張莉莉 趙 威 晉 弘 王邦茂

天津醫(yī)科大學總醫(yī)院消化內(nèi)科(300052)

賁門失弛緩癥患者食管硫化氫合成酶表達的研究*

張莉莉#趙 威 晉 弘 王邦茂&

天津醫(yī)科大學總醫(yī)院消化內(nèi)科(300052)

背景：賁門失弛緩癥是一種原發(fā)性食管動力障礙性疾病，目前普遍認為其發(fā)生與抑制性神經(jīng)遞質減少有關。硫化氫為胃腸道抑制性神經(jīng)遞質之一，胱硫醚-β-合酶(CBS)和胱硫醚-γ-裂解酶(CSE)是參與其合成的關鍵酶。目的：比較CBS和CSE在賁門失弛緩癥患者與對照者食管組織中的表達差異，初步探討硫化氫與賁門失弛緩癥之間的關系。方法：納入2013年1月—2015年6月在天津醫(yī)科大學總醫(yī)院行經(jīng)口內(nèi)鏡肌切開術治療的賁門失弛緩癥患者25例，10例因食管鱗狀細胞癌行食管切除術的患者作為對照組，分別取病變和正常下食管括約肌(LES)環(huán)肌組織，行CBS、CSE免疫組化染色，以半定量法評估兩者的表達減少程度。結果：CBS、CSE免疫陽性物質主要分布于LES肌間神經(jīng)叢。與對照組相比，賁門失弛緩癥組LES組織中的CBS、CSE表達顯著減少(P均<0.05)，60.0%以上的患者幾乎或完全無表達，而對照組多為強陽性表達。結論：賁門失弛緩癥患者LES組織中硫化氫合成酶表達減少甚至缺失，提示硫化氫合成減少與賁門失弛緩癥的發(fā)生、發(fā)展之間存在關聯(lián)。

食管失弛癥； 硫化氫； 硫化氫合成酶； 免疫組織化學

賁門失弛緩癥是一種原發(fā)性食管動力障礙性疾病，以食管體部蠕動缺失和下食管括約肌(lower esophageal sphincter, LES)松弛障礙為特征。目前該病病因雖尚未明確，但普遍認為其發(fā)生與抑制性神經(jīng)遞質減少有關。與食管動力相關的抑制性神經(jīng)遞質主要包括一氧化氮(NO)和血管活性腸肽(VIP)。硫化氫(hydrogen sulfide)與NO相似，是一種氣體信號分子，且同樣在胃腸道發(fā)揮抑制性遞質作用[1]。近年來，越來越多的證據(jù)表明硫化氫可松弛胃腸道平滑肌[2-5]，并可與NO協(xié)同調節(jié)平滑肌張力[6]。由此推測內(nèi)源性硫化氫合成減少可能與賁門失弛緩癥的發(fā)生有關。

在哺乳動物組織中，內(nèi)源性硫化氫系由左旋半胱氨酸合成，胱硫醚-β-合酶(cystathionine beta-synthetase, CBS)和胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionine gamma-lyase, CSE)是參與其合成的關鍵酶。既往研究發(fā)現(xiàn)，CBS和CSE除表達于胃、小腸和結腸外[6-9]，在食管中亦有表達[10]，然而關于兩者在賁門失弛緩癥患者食管中的表達情況少見報道。本研究通過檢測、比較CBS和CSE在賁門失弛緩癥患者與對照者食管組織中的表達差異，初步探討硫化氫與賁門失弛緩癥之間的關系。

對象與方法

一、研究對象

納入2013年1月—2015年6月在天津醫(yī)科大學總 醫(yī)院行經(jīng)口內(nèi)鏡肌切開術(peroral endoscopic myotomy, POEM)治療的賁門失弛緩癥患者25例，賁門失弛緩癥均經(jīng)臨床癥狀、典型內(nèi)鏡表現(xiàn)、上消化道造影和高分辨率食管測壓確診。10例因食管鱗狀細胞癌行食管切除術的患者作為對照組。

二、方法

1. 組織標本獲?。嘿S門失弛緩癥患者獲得知情同意后行POEM治療，建立由LES至賁門的黏膜下隧道，切開環(huán)肌，使用活檢鉗于LES部位取大小約1.5 cm×0.2 cm的環(huán)肌組織。食管鱗狀細胞癌患者 術后立即于手術標本的LES部位切取大小約1.5 cm×0.2 cm的環(huán)肌組織，切取部位距腫瘤組織至少2 cm，大體和組織學表現(xiàn)均正常。標本獲取后立即置于4%甲醛溶液中固定，用于制作病理切片。

2. 硫化氫合成酶免疫組化染色：平滑肌標本常規(guī)制作石蠟切片，行CBS、CSE免疫組化染色。組織切片依次置于二甲苯和梯度濃度乙醇中脫蠟、水化，pH 6.0枸櫞酸鹽緩沖液95 ℃ 10 min，微波抗原修復，冷卻，3%過氧化氫室溫孵育10 min，蒸餾水洗，PBS浸泡，加入兔抗人CBS或CSE多克隆抗體(Santa Cruz Biotechnology, Inc.)，4 ℃過夜，PBS洗3×3 min，加入生物素化羊抗兔二抗，室溫30 min，PBS洗3×3 min，加入HRP標記的鏈霉親和素，室溫30 min，PBS洗3×3 min，加入新鮮配制的DAB顯色，水洗，蘇木精復染，吹干，封片。

評分標準：光學顯微鏡下觀察染色情況，參考既往文獻報道的免疫組化染色評分標準進行半定量評分[11-12]。將標本中的CBS、CSE表達減少程度分為四級：Ⅰ級(3分)，大量陽性細胞均勻分布在觀察視野內(nèi)，即正?；蛏倭繙p少；Ⅱ級(2分)：陽性細胞呈斑片狀分布，高倍視野下易發(fā)現(xiàn)，即明顯減少；Ⅲ級(1分)：僅有稀少或單個陽性結構，即嚴重減少；Ⅳ級(0分)：無免疫陽性反應。

三、統(tǒng)計學分析

結 果

一、一般資料

納入研究的25例行POEM治療的賁門失弛緩癥患者中，男性12例，女性13例，平均年齡43歲(23～63歲)。術前高分辨率食管測壓顯示4 s完整松弛壓(4-second integrated relaxation pressure, 4-s IRP)均值為18.5 mm Hg(16～29 mm Hg, 1 mm Hg=0.133 kPa)。根據(jù)食管動力障礙芝加哥分型(2014年3.0版)[13]，Ⅰ型賁門失弛緩癥13例，Ⅱ型10例，Ⅲ型2例。賁門失弛緩癥狀持續(xù)時間平均6年(1～20年)。吞咽困難評分平均3分(2～4分)：從1分無吞咽困難癥狀至5分唾液吞咽困難，由患者自評[14]。4例患者曾接受球囊擴張術(3例)和Heller肌切開術(1例)治療。

10例對照組患者中男性和女性各5例，平均年齡45歲(35～62歲)。兩組間性別構成和年齡差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.011,P=0.915;t=1.537,P=0.174)。

二、CBS在LES組織中的表達

免疫組化染色顯示，CBS免疫陽性物質主要分布于LES肌間神經(jīng)叢。與對照組相比，賁門失弛緩癥組LES環(huán)肌組織中的CBS表達顯著減少(χ2=19.538,P<0.001)，幾乎或完全無表達者(Ⅲ、Ⅳ級)占64.0%，強陽性表達者(Ⅰ級)僅占8.0%，而對照組80.0%為強陽性表達，未見Ⅲ、Ⅳ級表達者(表1、圖 1)。

表1 兩組LES組織中CBS表達減少程度比較 n(%)

箭頭所示為陽性染色

圖1 賁門失弛緩癥組(A)與對照組(B)LES組織中的CBS表達(免疫組化染色，×400)

三、CSE在LES組織中的表達

免疫組化染色顯示，CSE免疫陽性物質主要分布于LES肌間神經(jīng)叢。與對照組相比，賁門失弛緩癥組LES環(huán)肌組織中的CSE表達顯著減少(χ2=13.767,P=0.003)，幾乎或完全無表達者(Ⅲ、Ⅳ級)占68.0%，強陽性表達者(Ⅰ級)僅占8.0%，而對照組40.0%為強陽性表達，未見Ⅲ、Ⅳ級表達者(表2、圖2)。

表2 兩組LES組織中CSE表達減少程度比較 n(%)

討 論

食管的神經(jīng)支配主要包括腎上腺素能神經(jīng)、膽堿能神經(jīng)和非腎上腺素能非膽堿能 (non-adrenergic

箭頭所示為陽性染色

圖2 賁門失弛緩癥組(A)與對照組(B)LES組織中的CSE表達(免疫組化染色，×400)

non-cholinergic, NANC)神經(jīng)，通過分泌不同神經(jīng)遞質調節(jié)食管平滑肌運動。腸神經(jīng)元或Cajal間質細胞(interstitial cells of Cajal, ICCs)分泌的NANC神經(jīng)遞質可松弛LES并參與了食管運動的調節(jié)[15]。NANC抑制性神經(jīng)遞質主要包括NO、VIP、硫化氫等。硫化氫是繼NO和一氧化碳(CO)后發(fā)現(xiàn)的第三種氣體信號分子[1]，既往眾多研究表明其可松弛胃、結腸和小腸平滑肌[2-5]。CBS和CSE是參與內(nèi)源性硫化氫合成的關鍵酶，哺乳動物的胃、小腸、結腸中均存在兩者表達[6-9]。此外，有研究報道鮭魚食管中可見CBS免疫陽性神經(jīng)元[16]，本課題組的前期研究亦發(fā)現(xiàn)人食管平滑肌組織中存在CBS、CSE陽性神經(jīng)元[10]，由此推測硫化氫可能在調節(jié)食管運動功能方面發(fā)揮一定作用。

目前觀點認為NANC神經(jīng)分泌的抑制性神經(jīng)遞質減少致LES功能異常是賁門失弛緩癥的可能發(fā)病機制之一。研究證實，賁門失弛緩癥患者食管和LES組織中的腸神經(jīng)元和ICC數(shù)量、NO合成關鍵酶一氧化氮合酶(NOS)和VIP表達均明顯減少甚至缺失[11-12,17-18]，然而關于硫化氫合成酶在賁門失弛緩癥患者食管中表達情況的報道尚少。本研究結果顯示，硫化氫合成酶CBS和CSE在賁門失弛緩癥患者LES環(huán)肌組織中的表達較非賁門失弛緩癥患者顯著減少，60%以上的患者幾乎或完全無表達。由此推測CBS和CSE減少可能通過減少硫化氫合成而引起LES松弛不良或增加LES壓力，最終引起或加重賁門失弛緩癥狀，但此推測需進一步研究加以驗證。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)硫化氫合成酶CBS、CSE在賁門失弛緩癥患者的LES組織中表達減少甚至缺失，可能通過減少內(nèi)源性硫化氫合成而導致LES運動功能障礙，進而參與賁門失弛緩癥的發(fā)生、發(fā)展。然而，亦不能排除CBS、CSE減少系賁門失弛緩癥的結果而非原因，如亦存在賁門失弛緩癥患者腸神經(jīng)元缺失導致CBS、CSE減少的可能性。因此，需開展進一步的研究以明確硫化氫與賁門失弛緩癥之間的關系，從而為該病提供新的治療方向。

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(2016-07-13收稿；2016-08-20修回)

Study on Expressions of Hydrogen Sulfide-producing Enzymes in Esophagus of Patients with Achalasia

ZHANGLili,ZHAOWei,JINHong,WANGBangmao.

DepartmentofGastroenterology,TianjinMedicalUniversityGeneralHospital,Tianjin(300052)

WANG Bangmao, Email: gi.tmuh@sohu.com

Esophageal Achalasia; Hydrogen Sulfide; Hydrogen Sulfide-Producing Enzymes; Immunohistochemistry

10.3969/j.issn.1008-7125.2017.02.005

國家自然科學基金(81370492)

#Email: lili724916@163.com

&本文通信作者，Email: gi.tmuh@sohu.com

Background: Achalasia is a primary esophageal motility disorder. It has been widely accepted that the occurrence of achalasia is associated with reduction of inhibitory neurotransmitters. Hydrogen sulfide, which is known as a gastrointestinal inhibitory neurotransmitter, is produced endogenously from L-cysteine mainly via cystathionine beta-synthetase (CBS) and cystathionine gamma-lyase (CSE). Aims: To explore the relationship between hydrogen sulfide and achalasia by comparing the expressions of CBS and CSE in esophagus of patients with achalasia and the control subjects. Methods: Twenty-five achalasia patients undergoing peroral endoscopic myotomy from Jan. 2013 to Jun. 2015 at the Tianjin Medical University General Hospital were enrolled. Circular muscle samples in lower esophageal sphincter (LES) were obtained for detection of CBS and CSE immunohistochemically, and normal LES circular muscle samples from 10 patients with esophageal squamous carcinoma were served as controls. Reductions of CBS and CSE were evaluated semi-quantitatively. Results: Immunoreactivities for CBS and CSE were observed mainly in myenteric nerve plexus of LES. Compared with control subjects, expressions of CBS and CSE in LES of achalasia patients were significantly reduced (Pall <0.05). More than 60% of the achalasia patients revealed severe reduction to complete loss of CBS and CSE immunoreactivities, whereas most of the control subjects were strongly positive for these two enzymes. Conclusions: Hydrogen sulfide-producing enzymes are significantly reduced and even absent in LES of patients with achalasia, which indicates that there exists a correlation between reduced hydrogen sulfide synthesis and achalasia.