王志偉，閆慧嬌，王曉，陳躍，林云良

(山東省分析測(cè)試中心，山東省中藥質(zhì)量控制技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南250014)

【中藥與天然活性產(chǎn)物】

氫核磁共振法測(cè)定中藥茜草中大葉茜草素和羥基茜草素的含量

王志偉，閆慧嬌，王曉，陳躍，林云良*

(山東省分析測(cè)試中心，山東省中藥質(zhì)量控制技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南250014)

綜合運(yùn)用一維和二維核磁共振波譜技術(shù)，對(duì)茜草提取物中大葉茜草素、羥基茜草素的信號(hào)進(jìn)行指認(rèn)歸屬，并建立氫核磁共振法同時(shí)測(cè)定茜草中大葉茜草素、羥基茜草素含量的方法。在綜合考慮茜草提取物的信號(hào)分離度及溶解性的基礎(chǔ)上，最終選定氘代二甲基亞砜為測(cè)試溶劑，以大葉茜草素的烯烴信號(hào)(δH5.77, H-2′)和羥基茜草素的H-3信號(hào)(δH6.67)為定量峰，以順丁烯二酸為定量?jī)?nèi)標(biāo)。該方法具有較好的穩(wěn)定性、重復(fù)性、精密度和準(zhǔn)確性，且測(cè)定結(jié)果與HPLC-UV方法所得數(shù)據(jù)基本一致。所建立的氫核磁定量方法操作簡(jiǎn)單，測(cè)試時(shí)間短，且定量過(guò)程中不需要對(duì)照品，可用于中藥茜草的質(zhì)量控制及評(píng)價(jià)。

茜草；大葉茜草素；羥基茜草素；定量氫核磁共振；質(zhì)量控制

茜草(RubiacordifoliaL.)作為常用中藥，已被《中國(guó)藥典》收錄[1]。茜草含有萘醌類、蒽醌類、三萜類等活性成分[2-3]。其中，大葉茜草素的含量較高，具有抗血小板聚集、保護(hù)神經(jīng)等功效[4-5]；而羥基茜草素與茜草質(zhì)量的優(yōu)劣存在直接的相關(guān)性[6]。因此，大葉茜草素、羥基茜草素的含量常被用于茜草的質(zhì)量評(píng)價(jià)。目前，對(duì)這兩種成分的測(cè)定多采用HPLC-UV法，存在耗時(shí)、需要標(biāo)準(zhǔn)品等缺點(diǎn)。而羥基茜草素穩(wěn)定性較差，易被氧化。因此，建立一種快速、可靠的測(cè)定茜草中大葉茜草素、羥基茜草素含量的方法具有一定的現(xiàn)實(shí)意義。

近年來(lái)，定量氫核磁共振法已被廣泛應(yīng)用于中藥材、食品、生化樣品等復(fù)雜體系中活性成分的定量分析[7-15]。2010版《中國(guó)藥典》已將該方法收錄其中。該方法用于定量分析的理論基礎(chǔ)是：在適當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)條件下，定量峰的積分面積與其質(zhì)子數(shù)成正比。當(dāng)選用合適的內(nèi)標(biāo)后，可用于目標(biāo)化合物的含量測(cè)定。該方法簡(jiǎn)單、快捷，定量分析過(guò)程中無(wú)需相應(yīng)化合物的標(biāo)準(zhǔn)品，且對(duì)測(cè)試樣品無(wú)損壞。

鑒于目前對(duì)茜草提取物中化學(xué)成分的相關(guān)核磁共振波譜學(xué)數(shù)據(jù)相對(duì)不足，對(duì)其中主要化學(xué)成分的信號(hào)歸屬的基礎(chǔ)研究工作相對(duì)缺乏等實(shí)際問(wèn)題，本研究在對(duì)茜草提取物中大葉茜草素、羥基茜草素結(jié)構(gòu)確定的基礎(chǔ)上，采用氫核磁共振建立了茜草中大葉茜草素、羥基茜草素的含量測(cè)定新方法，并對(duì)18批市售茜草樣品進(jìn)行了分析，測(cè)定結(jié)果與HPLC-UV所得數(shù)據(jù)基本一致。

1 材料與儀器

BrukerAvance III 400共振波譜儀，配備Bruker Topspin 3.2工作站(德國(guó)布魯克公司)；Varian INOVA-600核磁共振波譜儀(美國(guó)瓦里安公司)；Agilent 1100型高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫公司)；Mettler Toledo MX5 電子分析天平(梅特勒-托利多公司)。

大葉茜草素(質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.0%，批號(hào)110884-201405)、羥基茜草素(質(zhì)量分?jǐn)?shù)86.7%，批號(hào)111898-201102)標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；順丁烯二酸(質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.0%，批號(hào)30318)，德國(guó)奧格斯堡；DMSO-d6(氘代純度，摩爾分?jǐn)?shù)99.9%)，Cambridge Isotope Laboratories。

茜草(RC-1～RC-18)購(gòu)自各地藥店，共計(jì)18批，所有樣品均經(jīng)山東省分析測(cè)試中心劉偉副研究員鑒定為茜草科茜草屬茜草的干燥根和根莖。

2 方法與結(jié)果

2.1 核磁共振(NMR)波譜儀參數(shù)設(shè)置

2.1.1 BrukerAvance III 400的儀器參數(shù)

zg30脈沖序列；弛豫延遲時(shí)間(d1) 為6.0 s；采樣時(shí)間為4.1 s；采樣次數(shù)為128次；譜寬為11 996 Hz；以Bruker Topspin 3.2軟件采集、處理數(shù)據(jù)。采用手動(dòng)調(diào)整相位和基線，并進(jìn)行手動(dòng)積分, 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中以四甲基硅烷信號(hào)作為參考確定化學(xué)位移標(biāo)準(zhǔn)。每個(gè)定量峰重復(fù)積分6次，取平均值。

2.1.2 Varian INOVA-600儀器參數(shù)

1H NMR的質(zhì)子共振頻率為599.78 MHz，譜寬為7 197 Hz，自由感應(yīng)衰減信號(hào)(free induction decay signal, FID)累加128次。為了對(duì)NMR信號(hào)歸屬，采集了樣品的氫-氫化學(xué)位移相關(guān)譜(1H-1H correlated spectroscopy,1H-1H COSY)，1H檢測(cè)的異核多量子相干相關(guān)譜(1H detected heteronuclear multiple-quantum coherence,1H-13C HMQC)，1H檢測(cè)的異核多鍵相關(guān)譜(1H detected heteronuclear multiple bond connectivity,1H-13C HMBC)等2D NMR譜。其中，1H-1H COSY的F2(1H)和F1(1H)維的譜寬均為7 634.3 Hz，采樣數(shù)據(jù)點(diǎn)陣t2×t1= 2 290×128，每一條FID累加8次；HMQC的F2(1H)和F1(13C)維的譜寬分別為7 634.3 Hz 和37 700.3 Hz，采樣數(shù)據(jù)點(diǎn)陣t2×t1= 2 290×128，每一條FID累加16次；HMBC的F2(1H)和F1(13C)維的譜寬分別為7 634.3 Hz 和37 700.3 Hz，采樣數(shù)據(jù)點(diǎn)陣t2×t1= 2 290×400，每一條FID累加32次。

2.2 色譜條件

色譜柱為ThermoAcclaimTM120 C18(4.6 mm×250 mm, 5 μm)，進(jìn)樣量10 μL，其他條件與《中國(guó)藥典》一致。

2.3 供試樣品的制備

2.3.1 用于茜草提取物中大葉茜草素、羥基茜草素信號(hào)歸屬的樣品制備方法

稱取4 g經(jīng)粉碎的茜草藥材于錐形瓶中，加入300 mL甲醇，在30 ℃下，超聲提取3次，每次15 min，合并后減壓回收溶劑至干，加入體積分?jǐn)?shù)為10%的鹽酸溶液、氯仿各150 mL，超聲2 min，然后在85 ℃下加熱回流30 min(重復(fù)3次)，取氯仿層，合并氯仿層，減壓回收溶劑至干，以600 μL DMSO-d6溶解，取500 μL于核磁管中，進(jìn)行1D NMR及2D NMR測(cè)試。

2.3.2 用于定量的樣品制備方法

精密稱取200 mg經(jīng)粉碎的茜草藥材于錐形瓶中，加入30 mL甲醇，在30 ℃下，超聲提取3次，每次15 min，合并后減壓回收溶劑至干，加入體積分?jǐn)?shù)為10%的鹽酸溶液、氯仿各15 mL，超聲2 min，然后在85℃下加熱回流30 min(重復(fù)3次)，取氯仿層，合并氯仿層，減壓回收溶劑至干，以600 μL DMSO-d6溶解，精密量取480 μL于核磁管中，并加入20 μL順丁烯二酸內(nèi)標(biāo)溶液(207.16 μg/mL)，進(jìn)行1H NMR測(cè)試。精密量取剩余樣品溶液100 μL，以900 μL甲醇稀釋至1 000 μL，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)后，用于HPLC-UV 分析。用于樣品測(cè)試及方法學(xué)考察的順丁烯二酸內(nèi)標(biāo)溶液的配制方法：精密稱取5.179 mg順丁烯二酸，以1 mL DMSO-d6溶解。

2.4 定量化合物的NMR數(shù)據(jù)歸屬

首先，我們通過(guò)2D NMR對(duì)茜草提取物中大葉茜草素、羥基茜草素1D NMR數(shù)據(jù)進(jìn)行了歸屬。在COSY譜中，在δH5.77的雙重峰(d, 8.4 Hz)與δH6.85的雙重峰(d, 9.0 Hz)存在相關(guān)；在HMQC譜中，該質(zhì)子與δC130.3處的叔碳信號(hào)相關(guān)；在HMBC譜中，在δH1.40處的甲基氫信號(hào)與δC130.3和δC75.3相關(guān)，通過(guò)以上信息并結(jié)合其他信號(hào)歸屬，確定δH5.77為大葉茜草素中H-2′的烯氫信號(hào)。在HMQC譜中，δH6.67處的單峰與δC110.4叔碳信號(hào)存在相關(guān)；在HMBC譜中，該氫信號(hào)與δC160.8，δC157.6，δC149.7，δC105.6處的季碳信號(hào)相關(guān)，以上信息表明δH6.67應(yīng)為羥基茜草素的H-3信號(hào)。詳細(xì)的大葉茜草素、羥基茜草素的化學(xué)位移數(shù)據(jù)見(jiàn)表1，結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。這是首次對(duì)茜草提取物中大葉茜草素、羥基茜草素的NMR數(shù)據(jù)進(jìn)行指認(rèn)歸屬。

圖1 大葉茜草素、羥基茜草素的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structures of mollugin and purpurin

化合物位置δH(J/Hz)δCHMQC1H?1HCOSYHMBC大葉茜草素1-151．9--H?82-106．0--H?1′3-112．8--H?2′4-141．2--H?1′，H?558．04(d，8．0)121．9+H?6H?767．61(t，6．6)129．4+H?5，H?7H?877．53(t，7．2)127．0+H?6，H?8H?588．19(d，8．4)123．8+H?7H?64a-127．8--H?6，H?88a-125．1--H?5，H?71′6．85(d，9．0)121．6+H?2′-2′5．77(d，8．4)130．3+H?1′H?4′/5′3′-75．3--H?4′/5′4′/5′1．40(s)27．0+-H?2′?COOCH33．91(s)53．0+--?COOCH3-170．6--?COOCH3羥基茜草素1-149．7--H?32-157．6--H?336．67(s)110．4+--4-160．8--H?358．08(d，7．8)126．9+H?6H?767．86(m)134．6+H?5H?577．81(t，7．8)134．3+H?8H?888．13(d，7．2)127．0+H?7H?69-184．0--H?810-182．6--H?54a-105．6--H?310a-133．1--H?88a-133．0--H?79a-113．0---

2.5 定量峰的確定

以DMSO-d6為1H NMR測(cè)試溶劑時(shí)，順丁烯二酸的信號(hào)峰δH6.28，大葉茜草素的烯烴信號(hào)δH5.77 (H-2′)，羥基茜草素的H-3信號(hào)δH6.67與茜草提取物中其他信號(hào)具有較好的分離度，可用于大葉茜草素、羥基茜草素的1H NMR定量。大葉茜草素、羥基茜草素標(biāo)準(zhǔn)品及茜草提取物的1H NMR譜見(jiàn)圖2。

1 大葉茜草素；2 羥基茜草素；IS 順丁烯二酸。圖2 對(duì)照品及茜草樣品 1H NMR譜圖Fig.2 The 1H NMR spectra of reference compounds and Rubiae Radix et Rhizoma extract

2.6 縱向弛豫時(shí)間T1的測(cè)定

稱取大葉茜草素0.380 mg、羥基茜草素0.260 mg、順丁烯二酸0.654 mg, 分別置于核磁管中，加入0.5 mL DMSO-d6溶解，用于1H NMR測(cè)試。縱向弛豫時(shí)間T1采用質(zhì)子反轉(zhuǎn)-恢復(fù)T1實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行測(cè)定，并用Bruker的T1計(jì)算程序計(jì)算。設(shè)定脈沖弛豫延遲時(shí)間范圍為1 ～30 s。經(jīng)測(cè)定，用于大葉茜草素、羥基茜草素定量的信號(hào)的T1值分別為1.5 s，2.0 s，順丁烯二酸烯烴信號(hào)的T1值為2.5 s。

2.7d1值的優(yōu)化

首先我們測(cè)定了大葉茜草素、羥基茜草素、順丁烯二酸定量峰的縱向弛豫時(shí)間T1值。采用90°脈沖測(cè)定樣品時(shí)，為滿足d1≥5T1max的要求，d1值最小為12.5 s，這種情況下樣品測(cè)試時(shí)間較長(zhǎng)。在確保準(zhǔn)確性的前提下，本文采用30°脈沖，考察不同d1值(1～15 s，1 s間隔)對(duì)大葉茜草素、順丁烯二酸定量信號(hào)積分面積的影響。結(jié)果表明，與90°脈沖，d1值為15 s時(shí)測(cè)定的積分值(積分面積完全反映該信號(hào)的質(zhì)子數(shù))相比較，采用30°脈沖，d1值為6 s時(shí)可以達(dá)到99.1%的“回收率”，大大縮短了樣品的測(cè)定時(shí)間。因此，經(jīng)優(yōu)化后采用的儀器測(cè)定參數(shù)為30°脈沖，d1值6 s，128次掃描，采樣時(shí)間為4.1 s。

2.8 準(zhǔn)確性考察

精密稱取大葉茜草素4.978 mg，羥基茜草素3.575 mg，以1 000 μL DMSO-d6溶解后，分別精密量取400 、200 、100 、50 、25 、12.5 、6.3 μL置于核磁管中，各加入20 μL順丁烯二酸內(nèi)標(biāo)溶液，分別加入80 、280 、380 、430 、455 、467.5 、473.7 μL DMSO-d6后進(jìn)行1H NMR測(cè)定。以理論濃度為橫坐標(biāo)，以實(shí)測(cè)濃度為縱坐標(biāo)，進(jìn)行回歸分析。信噪比3和10時(shí)分別為最低檢測(cè)限和最低定量限。如圖3所示，大葉茜草素公式為y=0.967x+0.025，羥基茜草素公式為y=0.967x+0.009，實(shí)測(cè)值與理論值基本一致，相關(guān)系數(shù)分別為0.999 9, 1.000 0,結(jié)果表明該方法具有較好的準(zhǔn)確性。大葉茜草素最低檢測(cè)限和最低定量限分別為7.59 μg/mL、22.76 μg/mL；羥基茜草素最低檢測(cè)限和最低定量限分別為10.52 μg/mL、31.56 μg/mL。

圖3 大葉茜草素、羥基茜草素標(biāo)準(zhǔn)溶液理論濃度與測(cè)定濃度回歸分析圖Fig.3 Relationships between mollugin and purpurin concentrations determined by quantitative 1H NMR and the theoretical concentrations

2.9 精密度試驗(yàn)

取含大葉茜草素3.982 mg/mL、羥基茜草素2.846 mg/mL、順丁烯二酸207.16 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)測(cè)試6次，連續(xù)測(cè)試3 d，分別考察儀器日內(nèi)和日間精密度，結(jié)果顯示以積分面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)大葉茜草素、羥基茜草素的日內(nèi)精密度分別為0.8%，0.7%,日間精密度分別為0.8%，1.2%,說(shuō)明儀器精密度良好。

2.10 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一樣品6份(RC-18)，按照2.3.2項(xiàng)方法平行制備供試品溶液，按2.1.1項(xiàng)設(shè)置NMR儀器參數(shù)。大葉茜草素、羥基茜草素積分面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為3.5%，1.7%，表明重復(fù)性良好。

2.11 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取含大葉茜草素、羥基茜草素、順丁烯二酸分別為3.982 、2.846 、207.16 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，每2 h進(jìn)行一次1H NMR測(cè)試，連續(xù)測(cè)定24 h。經(jīng)測(cè)定，大葉茜草素、羥基茜草素積分面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.4%，1.6%,表明供試樣品24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.12 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取9份已知大葉茜草素含量的RC-18樣品200 mg，分為3組，每組分別精密加入相當(dāng)于原質(zhì)量分?jǐn)?shù)50%、100%、150%的大葉茜草素標(biāo)準(zhǔn)品。按照2.3.2項(xiàng)的方法制備供試樣品，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果表明，大葉茜草素平均回收率為94.7%～103.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于3.9%。

2.13 樣品分析

利用建立的1H NMR定量方法，分析了18批各地藥店市售茜草藥材中大葉茜草素、羥基茜草素的含量，并將本方法的結(jié)果與HPLC-UV測(cè)定數(shù)據(jù)進(jìn)行了比較，如表2所示，兩種方法所得結(jié)果基本一致。

表2 茜草藥材中大葉茜草素、羥基茜草素含量(mg/g)

注：a為相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 (n= 3)。

3 討論

結(jié)果表明，各地藥店市售茜草藥材中大葉茜草素(0.62 ～10.08 mg/g)的含量較高，而羥基茜草素的含量較低(0.50 ～2.97 mg/g)，各樣品間兩化合物的含量相差較大，藥材質(zhì)量參差不齊。

本方法能同時(shí)分析中藥茜草中大葉茜草素、羥基茜草素的含量，分析時(shí)間較短，具有較好的準(zhǔn)確性和精密度，定量過(guò)程中通過(guò)選擇順丁烯二酸作為內(nèi)標(biāo)，避免使用相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品，可用于中藥茜草的質(zhì)量評(píng)價(jià)，對(duì)建立其他中藥材的氫核磁共振定量方法具有一定的指導(dǎo)意義。

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Quantitative determination of mollugin and purpurin from traditional Chinese medicine Rubiae Radix et Rhizoma by1H NMR

WANG Zhi-Wei, YAN Hui-Jiao, WANG Xiao, CHEN Yue, LIN Yun-Liang*

(Shandong Provincial Key Laboratory for TCM Quality Control Technology, Shandong Analysis and Test Center,Shandong Academy of Sciences, Jinan, 250014)

∶ The1H chemical-shift values of mollugin and purpurin in extract from Rubiae Radix et Rhizoma were assigned on the basis of 1D and 2D NMR, and a specific, simple, sensitive1H NMR method has been developed and validated for the simultaneous quantitative determination of mollugin in extract from Rubiae Radix et Rhizoma When the solvent effects on the resolution of target signals and the solubility of the crude extracts were taken into account, dimethyl sulfoxide-d6was selected as an optimal1H NMR solvent. Quantitative determination was carried out by using the signal of the olefinic proton of mollugin (δH5.77, H-2′) and H-3 of purpurin (δH6.67), which were not interfere with other signals. Maleic acid was selected as internal standard because of its stable physical and chemical properties and having simple resonance signal. The improved method possessed good stability, repeatability, precision and accuracy for the quantification of mollugin and purpurin and the determination results agreed with the data obtained by HPLC-UV method. Due to its simple operation, short test time and without any reference compound, the proposed quantitative1H NMR method can alternatively be used for the quality control of Rubiae Radix et Rhizoma.

∶Rubiae Radix et Rhizoma; mollugin; purpurin; quantitative1H NMR; quality control

10.3976/j.issn.1002-4026.2017.01.001

2016-05-09

山東省科學(xué)院青年科學(xué)基金(2014QN005)；山東省自然科學(xué)基金三院聯(lián)合基金(ZR2015YL012)

王志偉(1983—)，男，博士，研究方向?yàn)橹兴幮镔|(zhì)基礎(chǔ)及質(zhì)量控制，E-mail：wzwcpu@163.com

*通信作者，林云良。 Tel：0531-82605343；E-mail：wodekafei@126.com

R284.1

A

1002-4026(2017)02-0001-07