密閉環(huán)境會(huì)導(dǎo)致一系列的變化，總體表現(xiàn)為組織脫水，進(jìn)而纖維環(huán)出現(xiàn)裂隙、終板軟骨骨化、纖維環(huán)斷裂以及最終髓核脫出，從而導(dǎo)致椎間盤退變。

2.1 纖維環(huán)損傷

纖維環(huán)由平行排列的膠原纖維組成[14]，最早在20世紀(jì)40年代Key等就用手術(shù)刀切開(kāi)動(dòng)物的纖維環(huán)成功誘導(dǎo)椎間盤退變。Masuda等[15]首先提出使用纖維環(huán)穿刺，用16 G、18 G及21 G的針頭刺入椎間盤5 mm，并與傳統(tǒng)的刀片損傷纖維環(huán)進(jìn)行比較，最后對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分別使用X線、組織形態(tài)學(xué)及MRI評(píng)估，發(fā)現(xiàn)所有進(jìn)行椎間盤穿刺的模型均造成了椎間盤的退變，并較刀片損傷纖維環(huán)模型的退變更為平緩。

因?yàn)樽甸g盤穿刺法對(duì)兔子的損傷較小，椎間盤退變的過(guò)程較為平緩，不破壞肌肉等其他組織，與人類的椎間盤退變更類似，且無(wú)須注入任何外來(lái)物品，對(duì)后續(xù)的生物化學(xué)指標(biāo)檢測(cè)不會(huì)產(chǎn)生影響，所以其使用更為廣泛，發(fā)展更為迅速。近來(lái)通過(guò)微創(chuàng)手術(shù)來(lái)構(gòu)建椎間盤退變模型成為熱點(diǎn)。蔣新華等[16]在透視引導(dǎo)下使用18 G穿刺針進(jìn)至椎間盤中心，維持5 s，術(shù)后使用X線、病理學(xué)檢查及MRI掃描，并測(cè)定T2WI信號(hào)強(qiáng)度,發(fā)現(xiàn)穿刺后0～2周椎間盤迅速退變，2周后基本穩(wěn)定，退變緩慢。Zhou等[1]在CT引導(dǎo)下建立椎間盤退變模型;Kim等[17]在C臂機(jī)引導(dǎo)下建立，相比于CT引導(dǎo)，C臂機(jī)建模時(shí)間短，價(jià)格低廉，性價(jià)比更高。

手術(shù)切開(kāi)暴露椎間盤有許多種手術(shù)入路，比如椎旁入路[18]、腹膜后入路[15,19- 20]、經(jīng)腹前外側(cè)入路[15]。切開(kāi)暴露相比于透視下穿刺需要更多的時(shí)間、精力及花費(fèi)。切開(kāi)手術(shù)對(duì)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的壓力，從而導(dǎo)致死亡率的增高。賀慶等[21]比較經(jīng)皮纖維環(huán)穿刺及經(jīng)肌間隙纖維環(huán)刀刺建立兔椎間盤退變模型發(fā)現(xiàn),經(jīng)皮纖維環(huán)穿刺較經(jīng)肌間隙纖維環(huán)刀刺操作簡(jiǎn)單，對(duì)兔損傷較小，感染率低，兔癱瘓幾率低，手術(shù)時(shí)間短，存活率高，4周及8周時(shí)退變程度輕，退變較為緩慢。

2.2 終板損傷

終板位于椎體中心的松質(zhì)骨和椎間盤之間，是椎間盤的上下邊界，由厚約0.5 mm的軟骨下骨和厚度相同的覆蓋其上的軟骨組成。其主要作用是防止椎間盤髓核組織嵌入椎體，同時(shí)具有平衡分散應(yīng)力的作用。終板也是椎間盤與外界進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)運(yùn)輸及廢物輸出的通道。隨著年齡的增長(zhǎng)，終板開(kāi)始慢慢地礦化，繼而阻止椎間盤營(yíng)養(yǎng)運(yùn)輸及廢物輸出，從而導(dǎo)致椎間盤退變[22],而外界干預(yù)損傷終板能導(dǎo)致椎間盤提早退變。呂浩然等[23]使用自制的弧形針對(duì)終板進(jìn)行多點(diǎn)、多角度的穿刺，術(shù)后行X線及MRI顯示進(jìn)行穿刺的椎間盤較未進(jìn)行穿刺的椎間盤椎體高度降低，椎體前緣出現(xiàn)唇緣樣增生，T2加權(quán)像信號(hào)降低，椎間盤出現(xiàn)退變。Hou等[20]在CT透視下將骨穿針刺入椎間盤的上終板，一組緩慢地注入1 ml平陽(yáng)霉素，另一組緩慢地注入1 ml生理鹽水，手術(shù)后第4周開(kāi)始進(jìn)行MRI和病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)信號(hào)降低和骨細(xì)胞損傷，而DSA檢查發(fā)現(xiàn)毛細(xì)血管出現(xiàn)損傷，第5周開(kāi)始典型的椎間盤退變癥狀開(kāi)始出現(xiàn)。終板的損傷導(dǎo)致椎間盤內(nèi)營(yíng)養(yǎng)的供給及廢物的代謝障礙，同時(shí)終板的損傷破壞了椎間盤的免疫隔絕，髓核暴露于免疫系統(tǒng)中，進(jìn)而激發(fā)自身的免疫反應(yīng)，導(dǎo)致髓核細(xì)胞的凋亡和椎間盤的退變。此方法導(dǎo)致的椎間盤退變發(fā)生時(shí)間相比于破壞關(guān)節(jié)突、纖維環(huán)切開(kāi)等方法明顯延遲，退變更為平緩。

2.3 髓核抽吸

目前椎間盤髓核細(xì)胞的減少被認(rèn)為是椎間盤退變的主要也是最直接原因，造成這種現(xiàn)象是由于細(xì)胞的增殖減慢、凋亡增加。隨著年齡的增長(zhǎng)，細(xì)胞增殖能力減弱，組織修復(fù)能力下降[24]。健康的椎間盤受到壓力時(shí)，含水量高的髓核由于液體的各相同性，靜水壓將壓力均勻傳遞到纖維環(huán)，避免應(yīng)力集中[25]。當(dāng)髓核中含水量減少或者髓核細(xì)胞減少時(shí)，壓力無(wú)法均勻傳遞，導(dǎo)致應(yīng)力集中、纖維環(huán)的損傷和破裂。白亦光等[26]利用21 G穿刺針在兔L3- L4、L4- L5、L5- L6節(jié)段抽取髓核組織，與只暴露不抽吸的兔子相比在4周后椎間盤高度降低，髓核細(xì)胞減少，形態(tài)不規(guī)則，分布不均勻，纖維軟骨組織出現(xiàn)增生，排列紊亂。8周后椎體周圍出現(xiàn)骨贅，纖維環(huán)結(jié)構(gòu)紊亂，髓核失去凝膠狀態(tài)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)MRI T2加權(quán)像信號(hào)逐漸降低，退變逐漸加重。邵輝等[27]使用16 G穿刺針對(duì)纖維環(huán)穿刺抽吸髓核，抽吸L3- L4、L4- L5、L5- L6椎間盤髓核，穿刺組也同樣在4周后出現(xiàn)了退變。由此可見(jiàn)髓核抽吸后，椎間盤發(fā)生了退變，其退變可能與髓核被抽吸后髓核內(nèi)壓力降低及應(yīng)力重新分布有關(guān)。髓核抽吸建立椎間盤退變模型相較于纖維環(huán)穿刺及終板損傷退變時(shí)間更早，進(jìn)程較快，退變程度較重，當(dāng)研究者需要迅速得到一個(gè)椎間盤完全退變模型時(shí)可采用此方法。

3 化學(xué)損傷

近年來(lái)，向椎間盤內(nèi)注入藥物促使椎間盤退變的研究也有了較大的進(jìn)展，化學(xué)損傷可以避免損傷纖維環(huán)、椎板及周圍正常的組織，又可以更好地模仿人類椎間盤退變的過(guò)程，生物化學(xué)方面更接近[28]。目前，主要向椎間盤內(nèi)注入的是酶類物質(zhì)，比如木瓜凝乳蛋白酶、軟骨酶素ABC、纖連蛋白，從而造成髓核細(xì)胞的變性、死亡，導(dǎo)致椎間盤的退變。

3.1 木瓜凝乳蛋白酶

木瓜凝乳蛋白酶早期被用于椎間盤突出的髓核的溶解，將木瓜凝乳蛋白酶注入退變突出的椎間盤內(nèi)，可水解髓核中的軟骨蛋白多糖而釋放出結(jié)合水和更小的糖胺聚糖，從尿中排出而降低髓核內(nèi)的壓力，髓核逐步被溶解[29]。于是有研究者將其注入椎間盤，造成椎間盤的退變。Gullbrand等[30]將椎間盤及椎間盤兩端的椎骨從脊柱上分離下來(lái)形成一個(gè)節(jié)段，用27 G穿刺針穿刺椎間盤將100 μl生理鹽水及濃度不同的木瓜凝乳蛋白酶注入髓核，質(zhì)量濃度分別為3、15、100 U·ml-1，將脊柱節(jié)段用生理鹽水浸泡的紗布包裹置于室溫15 h使其完全作用，最后通過(guò)MRI及組織學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)木瓜凝乳蛋白酶組蛋白多糖及水的含量減少，T2加權(quán)像信號(hào)降低，并發(fā)現(xiàn)注入3 U·ml-1的木瓜凝乳蛋白酶較15 U·ml-1的退變更為輕微，而100 U·ml-1的退變較為嚴(yán)重。

3.2 軟骨酶素ABC

軟骨酶素是由Yamagat等[31]在1968年從普通變形桿菌中提取出來(lái)的一種多糖酶，它可以選擇性地降解蛋白多糖中的透明質(zhì)酸和硫酸軟骨素，而對(duì)角蛋白硫酸酯、肝素及肝素硫酸酯無(wú)作用，與木瓜凝乳蛋白酶相比軟骨酶素ABC能最小限度地減少對(duì)周圍組織的損傷。

Imai等[32]將軟骨酶素ABC和多糖混合注入兔椎間盤，每隔2周行1次X線檢查，在注射后6、8、12及16周后處死兔行組織學(xué)和生物化學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，軟骨酶素ABC和多糖混合組的兔從第2周開(kāi)始就有退變的產(chǎn)生，退變隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而加重。

3.3 纖連蛋白

纖連蛋白是一種能與細(xì)胞基質(zhì)中多種成分結(jié)合并促進(jìn)其沉淀的大的纖維狀糖蛋白。在兔正常椎間盤中幾乎無(wú)Fn- f片段存在，而在退變的椎間盤中則成倍增加[33]。王娜等[34]在透視引導(dǎo)下使用30 G針頭向椎間盤內(nèi)注入N端30 kDa Fn- f，F(xiàn)n- f存在于退變的椎間盤之中，而正常的椎間盤中幾乎無(wú)Fn- f的存在，而且30 G 的針頭排除了手術(shù)及針刺創(chuàng)傷對(duì)椎間盤造成其他影響。最終在8周時(shí)注入Fn- f的椎間盤開(kāi)始出現(xiàn)退行性變化，髓核和纖維環(huán)的結(jié)構(gòu)出現(xiàn)進(jìn)行性丟失，到16周時(shí)部分的髓核出現(xiàn)了壞死。這個(gè)模型更符合椎間盤退變的生物化學(xué)特性，退變較為緩慢，與其他方法相比更接近于椎間盤退變的進(jìn)程。Liu等[35]向兔椎間盤中注入Fn- f得到了相同的結(jié)果。

4 總 結(jié)

建立一個(gè)好的椎間盤退變動(dòng)物模型應(yīng)該包含幾個(gè)注意事項(xiàng)：首先實(shí)驗(yàn)動(dòng)物要能較好地模仿人體內(nèi)椎間盤退變的過(guò)程；其次實(shí)驗(yàn)動(dòng)物要容易獲得，而且它應(yīng)該有一個(gè)合適的體型，允許手術(shù)建模時(shí)較為方便地接觸到椎間盤；最后椎間盤退變的發(fā)生應(yīng)該是可靠的，而且要具有較好的重復(fù)性[36]。一個(gè)好的動(dòng)物模型能給后續(xù)的研究提供良好的幫助，盡管目前我們已經(jīng)有了這么多類型的椎間盤退變模型，但這些模型都是單一的模擬椎間盤其中一個(gè)退變機(jī)制，椎間盤退變是由于椎間盤組織內(nèi)髓核細(xì)胞數(shù)目減少[37]、細(xì)胞外基質(zhì)成分改變[38]、局部調(diào)節(jié)及炎癥小分子影響[39]等因素綜合作用下所致。目前，纖維環(huán)穿刺法適用最廣，終板損傷模型造模難度較高，髓核抽吸法造成的椎間盤退變較為迅速，而化學(xué)損傷法可能會(huì)影響后續(xù)生化指標(biāo)檢測(cè)的準(zhǔn)確性。椎間盤的退變往往是由多個(gè)因素引起的，所以我們需要一個(gè)具有多種混雜因素、更能模擬椎間盤退變，而且操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性好的模型，這就需要我們?cè)谌蘸蟮膶?shí)驗(yàn)中進(jìn)一步探索和研究。

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2016- 11- 22

2017- 05- 05

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81572188)

俞佳斌(1992-)，男，江蘇蘇州人，在讀碩士研究生。E- mail:jiabinyumed@163.com

王宸 E- mail:101008139@seu.edu.cn

俞佳斌,王宸,王善正,等.兔椎間盤退變體內(nèi)模型建立的最新進(jìn)展[J].東南大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2017，36(4)：656- 660.

R- 332; R681.53

A

1671- 6264(2017)04- 0656- 05

10.3969/j.issn.1671- 6264.2017.04.033