任儀鵬 步榮發(fā) 張 蕾 史悅怡

口腔鱗癌患者外周血及腫瘤微環(huán)境中Th17細(xì)胞水平研究

任儀鵬 步榮發(fā) 張 蕾 史悅怡

目的：探索口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinoma)患者外周血及腫瘤微環(huán)境中的Th17水平是否存在異常情況。以此為切入點(diǎn)尋找控制腫瘤的靶點(diǎn)，為開發(fā)新的免疫療法打下基礎(chǔ)。方法：采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)并比較了OSCC患者和對(duì)照組外周血中Th17的水平，并檢測(cè)了腫瘤組織中Th17的水平。結(jié)果：1.OSCC患者外周血中Th17細(xì)胞含量高于正常對(duì)照組；2.腫瘤局部微環(huán)境中存在Th17細(xì)胞的浸潤(rùn)。結(jié)論：1.OSCC患者外周血存在Th17的水平升高；2.OSCC微環(huán)境中存在Th17的浸潤(rùn)現(xiàn)象，提示Th17在OSCC的發(fā)生發(fā)展中具有重要意義，可能成為免疫治療的新靶點(diǎn)。

Th17；OSCC；腫瘤微環(huán)境

頭頸腫瘤中95%是鱗狀細(xì)胞癌。而口腔鱗狀細(xì)胞癌(OSCC)又在其中占有大約四分之一。雖然放化療方法都有進(jìn)步，但是最近40年OSCC的5年生存率無(wú)較大改善。已有的研究成果發(fā)現(xiàn)機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)頭頸部鱗癌的影響很大[1,2]，其疾病進(jìn)展機(jī)制中很重要的一項(xiàng)就是對(duì)抗腫瘤免疫的免疫耐受以及免疫逃逸能力[3,4]。

Th17是近年發(fā)現(xiàn)的區(qū)別于Th1和Th2的新的輔助性T亞群[5]。既往研究發(fā)現(xiàn)Th17參與組織炎癥，通過誘導(dǎo)以下一些因子的釋放如IL-8，-6，COX-2，MMP-1，-3，CXCL1 NOS-2，從而參與血管發(fā)生、腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移。因此，Th17和腫瘤免疫之間必然存在著重要的聯(lián)系。所以研究Th17在腫瘤進(jìn)展和致病中的作用是很有必要的。但目前對(duì)于Th17與口腔鱗狀細(xì)胞癌之間的關(guān)系研究非常少，本研究的目的就在于初步探索OSCC患者外周血及腫瘤組織內(nèi)的Th17水平，為明確OSCC患者免疫狀態(tài)異常狀況，尋找干預(yù)方法打下基礎(chǔ)。

1．材料和方法

1.1材料

1.1.1血液標(biāo)本全部血液標(biāo)本取自解放軍總醫(yī)院口腔頜面外科的住院口腔鱗癌患者。所有患者手術(shù)前均未行放射治療、化學(xué)治療、生物治療及中西醫(yī)結(jié)合治療。對(duì)照組來自輸血中心健康獻(xiàn)血者。兩組各8例，全部為舌癌患者，平均年齡64.25歲，兩組性別、年齡無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。

1.1.2組織標(biāo)本 全部組織標(biāo)本取自解放軍總醫(yī)院口腔頜面外科的住院口腔鱗癌患者手術(shù)切除的腫瘤組織中心部位共8例，所有腫瘤組織經(jīng)病理學(xué)確診為鱗狀細(xì)胞癌。所有患者手術(shù)前均未行放射治療、化學(xué)治療、生物治療及中西醫(yī)結(jié)合治療。

1.1.3抗 體 IL-17A ALEXA 647、CD4 PERCP、FOXP3 PE、CD25 APC均購(gòu)自美國(guó)BD公司產(chǎn)品。

1.2．方法

1.2.1標(biāo)本處理 空腹采取靜脈血5ml，保存于NH抗凝管，顛倒混勻六次，帶回實(shí)驗(yàn)室立即進(jìn)行處理，術(shù)后如病理診斷為鱗狀細(xì)胞癌則納入統(tǒng)計(jì)范 圍。

12.2組織樣本 所有組織標(biāo)本取出后迅速放在含有10%新生小牛血清的1640培養(yǎng)基內(nèi)，帶回實(shí)驗(yàn)室立即按下列步驟處理：(1)取下標(biāo)本后立即送實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行細(xì)胞分離。將手術(shù)中取得的組織塊用PBS沖洗，洗去殘余的血液；(2)然后用剪刀剪成0.1-0.2mc直徑大小；(3)用混合的消化酶溶液(包含0.1%Ⅳ型膠原酶、0.002%I型DNA酶和0.01%V型透明質(zhì)酸酶，Sigma)在37℃溫度下消化2小時(shí)；(4)200目的消毒濾網(wǎng)過濾；(5)用75%和100%fiacl液進(jìn)行密度梯度離心(1500r/min×15min)，離心后收集75%和100%fiacl液交界界面上的細(xì)胞，即為淋巴細(xì)胞；(6) PBS洗滌，1000r/min×10min離心后去上清，共2次，收集沉淀細(xì)胞待用。

1.2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) 采用兩步法標(biāo)記，按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分別依次加入相應(yīng)抗體進(jìn)行標(biāo)記。組織樣本處理時(shí)提取組織浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，設(shè)定每管2×105個(gè)細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，添加抗體的步驟順序同血液標(biāo)本。

1.2.4結(jié)果判定 本研究中，每一個(gè)樣本收集分析2×105個(gè)細(xì)胞，采用CellQuest分析軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析并作圖。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)使用chiss2004軟件統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果用x±s表示，兩組間均數(shù)比較用t檢驗(yàn)，采用直線相關(guān)分析量指標(biāo)的相關(guān)性，P＜0.05差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2．結(jié)果

2.1 OSCC患者外周血中Th17細(xì)胞含量高于正常對(duì)照組 為了明確OSCC患者體內(nèi)免疫環(huán)境中是否存在Th17的異常，首先分析了OSCC患者外周血中Th17含量并與正常人做對(duì)比。流式數(shù)據(jù)分析中以CD4+T細(xì)胞含量為100%進(jìn)行，CD4+IL-17+細(xì)胞代表Th17細(xì)胞，結(jié)果顯示OSCC患者外周血中的Th17細(xì)胞占CD4+細(xì)胞的百分比為1.98%±0.472%，高于正常對(duì)照的0.41%±0.14%，且P＜0.01(圖1)。

圖1 外周血中Th17細(xì)胞含量OSCC患者高于正常對(duì)照P＜0.01

2.2 腫瘤局部微環(huán)境中存在Th17細(xì)胞的浸潤(rùn) 為了明確OSCC患者腫瘤微環(huán)境中是否存在Th17的浸潤(rùn)，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了OSCC組織內(nèi)Th17的含量，以CD4+T細(xì)胞含量為100%進(jìn)行流式分析，以CD4+IL-17+代表Th17細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)OSCC腫瘤組織內(nèi)存在Th17細(xì)胞浸潤(rùn)的現(xiàn)象。以CD4+T細(xì)胞為100%，Th17細(xì)胞的百分含量達(dá)到8.259%±6.25%(圖2)。

圖2 OSCC腫瘤組織浸潤(rùn)C(jī)D4+T淋巴細(xì)胞中Th17含量

3．討論

CD4+T細(xì)胞在抗腫瘤免疫反應(yīng)中起到關(guān)鍵作用，這些細(xì)胞既包含了輔助性的T細(xì)胞亞群，也包括了調(diào)節(jié)性T細(xì)胞亞群，還有NK細(xì)胞及CD8+T細(xì)胞等等類型。目前對(duì)于實(shí)體腫瘤的免疫治療主要集中在提高腫瘤微環(huán)境中的NK細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞并且效果有限。越來越多的研究提示我們CD4+T細(xì)胞的獲得性免疫反應(yīng)在抗腫瘤免疫中也起到了重要作用。而其中Th17是近年來新發(fā)現(xiàn)的輔助性T細(xì)胞亞群，雖然在實(shí)體瘤中的效應(yīng)仍存在爭(zhēng)議，但是在很多研究中其表現(xiàn)出來的抗腫瘤作用卻是不容忽視的。既往研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種腫瘤患者外周免疫環(huán)境存在明顯異常。而且已經(jīng)有研究針對(duì)頭頸部鱗癌進(jìn)行了研究，并且發(fā)現(xiàn)外周血中存在Th17的明顯異常[6]。但是針對(duì)口腔鱗狀細(xì)胞癌的研究還很少。

首先我們利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了OSCC患者外周血中Th17細(xì)胞的含量，發(fā)現(xiàn)OSCC患者外周血Th17含量明顯高于正常對(duì)照組。這表明OSCC患者外周免疫環(huán)境中的確存在Th17含量的異常，這與在其它惡性腫瘤研究中的發(fā)現(xiàn)結(jié)果類似[7,8]。以往研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種腫瘤患者外周血中IL-1β、IL-6和TGF-β等細(xì)胞因子升高，這些細(xì)胞因子就是Th17分化的重要誘導(dǎo)因素，所以我們猜測(cè)OSCC外周血Th17的增多可能與此因素有關(guān)。

另外外周增多的Th17會(huì)對(duì)腫瘤局部微環(huán)境產(chǎn)生什么影響呢？我們分析有可能的影響是：已知Th17細(xì)胞表達(dá)高水平的CXCR4和CCR6[9,10]，而腫瘤微環(huán)境中常高表達(dá)CCL20、CXCL12[11,12]等趨化因子及受體，而這些趨化因子和受體的相互作用可能就是趨化外周血Th17到腫瘤局部的因素。Kesselring[6]等人的研究就證明了外周Th17細(xì)胞可以遷移向腫瘤，并且這種遷移是CCR6/CCL20驅(qū)動(dòng)的，不僅因?yàn)門h17表達(dá)的CCR6給了它們對(duì)CCL20產(chǎn)生反應(yīng)并向目標(biāo)部位移動(dòng)的能力，而且Th17本身也表達(dá)CCL20，再通過自身促進(jìn)其他Th17的遷移[13]形成一個(gè)正向循環(huán)，導(dǎo)致Th17在腫瘤局部的增多。

因此我們繼續(xù)檢測(cè)了腫瘤微環(huán)境中的Th17水平，發(fā)現(xiàn)OSCC腫瘤微環(huán)境中的確存在Th17的浸潤(rùn)。分析原因，除去外周血中Th17升高的因素外，還有一個(gè)可能的原因就是以往研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種腫瘤細(xì)胞及基質(zhì)細(xì)胞存在高水平的IL-1β、IL-6和TGF-β表達(dá)，這為Th17的分化提供良好的環(huán)境，能夠原位誘導(dǎo)Th17的分化[7,8,14]。這很可能就是Th17升高的另一個(gè)機(jī)制。

因此，OSCC患者外周血增多的Th17可能來源于細(xì)胞因子環(huán)境的改變，并且可以選擇性的遷移和滯留在腫瘤微環(huán)境中從而影響腫瘤的發(fā)展。但是究竟是腫瘤的發(fā)生發(fā)展促進(jìn)了外周Th17的分化，還是整體免疫環(huán)境中Th17的異常促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生還需要進(jìn)一步研究。并且Th17含量在腫瘤不同進(jìn)展階段的含量是否相同也還需要進(jìn)一步確認(rèn)。但有一點(diǎn)可以肯定的就是Th17的異常必然是和OSCC的發(fā)生發(fā)展相聯(lián)系的。這也為我們尋找口腔鱗癌治療靶點(diǎn)提供了新的方向。

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Study of Th17 in peripheral blood and tumor microenvironment of patients with oral squamous cell carcinoma

REN Yi-peng, BU Rong-fa, ZHANG Lei, SHI Yue-yi (Department of Oral and Maxillofacial Surgery, The Chinese PLA General Hospital. Beijing 100853,China)

Objective: To investigate if there are any abnormal in the Th17 level of OSCC patients in peripheral blood and tumor microenvironment. Methods: The fl ow cytometry was used to compare the Th17 level between OSCC patients and normal control group in peripheral blood. Th17 levels in tumor tissue was also detected.Results: 1.The level of Th17 cells in the peripheral blood of OSCC patients were higher than that in the normal control group; 2.Th17 cells infi ltration were found in the local tumor microenvironment of OSCC. Conclusions; 1.Th17 levels of peripheral blood and tumor microenvironment were increased in OSCC patients; 2.Th17 infiltration could been detected in OSCC tumor micro environment, which suggested that Th17 might play an important role in the occurrence and development of OSCC. A new direction of immune therapy might be found.

Th17; OSCC; tumor microenvironment

R782

A[文章編號(hào)]1672-2973(2017)01-0005-04

2016-07-04)

任儀鵬 解放軍總醫(yī)院口腔頜面外科 主治醫(yī)師 北京100853

步榮發(fā) 通訊作者 解放軍總醫(yī)院口腔頜面外科 主任醫(yī)師教授 北京 100853

張 蕾 解放軍總醫(yī)院口腔頜面外科 副主任醫(yī)師 北京100853

史悅怡 解放軍總醫(yī)院口腔頜面外科 碩士生 北京 100853