胡世賢，陸佳濤，徐福意，晁天柱，周梁良，李凱，周宇荀，肖君華

(東華大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)研究所，上海 201620)

利用表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)篩選不同表達(dá)豐度的內(nèi)參基因

胡世賢，陸佳濤，徐福意，晁天柱，周梁良，李凱，周宇荀，肖君華*

(東華大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)研究所，上海 201620)

目的 基于表達(dá)譜芯片的檢測(cè)結(jié)果，篩選多個(gè)內(nèi)參基因，用于小家鼠肝臟組織中具有不同表達(dá)豐度基因的定量檢測(cè)。方法 應(yīng)用表達(dá)譜芯片技術(shù)，完成小鼠肝臟組織的表達(dá)譜檢測(cè)；依據(jù)基因表達(dá)豐度將基因分為3組，并進(jìn)一步通過(guò)變異系數(shù)(coefficient of variation, CV)組內(nèi)篩選候選內(nèi)參基因；采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(real-time quantitative polymerase chain reaction, qPCR)和geNorm軟件確定內(nèi)參基因。結(jié)果 表達(dá)譜芯片成功采集超過(guò)60000個(gè)小鼠肝臟組織中轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)量數(shù)據(jù)，并將之分為低、中、高3個(gè)組合。最終篩選了低表達(dá)Casp2和Lrrc14、中表達(dá)Nrd1和Trpc4ap、高表達(dá)Atp5a1和Clu，共6個(gè)內(nèi)參基因。結(jié)論 基于表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)篩選的6個(gè)內(nèi)參基因，可適用于qPCR技術(shù)準(zhǔn)確定量小家鼠肝組織轉(zhuǎn)錄組中不同表達(dá)豐度基因的表達(dá)量。

內(nèi)參基因；表達(dá)譜芯片；實(shí)時(shí)熒光定量PCR；geNorm軟件

血脂水平異常是動(dòng)脈粥樣硬化、心臟病和脂肪肝密切相關(guān)的重要危險(xiǎn)因素[1]。隨著系統(tǒng)遺傳學(xué)的蓬勃發(fā)展，研究者們利用高血脂小鼠模型，結(jié)合基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、表型組學(xué)等知識(shí)，在血脂相關(guān)遺傳學(xué)研究中取得了豐碩的成果[2]。其中，基因表達(dá)分析在轉(zhuǎn)錄組水平上，是研究血脂等復(fù)雜性狀不可或缺的方法[3]。常用的技術(shù)如基因表達(dá)譜芯片，操作方便，通量高，可準(zhǔn)確快速得到完整的全基因組表達(dá)豐度數(shù)據(jù)，但是昂貴的價(jià)格限制了其應(yīng)用。與之相比，具有高靈敏性，高重復(fù)性，高特異性的實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是核酸分子定量的“金標(biāo)準(zhǔn)”[4]。

在qPCR相對(duì)定量實(shí)驗(yàn)中，目前被廣泛采用的是2-△△CT法?！鰿t表示目標(biāo)基因和內(nèi)參基因Ct值的差異，-△△Ct表示兩樣本間△Ct之差。當(dāng)目標(biāo)基因和內(nèi)參基因擴(kuò)增效率相差不大時(shí)，兩樣本間檢測(cè)基因相對(duì)表達(dá)量差異即為2-△△Ct[5]。因此，定量的準(zhǔn)確性與內(nèi)參基因的選擇密切相關(guān)。理想的內(nèi)參屬于維持細(xì)胞基本生物學(xué)特征的基因，應(yīng)具備兩個(gè)重要特點(diǎn)：1)表達(dá)穩(wěn)定，不受實(shí)驗(yàn)環(huán)境的影響[6]；2)與待測(cè)基因表達(dá)水平相近[7]。系統(tǒng)遺傳學(xué)研究中，內(nèi)參基因常被用于qPCR在多樣本中定量數(shù)十甚至上百個(gè)目標(biāo)基因，從而挖掘基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)[8-10]。1999年Suzuki 等[11]提出的Gapdh、B2m等常用內(nèi)參基因不具有通用性，一方面是由于其表達(dá)水平受到不同實(shí)驗(yàn)條件的影響，另一方面?zhèn)鹘y(tǒng)內(nèi)參基因的表達(dá)豐度較高，難以定量表達(dá)豐度較低基因[12]。因此，Radoni等[13]采用qPCR技術(shù)，針對(duì)13種已知候選內(nèi)參基因獲取ΔΔCT最穩(wěn)定的2個(gè)基因作為內(nèi)參；Almeida 等[14]采用qPCR array，在51個(gè)候選內(nèi)參基因中篩選內(nèi)參基因，其表達(dá)水平差異達(dá)到300倍。但是，從少量已知候選內(nèi)參中選擇內(nèi)參基因的方法，很難兼顧到表達(dá)穩(wěn)定性和表達(dá)豐度。

本研究以不同1號(hào)染色體替換系品系[15]的高血脂小鼠模型為樣本，采用表達(dá)譜芯片技術(shù)獲取小鼠肝臟組織的RNA表達(dá)數(shù)據(jù)，并進(jìn)一步利用qPCR和geNorm軟件篩選內(nèi)參基因，以期適用于qPCR定量肝組織轉(zhuǎn)錄本中不同豐度基因的表達(dá)量。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)與RNA提取

8周齡SPF級(jí)C57BL6/J(B6)小鼠(雄性14只)，體重22～25 g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[ SCXK (滬) 2012- 0002]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)遵守1988年動(dòng)物管理?xiàng)l例。實(shí)驗(yàn)在東華大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)研究所屏障動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)施進(jìn)行[ SYXK (滬) 2014- 0022]。取野生小家鼠來(lái)源1號(hào)染色體替換系品系B6-Chr1KM、B6-Chr1HZ、B6-Chr1SJ和近交系B6的8周齡雄鼠，每個(gè)品系各14只，品系內(nèi)分為2組(每組7只)分別喂食40%高脂飼料和10%對(duì)照飼料(上海諾寶生物科技有限公司)至20周齡。頸椎脫頸處死20周齡雄鼠后，即刻摘取肝臟組織，采用RNAiso Plus試劑(上海麥約爾生物技術(shù)有限公司)進(jìn)行RNA抽提。以Nanodrop 2000c超微量分光光度計(jì)(Thermo Fisher Scientific，美國(guó))和1% 甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA的質(zhì)量和完整性，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 表達(dá)譜芯片檢測(cè)和篩選候選內(nèi)參基因

采用Mouse Transcriptome Assay 1.0(Affymetrix)芯片，對(duì)樣本進(jìn)行表達(dá)譜檢測(cè)(上海其明信息技術(shù)有限公司)。用Expression Console和Transcriptome Analysis Console采集并分析數(shù)據(jù)，根據(jù)芯片信號(hào)值完成基因分組，每組篩選CV最低的基因(共21個(gè))作為候選內(nèi)參基因。用Oligo7跨越內(nèi)含子設(shè)計(jì)引物，由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列信息見(jiàn)表1。

1.3 qPCR驗(yàn)證

采用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒(上海麥約爾生物技術(shù)有限公司)逆轉(zhuǎn)錄cDNA，操作步驟依據(jù)說(shuō)明書進(jìn)行。qPCR采用2 × SYBR Green/Rox qPCR Master Mix(北京百泰克生物科技有限公司)試劑盒，ABI 7900 real-time PCR system和7900 System Software-SDS 2.2 (Applied Biosystems)分析樣本，反應(yīng)體系和反應(yīng)條件依據(jù)說(shuō)明書進(jìn)行。

1.4 篩選內(nèi)參基因

采用geNorm v3.5 軟件( https://www.biogazelle.com )根據(jù)平均變異度(M < 0.5)篩選穩(wěn)定表達(dá)的基因，每組選取M值最低的2個(gè)基因?yàn)閮?nèi)參基因。

2 結(jié)果

2.1 芯片檢測(cè)分析

小鼠肝組織表達(dá)譜芯片檢測(cè)結(jié)果如圖1所示：轉(zhuǎn)錄本的平均信號(hào)值在3～20之間，將信號(hào)值在3～7的轉(zhuǎn)錄本定義為低表達(dá)組，包括54180個(gè)轉(zhuǎn)錄本；信號(hào)值在7～13為中表達(dá)組，包括9163個(gè)轉(zhuǎn)錄本；信號(hào)值在13～20為高表達(dá)組，包括2192個(gè)轉(zhuǎn)錄本。

表1 基因芯片表達(dá)分析所篩候選內(nèi)參

注：a. 低表達(dá)水平基因；b. 中表達(dá)水平基因；c. 高表達(dá)水平基因；d. 傳統(tǒng)內(nèi)參基因。

Note. a indicates low expression genes; b indicates moderate expression genes; c indicates high expression genes and d indicates traditional reference genes.

2.2 候選內(nèi)參基因

根據(jù)CV越小基因表達(dá)水平越穩(wěn)定，在組合內(nèi)選擇CV最小的轉(zhuǎn)錄本為候選內(nèi)參基因。如表1所示，每個(gè)組合內(nèi)初步篩選的候選內(nèi)參，包括Sgsm3、Lrrc14、Klc1、Madd、Casp2、Ap2b1、Rpn2、Nrd1、Kpna6、Ppil2、Wnk1、Hars、Trpc4ap、Fth1、Mgst1、Ppia、Clu、Atp5a1、Vtn、Acaa2和Gapdh，所有候選內(nèi)參基因表達(dá)量CV均低于1%。

2.3 qPCR驗(yàn)證

qPCR的檢測(cè)結(jié)果如圖2所示，21個(gè)候選內(nèi)參基因相對(duì)表達(dá)量差異達(dá)到15 個(gè)Ct值(不考慮個(gè)別離群值)，約105，并可以明顯的分為3個(gè)組合，低表達(dá)組合為Sgsm3、Lrrc14、Klc1、Madd和Casp2，Ct值范圍25到28；中表達(dá)組合為Ap2b1、Rpn2、Nrd1、Kpna6、Ppil2、Wnk1、Hars和Trpc4ap，Ct值范圍21到25；高表達(dá)組合為Fth1、Mgst1、Ppia、Clu、Atp5a1、Vtn、Acaa2和Gapdh，Ct值范圍15到20。

注：Y軸表示芯片信號(hào)值(log2)。X軸表示區(qū)間內(nèi)轉(zhuǎn)錄本頻數(shù)。圖1 小鼠肝臟基因表達(dá)量分布Note. The Y-axis indicates values (log2) of microarray. The X-axis indicates frequency of transcripts in intervals.Fig.1 Distribution of the mouse liver gene expression abundance

注：X軸表示候選內(nèi)參基因，Y軸表示Ct值。藍(lán)色為低表達(dá)內(nèi)參，橙色為中表達(dá)內(nèi)參，綠色為高表達(dá)內(nèi)參，灰色為對(duì)照內(nèi)參基因。圖2 qPCR檢測(cè)小鼠肝臟候選內(nèi)參表達(dá)量。Note. X-axis indicates candidate reference genes and Y-axis implies Ct value. Blue, orange, green and gray colors represent for genes of low abundance, moderate abundance, high abundance and reference, respectively.Fig.2 Candidate reference genes of the mouse liver tested by qPCR.

2.4 內(nèi)參基因

geNorm軟件分析結(jié)果如圖3所示，21個(gè)候選內(nèi)參基因除Ppia和Fth1 M值均大于0.5，其他候選內(nèi)參M值都在0.5以下，其中Casp2和Lrrc14基因M值最小。在每個(gè)表達(dá)組合內(nèi)，我們各選取了2個(gè)M值最小的基因作為理想的內(nèi)參(表2)，低表達(dá)組合為Casp2和Lrrc14，中表達(dá)組合為Nrd1和Trpc4ap，高表達(dá)組合為Atp5a1和Clu。

注：Y 軸表示候選內(nèi)參基因的平均表達(dá)穩(wěn)定度 M 值，X 軸表示看家基因表達(dá)穩(wěn)定性由左向右逐步提高。圖3 候選內(nèi)參表達(dá)穩(wěn)定性分析Note: Y-axis indicates the average expression stability values ( M) , and X-axis indicates the candidate reference genes according to their increasing expression stability from left to right．Fig.3 Stability analysis of candidate reference genes

表2 優(yōu)選內(nèi)參基因

3 討論

模式動(dòng)物小鼠是血脂相關(guān)復(fù)雜疾病研究的重要模式動(dòng)物，且發(fā)現(xiàn)不同的近交系小鼠對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化、脂肪肝等疾病的易感性不同。準(zhǔn)確定量小鼠肝組織轉(zhuǎn)錄組中血脂代謝相關(guān)基因表達(dá)量情況，可構(gòu)建基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)血脂代謝調(diào)控通路中的關(guān)鍵基因，從而促進(jìn)血脂異常相關(guān)疾病的遺傳學(xué)研究。qPCR是定量技檢測(cè)基因表達(dá)量的最佳選擇，但qPCR在相對(duì)定量過(guò)程中需要用內(nèi)參基因來(lái)標(biāo)化檢測(cè)基因的表達(dá)量，再用2-△△CT法得到不同樣本間相對(duì)表達(dá)水平差異，而選擇合適的內(nèi)參基因是影響qPCR相對(duì)定量準(zhǔn)確度的重要因素[16]。因此針對(duì)小鼠肝組織轉(zhuǎn)錄組的qPCR定量檢測(cè)，需要篩選變異系數(shù)小、穩(wěn)定表達(dá)的看家基因。

本研究結(jié)果揭示，在表達(dá)譜芯片檢測(cè)結(jié)果中，65 536個(gè)檢測(cè)轉(zhuǎn)錄本的豐度差異超過(guò)105。根據(jù)變異系數(shù)篩選的21個(gè)候選內(nèi)參基因中，包含傳統(tǒng)常用內(nèi)參基因Ppia和Gapdh[17]，說(shuō)明其在小鼠肝臟組織中具仍能穩(wěn)定表達(dá)。針對(duì)常用于小鼠肝臟轉(zhuǎn)錄組[12]的內(nèi)參基因B2m，Actb，Tfrc的表達(dá)譜數(shù)據(jù)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，B2m、Actb和Tfrc表達(dá)量的CV分別為1.06%，1.77%，6.35%，均高于21個(gè)候選內(nèi)參基因，說(shuō)明其表達(dá)穩(wěn)定性較差，并不適用于本研究。23個(gè)基因qPCR檢測(cè)結(jié)果與表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)一致，除Actb表達(dá)水平在2種檢測(cè)方法中呈現(xiàn)了較大波動(dòng)，同樣說(shuō)明常用內(nèi)參基因Actb不適用于本研究。geNorm軟件是基于不同條件下2個(gè)內(nèi)參基因相對(duì)表達(dá)水平比值為定值的原理分析表達(dá)穩(wěn)定性，表達(dá)水平比值變異度M的增加意味著內(nèi)參穩(wěn)定性的下降。因此內(nèi)參基因的M值越小，就表示該基因越穩(wěn)定。此外，單個(gè)內(nèi)參基因標(biāo)化數(shù)據(jù)導(dǎo)致定量結(jié)果偏差數(shù)倍[18]，多個(gè)內(nèi)參基因能提高定量準(zhǔn)確度[19,20]，但內(nèi)參基因數(shù)量過(guò)多也有操作不便，經(jīng)濟(jì)成本高的缺點(diǎn)。因此，本研究在每個(gè)表達(dá)水平組合里，各選取了2個(gè)M值最低的內(nèi)參基因。

總之，基于表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)挖掘內(nèi)參基因的方法，能快速、精確的優(yōu)選轉(zhuǎn)錄組中表達(dá)水平最穩(wěn)定、表達(dá)豐度差異超過(guò)1000倍的內(nèi)參基因。篩選的內(nèi)參基因適用于qPCR相對(duì)定量小鼠肝組織中基因的表達(dá)量，對(duì)系統(tǒng)遺傳學(xué)中qPCR轉(zhuǎn)錄組表達(dá)分析具有重要的意義。

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Screening of reference genes of different abundance using gene expression microarrays

HU Shi-xian, LU Jia-tao, XU Fu-yi, CHAO Tian-zhu, ZHOU Liang-liang, LI Kai, ZHOU Yu-xun,XIAO Jun-hua*

(Institute of Biological Sciences and Biotechnology, Donghua University, Shanghai 201620, China)

Objective Based on the data detected using gene expression microarray, to select multiple reference genes and use them to quantify transcriptome genes of different abundance in the mouse liver tissue. Methods To detect global transcriptome genes in the mouse liver tissues using gene expression microarray. All the genes were sorted into different groups according to their expression level, followed by coefficient of variation (CV) analysis. Real-time quantitative polymerase chain reaction (qPCR) and geNorm software were used to further identify the reference genes. Results The expression levels of over 60,000 genes were obtained from microarray screening, and divided them into low, moderate and high expression groups. Finally six reference genes were screened, i.e. Casp2 and Lrrc14 as low abundance, Nrd1 and Trpc4ap as moderate abundance, and Atp5a1 and Clu as high abundance genes. Conclusions The six reference genes derived from microarray data can be used to accurately quantify the global transcriptome genes with various expression levels.

Reference genes; Gene expression microarrays; Quantitative real-time PCR; geNorm software; Mouse; Liver

XIAO Jun-hua，E-mail: xiaojunhua@dhu.edu.cn

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(編號(hào)：31371257)；上海市科委關(guān)鍵項(xiàng)目(編號(hào)：12140900404，13140900300，15140900500)。

胡世賢(1991-)，男，碩士研究生，研究方向：醫(yī)學(xué)分子遺傳學(xué)。E-mail： dhu.sxhu@hotmail.com

肖君華(1968-)，男，教授，研究方向：醫(yī)學(xué)分子遺傳學(xué)。E-mail： xiaojunhua@dhu.edu.cn

Q95-33

A

1005-4847(2017) 01-0008-06

10.3969/j.issn.1005-4847.2017.01.002

2016-06-28