蔣小強,符乃方,符啟俊,徐培平，張奉學，蔣盛軍*，邱紅輝，高李澤，何萍，謝崢嶸，陳吉雄

（1.海南東方市畜牧局動物疾病預防控制中心海南東方,570100；2.中國熱帶農業(yè)科學院熱帶作物品種資源研究所；3.廣州中醫(yī)藥大學熱帶醫(yī)學研究所）

中草藥紅茶菌體外抗甲I流感病毒(H1N1)作用研究

蔣小強1,符乃方2,符啟俊2,徐培平3，張奉學3，蔣盛軍2*，邱紅輝1，高李澤1，何萍1，謝崢嶸1，陳吉雄1

（1.海南東方市畜牧局動物疾病預防控制中心海南東方,570100；2.中國熱帶農業(yè)科學院熱帶作物品種資源研究所；3.廣州中醫(yī)藥大學熱帶醫(yī)學研究所）

目的：從體外抗病毒試驗觀察中草藥紅茶菌制劑抗甲I型流感病毒（H1N1）作用。方法：利用細胞共培養(yǎng)法測定中草藥紅茶菌的細胞毒性；體外試驗以H1N1感染MDCK細胞，觀察用雞紅細胞凝集抑制法測試中草藥紅茶菌制劑體外對H1N1流感病毒的抑制效果。結果：中草藥紅茶菌制劑在1∶2稀釋度時對MDCK細胞存在66.25%的毒性作用，其在MDCK細胞上的半數(shù)毒性濃度TC50約為2-5倍稀釋度；中草藥紅茶菌制劑在半數(shù)毒性濃度1∶2和無毒濃度1∶3稀釋度時對流感病毒FM1株具有完全抑制作用，而在1∶4稀釋度下對病毒有50%的抑制作用，高于1∶4稀釋度的受試樣品則不能抑制流感病毒FM1株的對雞紅細胞的凝集作用。

中草藥紅茶菌；流感病毒；體外

流行性感冒病毒，簡稱流感病毒，是一種造成人類及動物患流行性感冒的RNA病毒，在分類學上，流感病毒屬于正黏液病毒科，它會造成急性上呼吸道感染，并借由空氣迅速的傳播，在世界各地常會有周期性的大流行。

甲型流感病毒，又稱A型流感病毒雖然感染鳥類、豬等其他動物的流感病毒，其核蛋白的抗原性與人甲型流感病毒相同，但是由于甲型、乙型和丙型流感病毒的分類只是針對人流感病毒的，因此通常不將禽流感病毒等非人類宿主的流感病毒稱作甲型流感病毒。但是，近年來，由于不同類型的流感病毒發(fā)生基因重組而產生跨宿主的新型流感病毒，如能傳染人的豬流感病毒和禽流感病毒[1]。

雖然流感病毒作為一種呼吸道病毒，傳染性非常強，但是流感病毒卻是一種抵抗力較弱的病毒。它對于乙酸、乳酸等酸性化學試劑尤其敏感。因此，根據(jù)流感病毒對酸的敏感性，研制出各種酸性消毒劑，通過噴霧消毒來預防流感。但是這些消毒作用都是瞬時性的。消毒過后，外面的流感病毒依然可以通過呼吸道和消化道侵染易感動物。紅茶菌是一種包含醋酸菌、酵母菌為主、產酸能力很強的共生菌群，它能在醋酸菌、酵母菌的共生作用下產生醋酸、檸檬酸、葡萄糖酸等酸性物質，紅茶菌培養(yǎng)液pH值一般保持在2.5-4.5之間[2]。紅茶菌對人體胃腸道的保健機理之一就是依靠降低胃腸道的pH值來抑制病原菌的生長[3]。茶葉、羅漢果、甘草、野菊花是一些具有藥食兩用的中草藥植物，這些植物的提取液普遍具有提高動物免疫力、拮抗病原細菌、病毒等方面的作用。因此，如果利用紅茶菌發(fā)酵上述茶葉等提取液來制備微生態(tài)制劑，將這種中草藥紅茶菌噴入這些流感病毒易感動物的呼吸道和消化道，紅茶菌中的復合菌群將通過產生醋酸等有機酸來降低這些流感病毒感染途徑的pH值，同時在茶葉等中草藥提取液的協(xié)同作用下將能有效預防流感的發(fā)生。本文報道了這種中草藥紅茶菌的制備、中草藥紅茶菌體外抗流感病毒活性的試驗結果。

1 材料

1.1 中草藥紅茶菌制劑：本研究室制備；陽性藥物：利巴韋林，購自廣東肇慶鼎湖藥業(yè)有限公司，純度＞98%，批號：120327。

1.2 培養(yǎng)基：DMEM培養(yǎng)基（GIBCO公司）、小牛血清（廣州畜牧場，批號：20111213）。

1.3 病毒：A/FM1/47(H1N1)，本實驗室凍存保種，其TCID50=4.67。

1.4 細胞：狗腎細胞MDCK，P3，本實驗室凍存保種。

2 實驗方法

2.1 中草藥紅茶菌制劑的制備

所用紅茶菌菌種購自北京食品研究所。紅茶菌母液的制備參考呂愛軍等提供的方法[7].制備中藥提取液：將0.2%茶葉、0.5%甘草、0.2%羅漢果和0.2%野菊花放入水溶液中煮沸，過濾后冷卻到約30℃以下時加入20%紅茶菌母液，靜置發(fā)酵2周后用于檢測或臨床使用[2]。

2.1 中草藥紅茶菌制劑的處理

中草藥紅茶菌制劑樣品以0.22μm微孔過濾除菌，以0.5ml/管分裝備用；陽性藥物利巴韋林，用DMEM培養(yǎng)基制備成母液濃度為10mg/ml，以0.22μm微孔過濾除菌，以0.5ml/管分裝備用。

2.2 中草藥紅茶菌對MDCK細胞毒性的測定

常規(guī)消化MDCK細胞后，以1.0×105個/ml密度接種于96孔細胞板上，置于37℃培養(yǎng)。待細胞匯合至緊密單層后，棄上清，加入含不同濃度的培養(yǎng)基（小牛血清含量為5%）繼續(xù)培養(yǎng)4天。每個實驗濃度接種4個細胞復孔。4天后終止實驗，每孔加入MTT 100μl（濃度為0.5%）避光孵育4小時后，棄上清。加入等量DMSO充分溶解后，于λ490下讀取對應的OD數(shù)值。通過Read-Muench法計算受試樣品的TC50。實驗過程中設置不加藥物的細胞對照孔。樣品稀釋比例：1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶16、1∶20、1∶32。

2.3 受試樣品在MDCK細胞上對流感病毒FM1抑制作用的測定

常規(guī)消化細胞后，以1.0×105個/ml密度接種于96孔細胞板上，置于37℃培養(yǎng)。待細胞匯合至緊密單層后，棄上清，加入含不同濃度的培養(yǎng)基（小牛血清含量為5%）繼續(xù)培養(yǎng)4天，每個實驗濃度接種4個細胞復孔。其中兩孔細胞攻擊等量的100TCID50病毒懸液0.1ml，于35℃吸附1-2小時。吸附結束后丟棄病毒懸液，重新加入對應的含藥培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。4天終止實驗，將每孔細胞上清液吸取50μl于血凝板上，再加入等量的0.5%雞紅細胞混懸液，室溫下孵育30分鐘，觀察樣品對流感病毒FM1凝集紅細胞的抑制作用。實驗過程中設置不加藥物的細胞對照孔及陽性藥物利巴韋林對照組、病毒對照組。樣品稀釋比例：1∶2、1∶3、1∶4、1∶5；陽性藥物利巴韋林：2.0、0.5、0.125、0.031mg/ml.

3 結果

3.1 中草藥紅茶菌制劑的細胞毒性

在初步篩選中，受試樣品木薯中草藥微生態(tài)制劑在1∶2稀釋度時對MDCK細胞存在66.25%的毒性作用。經過初步計算，其在MDCK細胞上的半數(shù)毒性濃度TC50約為2-5倍稀釋度。

表1.受試樣品在MDCK細胞上半數(shù)毒性濃度的測定（MTT法）

3.2 中草藥紅茶菌制劑對甲I流感病毒(H1N1)的抑制作用效果

用雞紅細胞凝集抑制法以及流感病毒標準株FM1測試了中草藥紅茶菌制劑體外對流感病毒的抑制效果，結果如表1所示：經過重復實驗，受試樣品中草藥紅茶菌制劑在半數(shù)毒性濃度1∶2和無毒濃度1∶3稀釋度時對流感病毒FM1株具有完全抑制作用，而在1∶4稀釋度下對病毒有50%的抑制作用，高于1∶4稀釋度的受試樣品則不能抑制流感病毒FM1株的血凝素，不能抑制流感病毒FM1株對雞紅細胞的凝集作用，這表明中草藥紅茶菌在體外對甲I型流感病毒具有較好的抑制作用。

表2.中草藥紅茶菌制劑對FM1流感病毒的體外抑制作用

*：在毒性結果中，“+”說明受試樣品對細胞存在毒性作用；“—”說明受試樣品對細胞無明顯毒性作用。在血凝程度中，“#”說明雞紅血球發(fā)生75%的凝集，提示對流感病毒FM1株無明顯抑制作用；“—”，說明雞紅血球不發(fā)生凝集，提示樣品對流感病毒FM1株具有抑制作用，能抑制病毒對雞紅細胞的凝集作用。

4 討論

我們以前對中草藥紅茶菌體外抗口蹄疫病毒的研究表明：中草藥紅茶菌在1∶4稀釋后，對BHK21細胞無毒性反應，并可有效抑制1000 TCID50口蹄疫病毒在BHK21細胞生長繁殖；1∶2稀釋的紅茶菌微生態(tài)制劑對3日齡乳鼠無毒性反應，并可有效殺滅1000 LD50口蹄疫病毒[8];在此研究的基礎上，取健康豬20頭，噴霧和口服中草藥紅茶菌3d后，進行O型口蹄疫毒株(豬O型O/China/99株鼠毒)攻毒試驗;攻毒后，繼續(xù)對豬群進行噴霧和口服給藥，觀察中草藥紅茶菌對攻毒豬的保護作用及體內抗口蹄疫病毒的作用。攻毒結果顯示，低劑量給藥豬3/5保護，中劑量給藥豬1/5保護，高劑量給藥豬0/5保護;在低劑量給藥條件下，攻毒保護效果優(yōu)于中劑量和高劑量;從攻毒后的第1天到第7天，陸續(xù)從試驗豬全血中檢測到口蹄疫病毒，其中中草藥紅茶菌高濃度預防組豬的口蹄疫病毒的復制水平最高，中劑量組較低，低劑量組復制水平最低。給藥合適劑量的中草藥紅茶菌對豬體內的口蹄疫病毒具有一定的抑制作用[4]。

根據(jù)口蹄疫病毒、流感病毒對酸敏感的特性以及高濃度的中草藥紅茶菌對口蹄疫病毒、流感病毒的體外抑制和殺滅試驗結果，我們推測中草藥紅茶菌中的有機酸對流感病毒的殺滅應起到主效作用，同時也與廣譜性的抗病毒植物茶葉、甘草、羅漢果等的提取液有關；由于口服和噴霧中草藥紅茶菌制劑對體內口蹄疫病毒的繁殖也有抑制和殺滅作用，所以我們推測中草藥紅茶菌種的中草藥提取液成分吸收進入動物體內起到殺滅和抑制病毒繁殖的作用，如其中的甘草提取液中的甘草多糖可以刺激細胞產生干擾素來提高動物機體的抗病毒特性[5,6]。

我們以前在豬上的口噴和鼻噴中草藥紅茶菌的試驗結果表明：使用一次中草藥紅茶菌，在一周之內，從豬的糞便中分離出大量醋酸菌。這表明紅茶菌中的醋酸菌和酵母復合共生菌群在豬的消化道中能存活能長達1周或更長的時間。如果對動物噴霧中草藥紅茶菌制劑，我們推測中草藥紅茶菌中的醋酸菌、酵母等益生菌在動物的呼吸道以及消化道存活較長時間，這些益生菌能夠持續(xù)產生醋酸等有機酸來抑制和殺滅流感病毒，從而實現(xiàn)對流感相對較為長效的預防。由于這種有效預防時間僅為1—2周的時間，所以我們需要周期性（如每周一次）使用這種中草藥紅茶菌，才能實現(xiàn)對流感的長效預防。除了抗流感病毒、口蹄疫病毒的特性，中草藥紅茶菌具有一般微生態(tài)制劑的優(yōu)良特性如無毒、環(huán)保、促進生長、提高動物的免役力等優(yōu)良特性，因此這種多功能性將有助于促進這種中草藥紅茶菌在生產中的推廣和應用。由于當前僅限于體外抗流感病毒的試驗研究，進一步研究中草藥紅茶菌在動物體內的抗病毒效果將有助于進一步研究中草藥紅茶菌的抗病毒機理以及推廣應用于流感病毒的預防。

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[1]Garten RJ，Garten R，Suggestion R，et al.Antigenic and genetic characteristics ofswine-origin 2009 A(H1N1) influenza viruses circulatingin humans[J].Science. 2009,325(5937)∶197-201.

[2]符乃方，吳俊才，符啟俊,等.中草藥紅茶菌的制備及其體外抗口蹄疫病毒活性[J].安徽農業(yè)科學，2014.42 (17)∶5500-5502.

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[4]符乃方，吳俊才，符啟俊,等.中草藥紅茶菌的制備及其體內抗口蹄疫病毒活性[J].安徽農業(yè)科學2014，42 (18)∶5892-5894，5908.

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S853.7

B

1003-8655（2017）01-0003-02

2016-11-15

本課題為國家現(xiàn)代農業(yè)產業(yè)技術體系項目資金資助(nycytx-17)以及中國熱帶農業(yè)科學院院所基本科研業(yè)務費項目（PZS009）資助。

蔣小強（1986-），男，漢族，甘肅張掖人，研究生學歷，主要從事畜禽傳染病的預防研究。

*通訊作者,蔣盛軍，E-mail∶18708938111@139.com。