潘志峰 馬文娟 顏崇淮 梁俊

（1.上海溯源生物技術(shù)有限公司，上海 201210；2.復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200433；3.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院，上海 200092）

抗生素的發(fā)現(xiàn)與應(yīng)用在人和動(dòng)物疾病的預(yù)防與治療、畜禽養(yǎng)殖和水產(chǎn)養(yǎng)殖中作為添加劑加快動(dòng)物生長(zhǎng)和促進(jìn)增產(chǎn)方面都起到了極其重要的作用［1］，從而導(dǎo)致抗生素在全球范圍內(nèi)的大量使用，濫用的現(xiàn)象十分普遍［2-6］。環(huán)境污染物中抗生素的殘留和動(dòng)植物食品中食源性抗生素的存在導(dǎo)致人體可能通過食源性渠道持續(xù)性攝入抗生素，導(dǎo)致抗生素的低劑量持續(xù)性暴露。由于醫(yī)用抗生素使用實(shí)質(zhì)上是短期高劑量暴露，而來自食品或環(huán)境中的抗生素是低劑量持續(xù)暴露，近階段研究結(jié)果提示抗生素的暴露模式可能是影響其促進(jìn)脂肪生成的重要因素之一［7］；Martin Blaser團(tuán)隊(duì)動(dòng)物研究表明，食源性抗生素對(duì)生命早期可能會(huì)產(chǎn)生有害的長(zhǎng)期影響，即使是在低濃度水平下也會(huì)影響嬰幼兒腸道菌群平衡，并在嬰幼兒后續(xù)的發(fā)育過程中影響其免疫系統(tǒng)的發(fā)育以及營(yíng)養(yǎng)代謝（導(dǎo)致肥胖）［8，9］，John Bieneistock團(tuán)隊(duì)研究揭示了諸如青霉素這樣的窄譜抗菌素對(duì)于腸道微生物及其行為的影響，甚至?xí)?duì)行為和腦神經(jīng)化學(xué)造成長(zhǎng)期影響［10］。結(jié)合中國(guó)現(xiàn)狀，來自畜牧養(yǎng)殖業(yè)、實(shí)驗(yàn)小鼠、兒童流行病學(xué)的證據(jù)一致表明：食源性污染物中抗生素的低劑量持續(xù)性暴露能改變生命體早腸道菌群分布，干預(yù)生命體早期發(fā)育。因此對(duì)于孕產(chǎn)婦和嬰幼兒來說，監(jiān)測(cè)孕產(chǎn)婦體內(nèi)食源性抗生素暴露水平，預(yù)防和避免新生兒過早的接觸抗生素顯得尤為重要！

自1943年青霉素應(yīng)用于臨床，抗生素發(fā)展迅猛，比較常見的抗生素種類有β-內(nèi)酰胺類、喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類、酰胺醇類、氨基糖苷類、四環(huán)素類等，加上對(duì)革蘭菌（G＋／G-）有作用的其他抗生素，現(xiàn)有抗生素已達(dá)幾千種。臨床上血藥濃度監(jiān)測(cè)大多是針對(duì)單一化合物或某一族類（如青霉素類、磺胺類）的化合物進(jìn)行研究［11，12］，監(jiān)測(cè)的藥物濃度水平較高，而食源性抗生素暴露水平遠(yuǎn)低于血藥濃度監(jiān)測(cè)水平，并且種類繁雜，包含了幾乎所有醫(yī)用和獸用抗生素。目前還沒有血清中多類別多種抗生素的同時(shí)檢測(cè)的文獻(xiàn)報(bào)道，為監(jiān)測(cè)普通人群的抗生素暴露水平，需要建立一種更加靈敏穩(wěn)定的檢測(cè)方法。鑒于此，為了更有效地檢測(cè)食源性抗生素在母嬰體內(nèi)的暴露水平，避免和干預(yù)抗生素暴露對(duì)于生命體早期生長(zhǎng)發(fā)育的影響，本研究采用固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（SPE-LC-MS／MS）技術(shù)建立了血清中6類18種抗生素的同時(shí)定量分析方法，包括β-內(nèi)酰胺類（β-lactams）、喹諾酮類（4-quinolones）、磺胺類（sulfonamides）、四環(huán)素類（Tetracyclines）、氯霉素類（chloramphenicol）和林可霉素（Lincomycin），可在8分鐘內(nèi)完成全部目標(biāo)抗生素分析。

1 材料和方法

標(biāo)準(zhǔn)品：磺胺二甲嘧啶（Sulfadimidine）、磺胺吡啶（Sulfapyridine）、磺胺嘧啶（Sulfadiazine）、磺胺噻唑（Sulfathiazole）、青霉素（Penicillin）、阿莫西林（Amoxicilin）、氨 芐 西 林 （Ampicillin）、苯 唑 西 林（Oxacillin）、頭孢噻吩（Cephalothin）、頭孢噻肟（Cefotaxime）、左氧氟沙星（Levolfoxacin）、諾氟沙星（Norfloxacin）、環(huán)丙沙星（Ciprofloxacin）、四環(huán)素（Tetracycline）、土霉素（Oxytetracycline）、金霉素（Chlortetracycline）、氯霉素（Chloramphenicol）和林可霉素（Lincomicin）均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。

乙腈（質(zhì)譜級(jí)）、甲醇（質(zhì)譜級(jí)）、甲酸（色譜級(jí)）和磷酸（色譜級(jí)）均購(gòu)自賽默飛世爾科技公司（Thermo Fisher Scientific）。

1.2 樣本處理方法 取140μl血清樣本，加入140μl的4%磷酸溶液，旋渦混勻1分鐘，取混合液200μl加入到Oasis HLBμElution Plate小孔中進(jìn)行固相萃取。上樣前，SPE小孔依次用200μl甲醇和200μl水（水2次共400μl）活化平衡；上樣后用抽濾裝置抽干小孔并用100μl水沖洗2次后抽干。樣本孔用50μl 60%乙腈洗脫并抽濾兩次至抽干；用96孔收集板收集2次洗脫液上機(jī)待測(cè)。

1.3 液相色譜方法 色譜柱：ACQUITY UPLC HSS T3（1.8μm，2.1 mm×100 mm，美國(guó) Waters公司）；柱溫40℃，進(jìn)樣量5μl，樣品室溫度10℃。流動(dòng)相A為0.1%甲酸水溶液，流動(dòng)相B為甲醇，流速0.4 ml／min，梯度洗脫程序見表1。

1.4 質(zhì)譜方法 電噴霧離子源正負(fù)離子（ESI＋／ESI-）切換模式，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）方式采集分析，毛細(xì)管電壓分別為3.0k V＋／2.5k V-，離子源溫度為150℃，脫溶劑氣溫度為550℃，脫溶劑氣流速為1000l／h，錐孔氣流速為50ml／h。每種抗生素的詳細(xì)質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)見表2。

表1 18種抗生素梯度洗脫程序

2 結(jié)果

2.1 色譜條件的優(yōu)化 分別考察了Waters ACQUITY UPLC系統(tǒng)的 BEH C18（1.7μm，2.1mm×50mm）和 HSS T3（1.8μm，2.1 mm×100 mm）色譜柱，結(jié)果顯示T3色譜柱極性跨度大，對(duì)于阿莫西林等極性較大的化合物T3色譜柱的保留效果更佳。流動(dòng)相的選擇結(jié)果表明甲醇做溶劑時(shí)，抗生素能夠完全分離且甲醇能夠改善峰形，因此流動(dòng)相選擇甲醇。

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化 六大類抗生素的質(zhì)譜行為不同，氯霉素在負(fù)離子模式（ESI－）下有較強(qiáng)信號(hào)，在正離子模式（ESI＋）下信號(hào)非常弱，而其他種類抗生素正好相反。因此本方法中選擇正、負(fù)離子模式同時(shí)監(jiān)測(cè)，一次性對(duì)所有目標(biāo)抗生素進(jìn)行分析，減少了分析用時(shí)。2.3 樣本前處理方法的優(yōu)化 比較了傳統(tǒng)的乙腈沉淀蛋白離心后氮吹復(fù)溶的方法與Oasis HLB固相萃取法，結(jié)果顯示Qasis HLB SPE的凈化效果與回收率都要好于蛋白沉淀氮吹法，且不易造成交叉污染。

洗脫液的考察，由于甲醇容易將磷脂等洗脫下來，因此選擇以不同濃度梯度（100%、80%、60%）的乙腈水溶液進(jìn)行洗脫，結(jié)果顯示乙腈溶液的有機(jī)相比例過高會(huì)產(chǎn)生溶劑效應(yīng)，60%乙腈的效果最佳，既保證了抗生素有較高的回收率，又能去除溶劑效應(yīng)。

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證 方法學(xué)驗(yàn)證參考《化學(xué)藥物臨床藥代動(dòng)力學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則》2014年第4號(hào)通告進(jìn)行評(píng)估。

2.4.1 特異性 考察6個(gè)不同個(gè)體的空白生物樣品色譜圖（圖1），以及空白生物樣品外加對(duì)照物質(zhì)色譜圖（圖2）。結(jié)果表明空白血液的基質(zhì)構(gòu)成不干擾目標(biāo)抗生素的測(cè)定。

2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量范圍 標(biāo)準(zhǔn)曲線的配置，將抗生素標(biāo)準(zhǔn)品分別用水或甲醇溶解成1mg／ml的溶液，然后配置成相應(yīng)質(zhì)量濃度的混標(biāo)，然后在空白血清中分別以不同質(zhì)量濃度梯度做添加，配成含全部18種抗生素系列的血清樣品。由于儀器對(duì)于每一種抗生素化合物的信號(hào)響應(yīng)值不同，各種抗生素的檢測(cè)靈敏度不同和參考相關(guān)化合物FDA限量標(biāo)準(zhǔn)為其他方法提供佐證等原因，各種抗生素的配置濃度有異同。表3為方法經(jīng)最終優(yōu)化后的標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度和定量范圍，標(biāo)準(zhǔn)曲線各濃度點(diǎn)的實(shí)測(cè)值與標(biāo)示值之間的偏差在可接受的范圍之內(nèi)，最低濃度點(diǎn)的偏差在±20%以內(nèi)，其余濃度點(diǎn)的偏差在±15%以內(nèi)。

表3 18種抗生素的標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度和定量范圍

2.4.3 準(zhǔn)確度與精密度 連續(xù)3天選取分析批次，選定標(biāo)準(zhǔn)曲線的STD2、STD4、和STD6添加到空白血清作為高、中、低3個(gè)濃度的質(zhì)控樣品，各做5次重復(fù)，統(tǒng)計(jì)回收率范圍與偏差度見表4。

表4 18中目標(biāo)抗生素的回收率范圍統(tǒng)計(jì)

3 結(jié)論與探討

本研究參考環(huán)境、食品安全、藥代動(dòng)力學(xué)研究等現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析法，并結(jié)合血液樣本采樣量少不利于不同種類抗生素多次檢測(cè)的實(shí)際情況，對(duì)于血清樣本的前處理和液相色譜、質(zhì)譜條件等進(jìn)行了優(yōu)化，建立了血清中六大類共18種抗生素的UPLC-MS／MS分析方法，按照《化學(xué)藥物臨床藥代動(dòng)力學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則》進(jìn)行方法學(xué)確證，結(jié)果表明該方法對(duì)于18種目標(biāo)抗生素的檢測(cè)具有良好的靈敏度和穩(wěn)定性。與傳統(tǒng)的藥代動(dòng)力學(xué)研究方法相比，本研究的創(chuàng)新性在于對(duì)人體內(nèi)亞臨床劑量或更低濃度多種抗生素的同時(shí)檢測(cè)，絕大部分化合物靈敏度提高了一個(gè)數(shù)量級(jí)以上，目前臨床上尚未有一次前處理同時(shí)檢測(cè)多族類抗生素的應(yīng)用。在當(dāng)前我國(guó)環(huán)境污染尚未得到有效遏制，且人類持續(xù)暴露低劑量抗生素的危害不斷得到證實(shí)的情況下，本研究的現(xiàn)實(shí)意義在于，避免重復(fù)采樣，更符合人體內(nèi)抗生素殘留水平的監(jiān)測(cè)，對(duì)于臨床實(shí)施干預(yù)措施，減少抗生素暴露的不良影響提供數(shù)據(jù)支持。

結(jié)合中國(guó)現(xiàn)狀，低劑量抗生素除了處方類藥物之外，也存在于肉類和奶制品中。如果母親在懷孕期間食用此類食物，就會(huì)長(zhǎng)遠(yuǎn)影響孩子的行為，干預(yù)生命體早期發(fā)育。由于本研究監(jiān)測(cè)的是食源性抗生素導(dǎo)致的孕產(chǎn)婦體內(nèi)低劑量抗生素的持續(xù)性暴露水平，進(jìn)而研究對(duì)于生命早期嬰幼兒發(fā)育的影響，因此目標(biāo)化合物取自文獻(xiàn)或時(shí)事報(bào)道的環(huán)境檢測(cè)、食品安全檢測(cè)等使用和檢出量較多的抗生素種類，而并非目前臨床用藥的常用抗生素。隨著抗生素藥物種類的不斷研發(fā)與上市，本研究方法對(duì)于更多種類的抗生素檢測(cè)、臨床抗生素的聯(lián)合用藥監(jiān)測(cè)等研究的適用性將進(jìn)一步擴(kuò)大；同時(shí)由于環(huán)境污染物不僅僅是只有抗生素污染，諸如真菌毒素、農(nóng)藥殘留等都有可能通過人體的持續(xù)攝入而富集和暴露，因此本方法的建立對(duì)于其他族類、種類的多種化合物的檢測(cè)也具有一定的參考價(jià)值。我們之后研究的方向也將會(huì)在現(xiàn)有研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步建立參考方法，優(yōu)化條件，增加更多種類的目標(biāo)化合物的檢測(cè)。

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