張紅蕊，趙軼群，高曉紅，劉春梅，李春霞，鄭 佳

(1.河北省唐山市人民醫(yī)院體檢中心 063000；2.華北理工大學研究生院，河北唐山 063000；3.唐山職業(yè)技術(shù)學院臨床醫(yī)學系，河北唐山 063000)

論著·基礎(chǔ)研究

川陳皮素對糖尿病大鼠海馬Nrf-2表達及認知功能的影響

張紅蕊1，2，趙軼群1，高曉紅1，劉春梅1，李春霞1，鄭 佳3△

(1.河北省唐山市人民醫(yī)院體檢中心 063000；2.華北理工大學研究生院，河北唐山 063000；3.唐山職業(yè)技術(shù)學院臨床醫(yī)學系，河北唐山 063000)

目的 探討川陳皮素(NOB)對糖尿病認知功能的改善作用及可能機制。方法 實驗大鼠均為雄性，分為正常組：12周齡Wistar大鼠8只，清潔級，正常飼料喂養(yǎng)；糖尿病組：12周齡GK大鼠8只，SPF級，正常飼料喂養(yǎng)；NOB組：12周齡GK大鼠6只，SPF級，正常飼料喂養(yǎng)，同時每天給予NOB 10 mg/kg灌胃8周。喂養(yǎng)到22周齡時，Morris水迷宮行為學實驗評估大鼠認知功能、免疫組織化學和Western blot檢測海馬中核因子E2相關(guān)因子2(Nrf-2)的表達水平。結(jié)果 與正常組相比，糖尿病組潛逃潛伏期延長(P<0.05)，NOB組潛逃潛伏期較糖尿病組縮短(P<0.05)。平臺撤走后，與正常組相比，糖尿病組在目標象限停留時間較短(P<0.05)，NOB組較糖尿病組延長(P<0.05)。與正常組相比，糖尿病組Nrf-2的表達增加(P<0.05)；與糖尿病組相比，NOB組Nrf-2的表達水平上升(P<0.05)。結(jié)論 NOB可以升高海馬Nrf-2表達水平，改善糖尿病大鼠認知功能障礙，提示可能與增強Nrf-2活性及激活抗氧化應(yīng)激通路有關(guān)。

川陳皮素；神經(jīng)元;海馬；氧化應(yīng)激；核因子E2相關(guān)因子2

糖尿病認知功能障礙(diabetes mellitus with cognitive impairment，DMCI)是糖尿病嚴重的并發(fā)癥，而如何預(yù)防和改善DMCI，近年來成為研究熱點。目前公認為氧化應(yīng)激造成腦損傷是其重要發(fā)病機制之一。機體內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激通路核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor E2-related factor 2，Nrf-2)-ARE信號通路可激活以減輕腦損害。Nrf-2是通路中重要的抗氧化轉(zhuǎn)錄因子，通過與ARE的作用，產(chǎn)生大量的抗氧化酶及Ⅱ相解毒酶，抵消活性氧簇(ROS)的作用。川陳皮素(hobiletin,NOB)主要在中藥陳皮中提取，在柑橘類水果的果皮中廣泛存在，是多甲氧基黃酮類化合物，具有抗氧化[1]、抗動脈硬化[2]、抗炎、降糖、保肝[3]、營養(yǎng)神經(jīng)等作用。本文旨在通過研究NOB改善糖尿病大鼠DMCI及對海馬Nrf-2表達的影響，探索NOB改善DMCI的機制及防治DMCI的有效方法。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 12周齡GK大鼠，清潔級，體質(zhì)量(300±20)g；12周齡Wister大鼠，清潔級，體質(zhì)量(300±20)g。所有實驗大鼠均為雄性。GK大鼠購自北京維通利華公司，許可證號SCXK(京)2012-0001。Wister大鼠由華北理工大學動物實驗中心提供。嚴格按照華北理工大學動物實驗倫理委員會的條例執(zhí)行。

1.2 主要藥物及試劑 NOB由陜西慧科生物科技有限公司生產(chǎn)，兔抗Nrf-2多克隆抗體由美國KPL公司生產(chǎn)，β-actin抗體和免疫組織化學試劑盒由北京中衫金橋生產(chǎn)，十二烷基硫酸鈉(SDS)凝膠試劑盒由碧云天生物科技研究所提供，SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳(PAGE)電泳液粉劑抗體稀釋液、BCA蛋白濃度測定試劑盒由北京艾德萊生物科技有限公司提供。

1.3 儀器設(shè)備 Morris水迷宮及分析軟件由中科院藥研所研發(fā)，電泳轉(zhuǎn)移槽和垂直電泳儀由北京六一儀器廠提供，F(xiàn)luorChen 5500凝膠成像分析系統(tǒng)由美國Thermo提供，XMOOOLDR-MLM溫控搖床、高速低溫離心機、體質(zhì)量秤由北京中西遠大提供。

1.4 方法

1.4.1 實驗分組 為適應(yīng)環(huán)境，早期喂養(yǎng)大鼠2周后，檢測GK大鼠空腹血糖均大于11.1 mmol/L，按隨機數(shù)字表法分為糖尿病組：GK大鼠8只，給予正常飼料；NOB組：GK大鼠6只，給予正常飼料喂養(yǎng)，同時每天給予NOB 10 mg/kg灌胃；正常組：Wistar大鼠8只，食用正常飼料。均喂養(yǎng)8周。

1.4.2 Morris水迷宮實驗 大鼠22周齡時，行Morris水迷宮實驗，由實驗室固定人員完成，并不了解大鼠分組情況。(1)定位航行能力測試：確保周圍環(huán)境安靜的情況下進行連續(xù)4 d的測試，第1天為適應(yīng)性訓練。水池為圓形，高50 cm，直徑214 cm，水深30 cm，水溫約20 ℃，把4個標記點放池壁上，分成4個象限，把圓形平臺放到一個象限的中央。動物面朝池壁入水，記錄爬上平臺的時間，即潛逃潛伏期。若在120 s內(nèi)未上臺，潛逃潛伏期則記錄為120 s。輪流測試，共進行4輪，計算平均值作為當天成績。比較潛逃潛伏期的長短，代表大鼠空間學習能力水平；(2)空間探索能力測試：第5天把圓形平臺取出， 記錄120 s內(nèi)大鼠在目標象限停留多長時間。

1.4.3 灌注取材 Morris水迷宮實驗結(jié)束后大鼠空腹過夜8 h。之后每組選取4只大鼠進行心臟灌注，予10%的水合氯醛(3.0 mL/kg) 行腹腔注射麻醉，開胸使心臟暴露，行左心室插管，同時將右心耳剪開，用生理鹽水灌注，至眼球肝臟變白時，以4% 中性多聚甲醛灌注固定，快速將腦組織完整取出，并迅速分離海馬組織，裝到凍存管，用液氮冷凍后，放置于-80 ℃冰箱儲存。

1.4.4 免疫組織化學檢測 將分離的海馬組織在4%多聚甲醛中固定1 d。用石蠟包被、切片，約5 μm厚。脫蠟至水化后，用3% H2O2室溫處理20 min。在正常血清中封閉反應(yīng)1 h。在4 ℃冰箱條件下兔抗Nrf-2(1∶500)孵育過夜,滴加二抗(已生物素化),37 ℃孵育40 min。鏡下觀察,自來水沖洗，充分漂洗后，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。用Kodak 圖像分析系統(tǒng)和Image-Proplus 軟件，在400倍光鏡下每張切片選5個視野，計算細胞數(shù)，并取平均值作為結(jié)果。

1.4.5 Western blot檢測 制備蛋白樣品，將RIPA裂解液加到各組樣本中，充分裂解樣本，用高速低溫離心機離心后取出上清液。嚴格按照BCA法對蛋白的濃度進行測定。加好蛋白樣品后，恒壓電泳，直到溴酚藍到凝膠底部時結(jié)束。使用半干轉(zhuǎn)法把蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上。取出膜后，用3%BSA-TBST封閉，用搖床搖洗60 min。將1∶1 000稀釋的一抗加入，在4 ℃搖床上過夜，TBST漂洗。將稀釋的二抗加入，室溫下置搖床上孵育60 min，TBST漂洗。膜上加ECL后反應(yīng)大約5 min。曝光膠片，顯影、定影。使用凝膠成像分析系統(tǒng)對條帶進行分析。

2 結(jié) 果

2.1 Morris水迷宮實驗結(jié)果 第1天適應(yīng)性訓練期后，與正常組相比，糖尿病組大鼠潛逃潛伏期有所延長(P<0.05)；NOB組較糖尿病組潛逃潛伏期縮短(P<0.05)。平臺撤走后，與正常組相比，糖尿病組在目標象限停留時間縮短(P<0.05)；與糖尿病組相比，NOB組停留時間延長(P<0.05)。表明糖尿病大鼠學習記憶能力、空間探索能力均下降，出現(xiàn)認知障礙；而在NOB治療后改善，提示NOB在劑量為10 mg/kg時對糖尿病大鼠DMCI有改善作用，見圖1。

A：定位航行能力測試中各組大鼠連續(xù)4 d的潛伏潛逃期；B：平臺撤走后各組大鼠在目標象限的停留時間。a:P<0.05，與正常組比較。

圖1 NOB治療增強糖尿病大鼠的學習記憶能力

2.2 免疫組織化學結(jié)果顯示 光鏡下可見在陽性細胞的細胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒，各組均有陽性表達的細胞。與正常對照組(6.25±2.11)比較，糖尿病組(15.34±3.34)海馬CA1 區(qū)Nrf-2的陽性表達數(shù)目明顯增多(P<0.01) 。與糖尿病組相比，NOB組(20.38±3.27)海馬CA1區(qū)Nrf-2的陽性細胞數(shù)顯著增多(P<0.01)。

2.3 Western blot檢測結(jié)果 正常組海馬Nrf-2低水平表達，糖尿病組較正常組增加(P<0.05)； NOB組較糖尿病組海馬Nrf-2的表達升高(P<0.05)，表明NOB治療后Nrf-2表達增加，抗氧化能力隨之增強。見圖2。

A：各組大鼠海馬Nrf-2表達;B:各組大鼠海馬Nrf-2表達水平分析圖。a：P<0.05，與正常組比較;b：P<0.05，與糖尿病組比較。

圖2 NOB治療增加糖尿病大鼠海馬Nrf-2的表達

3 討 論

海馬與認知功能相關(guān)，有研究顯示糖尿病大鼠出現(xiàn)認知功能障礙時海馬結(jié)構(gòu)受損，考慮與高血糖透過血腦屏障損傷海馬神經(jīng)元有關(guān)。近年來很多學者認為氧化應(yīng)激是DMCI發(fā)病的機制之一。氧化應(yīng)激作用使細胞氧化-抗氧化的穩(wěn)態(tài)失去平衡，ROS增多而產(chǎn)生細胞毒性，損害腦組織。為抗衡氧化應(yīng)激的破壞作用，機體自身內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激通路激活，如Nrf2-ARE信號通路，發(fā)揮重要的抗氧化作用。

Nrf-2屬于CNC家族，是家族中活性最強的轉(zhuǎn)錄因子。在正常情況下，Nrf-2被細胞質(zhì)中Keap1 錨定，其活性相對抑制；Keap1對氧化還原非常敏感，有氧化應(yīng)激時與Nrf-2解離，使其進入細胞核，在核內(nèi)與抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response element，ARE)作用，啟動下游抗氧化蛋白，增強解毒酶系的表達等，如γ谷氨酸半月光氨酸合成酶(γ-glutamylcysteine synthetase，γ-GCS)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、醌氧化還原酶(NADPH：quinine oxidoreductase 1，NQO1)等，清除大量的自由基，減輕細胞損傷[4]，而且通過下調(diào)膠質(zhì)細胞的活化介導(dǎo)對神經(jīng)元的保護作用[5]。有研究發(fā)現(xiàn)在阿爾茨海默病中Nrf-2表達量升高，表明Nrf-2水平及活性升高可以起到保護中樞神經(jīng)的作用。有報道糖尿病大鼠DMCI時海馬中Nrf-2表達量升高，與本研究得出的結(jié)果一致。

NOB屬于多甲氧基黃酮類化合物，化學結(jié)構(gòu)為5,6,7,8,3′4′-六甲氧基黃酮(5,6,7,8,3′4′-A′-hexamethoxy flavone)，是從蕓香科植物村橘中提取出來的中藥單體，有抗癌、抗血小板聚集、抗炎、抗氧化等作用。近期發(fā)現(xiàn)NOB可通過降低p38 絲裂原活化蛋白激酶的活性水平而抑制皮膚黑色素瘤的細胞增殖[6]；NOB還有抗組胺的作用[7]，NOB可改善阿爾茨海默病模型大鼠的認知功能[8],有效改善腦缺血導(dǎo)致的認知功能下降。也有研究提出在實驗性腦梗死大鼠中9 mg/kg NOB對其腦組織有保護作用，也可預(yù)防腦卒中[9]，故本實驗選用NOB 10 mg/kg的劑量研究其對糖尿病認知作用是否也有所改善。

本研究得出Nrf2在正常組大鼠海馬中即有少量表達，考慮是用來維持正常情況下的生理功能。與正常組相比，糖尿病組大鼠海馬中Nrf-2的表達水平升高，但是認知功能明顯下降，提示在腦內(nèi)高血糖環(huán)境下，對氧化應(yīng)激敏感的Keap1即釋放Nrf-2入細胞核，Nrf-2活性增強、表達量增加，啟動下游抗氧化蛋白等表達(如γ-GCS、SOD、NQO1等)，中和大量氧化應(yīng)激產(chǎn)物、神經(jīng)元毒素等，以保護海馬神經(jīng)元，但是仍然不能抵抗高血糖導(dǎo)致的氧化應(yīng)激狀態(tài)，所以海馬的損傷使大鼠出現(xiàn)認知功能障礙。而經(jīng)過NOB治療的糖尿病大鼠認知功能有所改善，海馬中Nrf-2表達水平較糖尿病組顯著增高，筆者推測NOB是Nrf-2的激活劑，可以誘導(dǎo)Nrf-2活性增強、表達量增加，從而產(chǎn)生更多的抗氧化蛋白等保護海馬結(jié)構(gòu)，激活Nrf2-ARE信號通路的抗氧化作用。NOB對糖尿病大鼠的DMCI有一定的治療作用。

在本研究中，NOB藥物劑量選用10 mg/kg治療，可以提高DMCI大鼠海馬Nrf-2轉(zhuǎn)錄活性及表達，Nrf2-ARE信號通路激活，下游產(chǎn)生大量抗氧化蛋白及解毒酶，中和大量損害神經(jīng)元的ROS，從而神經(jīng)元細胞的藥物解毒能力、抗氧化應(yīng)激的能力都被提高，這對保護海馬神經(jīng)元有重要的作用，可見NOB藥物劑量是10 mg/kg時海馬Nrf-2表達增加，改善了DMCI。如果NOB藥物劑量繼續(xù)增大，如20 mg/kg、30 mg/kg或更多時，NOB治療對DMCI的作用如何呢？在正常細胞嚴格限制Nrf-2表達，除了氧化還原途徑外，還有不依賴氧化還原反應(yīng)的途徑，如磷酸化途徑；另外，Nrf-2表達量增加也有不良影響，如Nrf-2在腫瘤組織中高表達易導(dǎo)致其預(yù)后不良，有報道發(fā)現(xiàn)Nrf-2持續(xù)高表達有致死性作用。綜合以上，所以筆者推測Nrf-2表達在一定范圍內(nèi)隨著NOB藥物劑量的增加而增高，但當?shù)竭_某一藥量時即出現(xiàn)平臺期，或者Nrf-2的持續(xù)高表達會造成極不利影響。如何找到這個效果最佳的藥量范圍，需要今后進一步的研究證實。

NOB可以提高糖尿病大鼠海馬Nrf-2表達水平，改善其認知功能。在糖尿病患者中，NOB在某個合適的劑量是否對改善DMCI有此明顯的作用，是否可以起到預(yù)防作用，這些都需要更多更深入的研究。

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The influence of hobiletin on the cognitive impairment of diabetic rats and the expression of Nrf-2 in hippocampus

ZhangHongrui1，2,ZhaoYiqun1,GaoXiaohong1,LiuChunmei1，LiChunxia1,ZhengJia3△

(1.DepartmentofPhysicalExamination,TangshanPeople′sHospital,Tangshan,Heibei063000,China;2.PostgraduateCollege,NorthChinaUniversityandTechnology,Tangshan,Heibei063000,China;3.DepartmentofClinicalMedicine,TangshanVocationalTechnicalCollege,TangshanHebei,06300,China)

Objective To explore the Hobiletin improving cognitive function and the possible mechanism to protect the hippocampal neurons.Methods Eight of Wistar rats,SPF,12 weeks of age,male,were set to the normal group;Eight of GK male rats,SPF,12 weeks of age,only for diabetes group;Both of the two groups were given the normal feed.6 of GK male rats,12 weeks of age,to feed Hobiletin of orange peel 10 mg/kg and lavage for 8 weeks,were set to the NOB group.After 22 weeks the rats were tested by Morris water maze behavior experiment for test the ability of learning and memory;the expression of Nrf-2 was detected by immunohistochemistry and Western Blot.Results Compared with the normal group,the incubation period of diabetes group was longer (P<0.05),and the escape latency of NOB group was shorter than that of diabetes group (P<0.05).Compared with the normal group,the residence time in the target quadrant was shorter in the diabetes group (P<0.05),and prolonged in the NOB group than in the diabetes model group (P<0.05).The expression of Nrf-2 in diabetes group was significantly higher than that in diabetes group (P<0.05).The expression of Nrf-2 in NOB group was significantly higher than that in diabetes group (P<0.05).Conclusion NOB can increase the expression of Nrf-2 in hippocampus and improve the cognitive function of diabetic rats,which may be related to the enhancement of Nrf-2 activity and the activation of anti-oxidative stress pathway.

hobiletin;neurons;hippocampus;oxidative stress;Nrf-2

張紅蕊(1981-)，在讀碩士，主治醫(yī)師，主要從事內(nèi)分泌與代謝研究?！?/p>

，E-mail:zhengjia0514@163.com。

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.06.004

R285.5

A

1671-8348(2017)06-0732-03

2016-10-11

2016-11-23)