耿 歡，林 琛，邢更彥

小鼠巨噬細(xì)胞系RAW 264.7向破骨細(xì)胞分化的誘導(dǎo)條件

耿 歡，林 琛，邢更彥

目的探討RAW 264.7細(xì)胞與向破骨細(xì)胞分化的誘導(dǎo)條件，以期提高破骨細(xì)胞的數(shù)量與活性。方法 采用不同濃度核因子κB受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor κB ligand，RANKL）誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞4 d后形成破骨細(xì)胞，并通過抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP）染色和鬼筆環(huán)肽染色鑒定破骨細(xì)胞，骨板吸收實驗檢測破骨細(xì)胞的骨吸收活性，反轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）檢測破骨細(xì)胞功能基因TRAP、破骨細(xì)胞相關(guān)受體（osteoclast-associated receptor，OSCAR）、c-Fos、核轉(zhuǎn)錄因子激活的T細(xì)胞1（nuclear factor of activated T-cells 1，NFATc1）的表達(dá)。結(jié)果RAW 264.7細(xì)胞經(jīng)RANKL誘導(dǎo)4 d后可出現(xiàn)大量TRAP呈陽性和纖維肌動蛋白環(huán)形成的多核破骨細(xì)胞，骨板上形成較多的骨吸收瘢痕，RT-PCR檢測到破骨細(xì)胞特殊功能基因信使核糖核酸（message ribonucleic acid，mRNA）高表達(dá)。結(jié)論RAW 264.7誘導(dǎo)4 d可產(chǎn)生大量噬骨能力較強(qiáng)的破骨細(xì)胞。

RAW 264.7；破骨細(xì)胞；抗酒石酸酸性磷酸酶；核因子κB受體活化因子配體

骨的生理平衡是通過成骨細(xì)胞的骨形成與破骨細(xì)胞的骨吸收維持的[1]。破骨細(xì)胞的過度激活與功能增強(qiáng)會打破這種平衡，導(dǎo)致骨量減少，增加骨折的風(fēng)險，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性骨髓瘤等疾病，因此破骨細(xì)胞的研究非常重要與有意義。破骨細(xì)胞的獲取是研究的前提，但其在骨組織中含量少，較難分離，體外誘導(dǎo)是獲取破骨細(xì)胞的主要方法。破骨細(xì)胞是在骨組織中由單核巨噬細(xì)胞分化來的特殊的具有吞噬骨組織功能的多核巨細(xì)胞。由于成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞之間OPG/ RANKL/RANK信號軸的發(fā)現(xiàn)[2]，使在體外誘導(dǎo)單核巨噬細(xì)胞融合成破骨細(xì)胞成為簡單有效的方法。RAW 264.7細(xì)胞是小鼠源性單核細(xì)胞，獲取簡單，純度較高，可以無限傳代，成為誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的主流[3]。然而，RAW 264.7細(xì)胞生長較快，且容易分化，用RAW 264.7細(xì)胞誘導(dǎo)破骨細(xì)胞依然有很大的難度，國內(nèi)外文獻(xiàn)對其培養(yǎng)與誘導(dǎo)的條件有很大差異，筆者主要研究RAW 264.7細(xì)胞向破骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化的適宜條件，為后續(xù)研究破骨細(xì)胞的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料 DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清（Gibco公司，美國）；抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrateresistant acid phosphatase，TRAP）染色試劑盒（Sigma，美國）；核因子κB受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor κB ligand，RANKL）（R&D，美國）；24孔破骨活性測定板（Coning，美國）；鬼筆環(huán)肽染色液（Invitrogen，美國）；RAW 264.7小鼠單核巨噬細(xì)胞系購自北京協(xié)和細(xì)胞庫；熒光倒置顯微鏡（奧林巴斯，日本）；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀（Bio-rad，美國）。

1.2 方法

1.2.1 RAW 264.7細(xì)胞培養(yǎng)與接種的密度梯度 RAW 264.7細(xì)胞生長迅速且容易分化，而狀態(tài)較好的RAW 264.7細(xì)胞是誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的關(guān)鍵，RAW 264.7細(xì)胞的培養(yǎng)血清56 ℃滅活30 min[4]，吹打傳代，用于誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞要為未分化的圓形。因為RAW 264.7細(xì)胞生長較快，且誘導(dǎo)需要4 d，誘導(dǎo)前密度梯度培養(yǎng)4 d，將RAW 264.7細(xì)胞按（0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50）×104/cm2的密度接種到24孔板中，培養(yǎng)4 d后用1%的甲苯胺藍(lán)染色觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，找出RAW 264.7細(xì)胞的最佳誘導(dǎo)密度。

1.2.2 破骨細(xì)胞誘導(dǎo)與TRAP染色 根據(jù)密度梯度培養(yǎng)結(jié)果將RAW 264.7細(xì)胞以5×103/cm2的密度接種到48孔板中，加用50 ng/ml的高濃度RANKL誘導(dǎo)破骨細(xì)胞，并于24、48、72、96 h分別進(jìn)行TRAP染色，觀察破骨細(xì)胞形態(tài)變化。同樣密度將RAW 264.7細(xì)胞接種到48孔板中，設(shè)置對照組與不同RANKL濃度誘導(dǎo)組，過夜貼壁后，對照組正常培養(yǎng)，未加任何處理，誘導(dǎo)組分別加用5、10、20、50 ng/ml的RANKL誘導(dǎo)破骨細(xì)胞，每2 d換液。4 d后鏡下觀察到融合的破骨細(xì)胞取出48孔板，去除培養(yǎng)液，按照Sigma試劑盒說明書進(jìn)行TRAP染色。

1.2.3 破骨細(xì)胞纖維肌動蛋白環(huán)的鬼筆環(huán)肽染色 將RAW 264.7細(xì)胞以5×103/cm2的密度接種到48孔板中，設(shè)置對照組與誘導(dǎo)組，對照組正常培養(yǎng)，未加任何處理，誘導(dǎo)組加20 ng/ml的RANKL，誘導(dǎo)4 d后，鏡下觀察到融合的破骨細(xì)胞后取出48孔板，去除培養(yǎng)液，磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）漂洗2遍，4%多聚甲醛固定20 min后，PBS漂洗2遍，0.1%的Triton-100穿孔10 min，PBS漂洗1遍，用鬼筆環(huán)肽工作液染色30 min，回收鬼筆環(huán)肽染色液，PBS漂洗2遍，用Hoechst染色20 min，PBS漂洗1遍后于熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.2.4 破骨細(xì)胞吸收功能檢測實驗 RAW 264.7細(xì)胞以5×103/cm2的密度接種于24孔骨細(xì)胞培養(yǎng)板中，設(shè)立對照組與誘導(dǎo)組，對照組正常培養(yǎng)，未加任何處理，誘導(dǎo)組加20 ng/ml的RANKL誘導(dǎo)破骨細(xì)胞，換液2 d/次，誘導(dǎo)4 d后拿出骨細(xì)胞培養(yǎng)板，移除培養(yǎng)液，ddH2O洗1遍，加入4%的次氯酸鈉漂洗5 min，移除次氯酸鈉，用ddH2O洗2遍，加入1%的甲苯胺藍(lán)染色10 min后，ddH2O洗3遍，室溫晾干，光鏡下進(jìn)行觀察拍照。

1.2.5 破骨細(xì)胞的標(biāo)志與功能基因檢測 將RAW 264.7細(xì)胞以5×103/cm2的密度接種于6孔板中，設(shè)置對照組與誘導(dǎo)組，對照組正常培養(yǎng)，未加任何處理，誘導(dǎo)組加用20 ng/ml的RANKL干預(yù)。48 h后提取總信使核糖核酸（message ribonucleic acid，mRNA），接著逆轉(zhuǎn)成與mRNA鏈呈互補(bǔ)的堿基序列的單鏈DNA（complementary deoxyribonucleic acid，cDNA），通過實時聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（realtime-polymerase chain reaction，RT-PCR）檢 測TRAP、OSCAR、c-Fos、NFATc1基因的表達(dá)。目的基因引物序列見圖1。

表1 熒光定量PCR的引物

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析本研究數(shù)據(jù)，計量資料采用表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗。誤差棒表示（平均值）的標(biāo)準(zhǔn)誤，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 RAW 264.7細(xì)胞的形態(tài)與接種密度梯度培養(yǎng)結(jié)果狀態(tài)較好的RAW 264.7細(xì)胞為未分化的小圓形，生長迅速，進(jìn)行密度梯度培養(yǎng)4 d后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞接種密度為5×103/cm2時細(xì)胞重疊生長較少且基本鋪平板底，小于此密度細(xì)胞集落之間距離較大，大于此密度細(xì)胞重疊嚴(yán)重且部分細(xì)胞脫落均影響破骨細(xì)胞的誘導(dǎo)，因此將RAW 264.7細(xì)胞以5×103/cm2的密度接種到相應(yīng)的培養(yǎng)板中誘導(dǎo)破骨細(xì)胞（圖1）。

圖1 RAW 264.7細(xì)胞不同接種密度培養(yǎng)4 d后甲苯胺藍(lán)染色（標(biāo)尺=200μm）

2.2 RAW 264.7細(xì)胞誘導(dǎo)分化為破骨細(xì)胞的TRAP染色結(jié)果RAW 264.7細(xì)胞經(jīng)50 ng/ml的RANKL誘導(dǎo)1 d后，出現(xiàn)少量單核的TRAP陽性細(xì)胞，誘導(dǎo)2 d后幾乎所有的細(xì)胞都是TRAP陽性，但未出現(xiàn)多核細(xì)胞，第3天開始出現(xiàn)多核的破骨細(xì)胞，但體積相對較小且數(shù)量較少，4 d后可見大量圓形、橢圓形的體積巨大的細(xì)胞，胞質(zhì)豐富，進(jìn)行TRAP染色可見為酒紅色的多核巨細(xì)胞，有的核可達(dá)上百個。RAW 264.7細(xì)胞經(jīng)不同濃度的RANKL誘導(dǎo)4 d后，未加RANKL組未見到TRAP陽性的多核巨細(xì)胞，5 ng/ml組與10 ng/ml組出現(xiàn)少量小的破骨細(xì)胞，而20 ng/ml組與50 ng/ml組均出現(xiàn)大量的TRAP陽性的破骨細(xì)胞，因此實驗可以較低濃度的RANKL（20 ng/ml）誘導(dǎo)破骨細(xì)胞來提高經(jīng)濟(jì)效益（圖2）。

2.3 RAW 264.7細(xì)胞誘導(dǎo)分化為破骨細(xì)胞的纖維肌動蛋白環(huán)染色結(jié)果RAW 264.7細(xì)胞經(jīng)RANKL誘導(dǎo)4 d后經(jīng)紅色鬼筆環(huán)肽染色可見成熟的破骨細(xì)胞纖維肌動蛋白環(huán)被染成紅色，復(fù)染Hoechst可見細(xì)胞內(nèi)有大量的藍(lán)色細(xì)胞核，對照組未出現(xiàn)紅色的肌動蛋白環(huán)與多核細(xì)胞（圖3）。

2.4 RAW 264.7細(xì)胞誘導(dǎo)分化為破骨細(xì)胞的骨板吸收結(jié)果骨吸收實驗發(fā)現(xiàn)RAW 264.7細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)4 d后骨細(xì)胞培養(yǎng)板上出現(xiàn)大量的圓形、橢圓形、不規(guī)則形狀的白色吸收瘢痕，對照組未見吸收瘢痕（圖4）。

2.5 RAW 264.7細(xì)胞分化為破骨細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)結(jié)果RT-PCR結(jié)果顯示RAW 264.7細(xì)胞經(jīng)RANKL誘導(dǎo)48 h后，經(jīng)過Image J軟件灰度分析，SPSS 16.0軟件統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)破骨細(xì)胞分化的相關(guān)基因TRAP、OSCAR、c-Fos、NFATc1的表達(dá)均明顯高于對照組（P＜0.05，圖5）。

圖2 RAW 264.7細(xì)胞經(jīng)50 ng/ml的RANKL誘導(dǎo)不同時間與經(jīng)不同濃度的RANKL誘導(dǎo)4 d后的TRAP染色結(jié)果（標(biāo)尺=100μm）

圖3 RAW 264.7細(xì)胞分化為破骨細(xì)胞的鬼筆環(huán)肽染色（標(biāo)尺=200 μm）

圖4 破骨細(xì)胞的骨吸收活性檢測（標(biāo)尺=100 μm）

3 討 論

破骨細(xì)胞是由單核巨噬細(xì)胞融合而成[5]，巨噬細(xì)胞集落刺激因子（macrophage colony-stimulating factor，M-CSF）與RANKL是破骨細(xì)胞分化過程中的兩個重要細(xì)胞因子[6]。M-CSF與破骨細(xì)胞前體細(xì)胞上c-fms受體結(jié)合促進(jìn)細(xì)胞增殖與細(xì)胞骨架的形成[7]；RANKL是促進(jìn)破骨細(xì)胞前體細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化的關(guān)鍵細(xì)胞因子[8]，RANKL與破骨細(xì)胞前體細(xì)胞上的RANK受體結(jié)合，RANK被激活后關(guān)鍵的起始階段是腫瘤壞死因子受體相關(guān)的細(xì)胞內(nèi)因子 （tumor necrosis factor, TNF）受體相關(guān)因子（receptor-associated factor, TRAF）結(jié)合到受體RANK胞內(nèi)特殊的結(jié)構(gòu)域[9]，最終引起破骨細(xì)胞特殊基因的表達(dá)并向破骨細(xì)胞分化[10]。上述機(jī)制的發(fā)現(xiàn)使得體外誘導(dǎo)破骨細(xì)胞變得相對簡單，現(xiàn)在RANKL與 M-CSF聯(lián)合成為誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的主要方法。

RAW 264.7細(xì)胞是小鼠單核巨噬細(xì)胞系并可以融合為破骨細(xì)胞[11]，且RAW 264.7細(xì)胞能表達(dá)破骨細(xì)胞表型標(biāo)志物。Xu等[12]研究認(rèn)為RAW 264.7細(xì)胞是晚期分化階段的破骨前體細(xì)胞，僅需要RANKL就可以誘導(dǎo)出破骨細(xì)胞。但文獻(xiàn)報道用RAW 264.7細(xì)胞誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的方法差異較大，本研究主要探索用RAW 264.7細(xì)胞誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的適宜條件。

RAW 264.7細(xì)胞生長迅速，誘導(dǎo)的密度采取密度梯度法直觀摸索條件，發(fā)現(xiàn)接種密度為5×103/cm2時4 d后細(xì)胞生長狀態(tài)良好，多數(shù)實驗者根據(jù)文獻(xiàn)確定細(xì)胞密度，建議誘導(dǎo)前進(jìn)行密度梯度摸索，同時RAW 264.7細(xì)胞的狀態(tài)對誘導(dǎo)破骨細(xì)胞也至關(guān)重要，狀態(tài)良好的RAW 264.7細(xì)胞更易誘導(dǎo)出破骨細(xì)胞。經(jīng)過高劑量RANKL多次誘導(dǎo)發(fā)現(xiàn)，RAW 264.7細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)24 h后出現(xiàn)少量有融合能力的TRAP陽性細(xì)胞，48 h后幾乎所有的RAW 264.7細(xì)胞均為TRAP陽性且開始發(fā)生融合[13]，并開始出現(xiàn)TRAP陽性的多核破骨細(xì)胞，96 h后出現(xiàn)大量的TRAP陽性的破骨細(xì)胞。隨后進(jìn)行RANKL濃度梯度誘導(dǎo)發(fā)現(xiàn)20 ng/ml時即出現(xiàn)大量的TRAP陽性細(xì)胞，隨著RANKL濃度的增加破骨細(xì)胞的數(shù)量并無顯著的增加[14]，這可能與RANKL和RAW 264.7細(xì)胞上的RANK受體結(jié)合達(dá)到飽和有關(guān)。因此筆者將RAW 264.7細(xì)胞以5×103/cm2的密度、20 ng/ml的RANKL濃度誘導(dǎo)4 d作為最佳誘導(dǎo)條件。按此條件誘導(dǎo)4 d后，成熟的破骨細(xì)胞經(jīng)鬼筆環(huán)肽熒光染色可見到纖維肌動蛋白環(huán)，纖維肌動蛋白環(huán)是成熟破骨細(xì)胞在骨上形成密閉小室進(jìn)行骨吸收的重要結(jié)構(gòu)[15]。24孔骨細(xì)胞培養(yǎng)板中可以明顯看到破骨細(xì)胞吸收留下的瘢痕，這是檢驗破骨細(xì)胞功能的直觀指標(biāo)。最后PCR檢測發(fā)現(xiàn)破骨細(xì)胞分化過程的相關(guān)基因TRAP、OSCAR、c-Fos、NFATc1均高表達(dá)。

圖5 RAW 264.7細(xì)胞經(jīng)RANKL誘導(dǎo)48 h后破骨細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)

綜上所述，采用小鼠單核細(xì)胞系RAW 264.7誘導(dǎo)破骨細(xì)胞是一種高效簡單的方法，可以為實驗需要提供大量形態(tài)與功能良好的破骨細(xì)胞。由于實驗條件的不同，誘導(dǎo)前應(yīng)對細(xì)胞接種密度、誘導(dǎo)天數(shù)、RANKL的誘導(dǎo)濃度進(jìn)行摸索，以期提高誘導(dǎo)效率。

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（2016-12-16收稿2016-02-07修回）

（本文編輯 孫秀明）

Induction conditions of osteoclasts differentiation from mouse macrophage RAW 264.7 cell line

GENG Huan，LIN Chen，and XING Gengyan.
Department of Joint limbs in Orthopedics center, General Hospital of Chinese People's Armed Police Force, Beijing 100039 , China
Corresponding author: XING Gengyan, E-mail: xgy7766@263.net

ObjectiveThe study aimed to explore the induction conditions of RAW 264.7 cells differentiation into osteoclasts, with the view to improving the amount and activity of osteoclasts.MethodsThe RAW 264.7 cells were induced with different concentrations of receptor activator of nuclear factor κB ligand (RANKL) for 4 days to differentiate into osteoclasts, tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) staining and phalloidin staining were used to identify the osteoclasts, the Osteo Assay Surface Plate was used to measure the bone resorptive activities of osteoclasts, reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) was used to detect the expressions of osteoclast phenotypic and functional genes TRAP, osteoclast-associated receptor (OSCAR), c-Fos and nuclear factor of activated T-cells 1 (NFATc1).ResultsRAW 264.7 cells induced by RANKL 4 days, could differentiate into multinucleated cells and a large number of fibrous actin rings formed by TRAP positive 1fibers and fibrous actin ring; Bone resorption pits were found on the surface of bone plate by microscope; RT-PCR detected that high expression of message ribonucleic acid (mRNA) made by the gene messenger of osteoclasts for special function.ConclusionsThe RAW 264.7 cells induced for 4 days can differentiate into a large number of osteoclasts with strong bone resorption activity.

RAW 264.7； osteoclast; tartrate-resistant acid phosphatase；receptor activator of nuclear factor κB ligand

R329

10.13919/j.issn.2095-6274.2017.03.006

國家自然科學(xué)基金（11405185）

100039 北京，武警總醫(yī)院骨科中心關(guān)節(jié)四肢科

邢更彥，E-mail:xgy7766@263.net