狄伶

上海交通大學(xué) 分析測(cè)試中心，上海200240

Leica SP8 STED 3X激光掃描共聚焦顯微鏡的使用研究

狄伶

上海交通大學(xué) 分析測(cè)試中心，上海200240

本文主要介紹上海交通大學(xué)分析測(cè)試中心配置的Leica SP8 STED 3X激光掃描共聚焦顯微鏡的組成、技術(shù)參數(shù)和工作原理，它在Leica TCS SP8共聚焦顯微鏡基礎(chǔ)上搭載了超分辨模塊、活細(xì)胞工作站和雙光子模塊，既可以開(kāi)展納米水平的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué)的研究，也可以觀察活細(xì)胞中亞細(xì)胞器的運(yùn)動(dòng)特性及變化，是一個(gè)具備多種檢測(cè)功能的超高分辨共聚焦顯微系統(tǒng)。超高分辨率熒光顯微技術(shù)主要包括基于調(diào)制照明光斑以縮小系統(tǒng)的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的超分辨技術(shù)和基于單分子定位的超分辨技術(shù)。同時(shí)也簡(jiǎn)述了樣品的制備方法和圖像采集的參數(shù)設(shè)置原則，以及日常維護(hù)和管理，具有臨床借鑒意義。

激光掃描；Leica SP8 STED 3X；圖像采集；共聚焦；顯微鏡

引言

激光掃描共聚焦顯微鏡（Laser Scanning Confocal Micros cope，LSCM）是隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)和光電技術(shù)的飛速發(fā)展而誕生的新一代顯微鏡，它不僅能觀察固定的細(xì)胞和組織切片，還能對(duì)活細(xì)胞的微觀生命活動(dòng)在分子和離子水平進(jìn)行實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)觀察，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)定位、三維結(jié)構(gòu)重組、定量熒光測(cè)定和定量圖像分析，在分子細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域，尤其是神經(jīng)生物學(xué)、遺傳學(xué)、生態(tài)學(xué)和生理學(xué)等學(xué)科得到廣泛應(yīng)用[1-2]。

生命科學(xué)領(lǐng)域近年來(lái)逐漸注重動(dòng)態(tài)過(guò)程的研究，如細(xì)胞遷移、細(xì)胞內(nèi)離子成分的變化等實(shí)時(shí)生理活動(dòng)，而當(dāng)前主要可供活細(xì)胞成像的技術(shù)主要有：使用復(fù)式顯微鏡（Compound Microscope，CM）或微分干涉顯微鏡（Differential Interference Contrast Microscope，DIC）觀察細(xì)胞生長(zhǎng)等運(yùn)動(dòng)；使用熒光能量共振轉(zhuǎn)移（F?rster Resonance Energy Transfer，F(xiàn)RET）和生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移（Bioluminescence Resonance Energy Transfer，BRET）技術(shù)動(dòng)態(tài)檢測(cè)蛋白質(zhì)相互作用；使用體視顯微鏡觀察成像較大標(biāo)本；使用熒光染料或蛋白質(zhì)進(jìn)行離子成像；使用FRAP技術(shù)監(jiān)控蛋白或囊泡運(yùn)輸；使用全內(nèi)反射熒光顯微鏡（Total Internal Refection Fluorescence Microscopy，TIRFM）觀察位于或接近細(xì)胞質(zhì)膜變化；使用多光子激光顯微鏡（Multiphoton Microscopy，MPM）用于神經(jīng)生物學(xué)研究[3-6]。

在神經(jīng)生物學(xué)和遺傳發(fā)育等學(xué)科，很多亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)、細(xì)胞器、生物大分子以及細(xì)胞膜內(nèi)部的生理活動(dòng)主要發(fā)生在幾個(gè)到幾百納米水平上，而傳統(tǒng)的熒光顯微鏡無(wú)法突破衍射極限，難以進(jìn)行結(jié)構(gòu)小于200 nm的觀測(cè)，因此對(duì)超高分辨率熒光顯微技術(shù)的需求日益增長(zhǎng)。目前的超高分辨率熒光顯微技術(shù)主要分為兩類[7-12]：一類是基于調(diào)制照明光斑以縮小系統(tǒng)的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)（Point Spread Function，PSF）的超分辨技術(shù)：其代表是受激發(fā)射損耗（Stimulated Emission Depletion，STED），以及在STED基礎(chǔ)上進(jìn)一步延展的可逆飽和光熒光轉(zhuǎn)移顯微技術(shù)（Reversible Saturable Optical Fluorescence Transitions，RESOLFT）和基態(tài)損耗技術(shù)（Grand State Depletion，GSD）；另一類是基于單分子定位的超分辨技術(shù)：主要代表是光激活定位顯微技術(shù)（Photoactivated Localization Microscopy，PALM）、隨機(jī)光學(xué)重建顯微技術(shù)（Stochastic Optical Reconstruction Microscopy，STORM）以及熒光活化定位顯微技術(shù)（Fluorescence Photo Activated Localization Microscopy，fPALM）。除了這兩類主流超分辨技術(shù)，還有一類重要的活細(xì)胞超分辨技術(shù)，它是基于結(jié)構(gòu)照明原理的結(jié)構(gòu)光照明顯微技術(shù)（Structured Illumination Microscopy，SIM）。這幾種超分辨技術(shù)中，STED技術(shù)是在共聚焦顯微術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的純物理超分辨技術(shù)，無(wú)需算法后期重構(gòu)，產(chǎn)生假象的可能性很??；它在光學(xué)層析能力、成像深度和速度方面也有一定優(yōu)勢(shì)；但相比其他技術(shù)，它的激發(fā)光功率較大，導(dǎo)致漂白發(fā)生的可能性較大；PALM和STORM技術(shù)在原理上都是基于熒光分子的光轉(zhuǎn)化和單分子定位，以“時(shí)間換空間”，可以獲得極高的空間分辨率，并實(shí)現(xiàn)單分子分析；但是這類技術(shù)是經(jīng)過(guò)計(jì)算得到的超高分辨圖像，成像時(shí)產(chǎn)生假象的可能性較大；SIM技術(shù)借助結(jié)構(gòu)光和圖像的重構(gòu)算法得到超高分辨圖像，并非完全意義上的超高分辨率技術(shù)，假象的概率也比較高，但它對(duì)探針的要求少，時(shí)間分辨率高、熒光光子利用率高，相對(duì)PALM、STED等技術(shù)激光功率較弱。

在此基礎(chǔ)上，市場(chǎng)上可以進(jìn)行活細(xì)胞成像的超高分辨率顯微鏡主要兩類：一類是以共聚焦為基礎(chǔ)的系統(tǒng)：主要是基于STED技術(shù)與共聚焦平臺(tái)相結(jié)合的超分辨系統(tǒng)；另一類是以SIM技術(shù)為基礎(chǔ)的系統(tǒng)：通過(guò)柵格移動(dòng)的照明模式產(chǎn)生包含樣本結(jié)構(gòu)信息的干涉圖案，進(jìn)行多次計(jì)算的超分辨系統(tǒng)。本文主要介紹上海交通大學(xué)分析測(cè)試中心配置的Leica SP8 STED 3X激光掃描共聚焦顯微鏡，它在Leica TCS SP8共聚焦顯微鏡基礎(chǔ)上搭載了超分辨模塊（STED）、活細(xì)胞工作站和雙光子模塊，既可以開(kāi)展納米水平的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué)的研究，也可以觀察活細(xì)胞中亞細(xì)胞器的運(yùn)動(dòng)特性及變化，是一個(gè)具備多種檢測(cè)功能的超高分辨共聚焦顯微系統(tǒng)。

1 Leica SP8 STED 3X的組成和技術(shù)參數(shù)

1.1 激光器

1.1.1 單光子激光器

（1）Diode，50 mW：405 nm。

（2）氬離子多線激光器，65 mW：458 nm/ 488 nm/ 514 nm。

（3）DPSS半導(dǎo)體泵浦黃綠光激光器（固體激光器），20 mW：561 nm。

（4）HeNe氣體激光器，10 mW：633 nm。

1.1.2 高分辨激光器（STED）

（1）固體激光器，1.5 W：592 nm。（2）固體激光器，660 nm。

1.1.3 雙光子激光器：IR Laser Chameleon Ultra Ⅱ：680～1080 nm。

1.2 掃描頭

（1）全視野掃描器

性能：在掃描分辨率（Format）為512 pixel×512 pixel、掃描速度1800 Hz、雙向掃描（Bidirectional X）開(kāi)啟狀態(tài)下、針孔為1 AU時(shí)幀率達(dá)到6.82 fps；最高掃描分辨率可達(dá)到8192 pixel×8192 pixel。

（2）共振掃描器8 k

性能：在掃描分辨率為512 pixel×512 pixel、掃描速度8000 Hz（快掃模式）、雙向掃描開(kāi)啟狀態(tài)下、針孔為1 AU時(shí)幀率達(dá)到27.87 fps；最高掃描分辨率為1024 pixel×1024 pixel。

1.3 熒光顯微鏡

徠卡研究級(jí)共聚焦專用DMi8電動(dòng)倒置顯微鏡（Leica TCS SP8），使用靈活性光源組件，配備6款復(fù)消色差物鏡：10×/0.45 dry、20×/0.75 dry、40×/0.60 dry、40×/1.10 water、63×/1.40 oil、100×/1.40 oil，其中40×/0.60 dry主要用于配合雙光子檢測(cè)使用，它的工作距離在3.3～1.9 mm，適合觀察厚樣本；100×/1.40 oil主要用于配合超分辨檢測(cè)。

1.4 活細(xì)胞工作站

活細(xì)胞工作站為日本東海希多公司的INUG2TF-WSKMSET型（圖1），它可以放置常規(guī)培養(yǎng)皿/孔板（35/60 mm培養(yǎng)皿、6/12/24孔板），結(jié)合可編程的TIME COURSE功能可以實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞的長(zhǎng)時(shí)追蹤，在整個(gè)過(guò)程中可以提供37 ℃恒溫培養(yǎng)和CO2/O2氣體。

1.5 操作和分析軟件

Leica SP8 STED 3X使用LAS X操作軟件，同時(shí)配備了串色分離、3D成像、共定位、MicroLab（用于FRAP、FLIP、FRET實(shí)驗(yàn)）、環(huán)境控制等功能模塊，以及用于長(zhǎng)時(shí)追蹤可編程的HCS A Single Obj Tracking SP8/ HCS A Multiwell SP8軟件模塊。

圖1 活細(xì)胞工作站

1.6 工作原理

LSCM的工作原理：以激光作為光源，通過(guò)點(diǎn)對(duì)點(diǎn)的掃描方式逐一聚焦在樣品焦平面某點(diǎn)上，該點(diǎn)所發(fā)射的熒光經(jīng)檢測(cè)針孔被光電倍增管（Photomultiplier Tube，PMT）所采集，由計(jì)算機(jī)轉(zhuǎn)化形成熒光圖像。點(diǎn)對(duì)點(diǎn)的掃描方式和針孔對(duì)非焦平面以及焦平面上的非焦點(diǎn)光斑信息的阻隔，有效提高了圖像的分辨率和清晰度。光路中的掃描系統(tǒng)不僅可以在樣品焦平面上掃描，還可以沿Z軸上下移動(dòng)形成新的共焦平面，由此得到不同層面連續(xù)的光切圖像，形成三維圖像。

2 激光共聚焦顯微鏡樣品制備

2.1 樣品預(yù)處理

Leica SP8 STED 3X可以觀察細(xì)胞爬片（活體或固定樣品均可）、組織切片、植物根/莖/葉/花/果/纖毛的切片、酵母或細(xì)菌、以及具有自發(fā)熒光的合成材料、膠束、自組裝小分子和金顆粒等。

（1）細(xì)胞、組織等樣品應(yīng)根據(jù)樣品種類和實(shí)驗(yàn)需求選擇不同的固定方法[13]，活細(xì)胞、較厚的組織切片或不規(guī)則的組織塊需使用共聚焦專用的培養(yǎng)皿，尤其是在使用高倍鏡時(shí)，共聚焦專用的培養(yǎng)皿可以提供更清晰的圖片；蓋玻片應(yīng)選擇厚度為0.17 mm的，最好使用共聚焦專用的蓋玻片，市售蓋玻片建議徹底清潔，可使用濃硫酸/高錳酸鉀溶液浸泡清洗；

（2）植物的根/莖/葉/花/果/纖毛等新鮮的植物組織，可以先在體視顯微鏡下剖離出待觀察的部位，再進(jìn)行顯微觀察。對(duì)于比較厚的植物組織，可根據(jù)文獻(xiàn)探索合適的透明化處理?xiàng)l件，以獲得更好的觀察；

（3）對(duì)于需要切片的細(xì)胞、組織或植物，切片的最大厚度取決于物鏡的NA值、物鏡的工作距離(Work Distance，WD)、激光的穿透力和樣品的透明度，以10×/0.4物鏡為例，厚度大約在1 mm；切片的最小厚度主要取決于物鏡的NA值、針孔大小和發(fā)射波長(zhǎng)，以配備Super Z的顯微鏡為例，其最小移動(dòng)步距是3 nm，則Z軸分辨率在350 nm。

（4）酵母等非貼壁生長(zhǎng)的微生物，需先做貼壁處理再進(jìn)行觀察。以酵母為例[14]，在皿底預(yù)先涂一層能和酵母細(xì)胞壁的多糖類物質(zhì)結(jié)合的伴刀豆蛋白溶液，再加入酵母溶液，靜置后棄去并洗去未貼壁酵母，加入PBS溶液后進(jìn)行顯微觀察，可以得到較好的圖片。其他懸浮生長(zhǎng)的微生物可根據(jù)自身特性，選擇合適的貼壁涂層材料。

（5）對(duì)于具有自發(fā)熒光的材料，不需特別的制備方法，直接滴加或放置少量樣品于蓋玻片上進(jìn)行觀察。液體或膠束可用移液槍吸取3～5 μL，靜置數(shù)分鐘后觀察，以避免視野里飄動(dòng)的樣品干擾觀察。

（6）觀察的過(guò)程中如果熒光淬滅現(xiàn)象比較嚴(yán)重，可以根據(jù)樣品的種類和特性選擇合適的抗熒光淬滅劑。

2.2 熒光染料的選擇

熒光染料是一類能發(fā)出熒光的染料，通常情況下，吸收一定波長(zhǎng)的光波后能發(fā)射出另一波長(zhǎng)大于吸收光光波的物質(zhì)，在生命領(lǐng)域主要用于示蹤。熒光染料的選擇可參考激光共聚焦顯微鏡所配的激光器，405 nm激光器可觀察DAPI、Hoechst 和Alexa-405系列染料；氬離子激光器可觀察 GFP、CFP 和 YFP 等熒光蛋白，F(xiàn)ITC、Alexa-488等染料；561 nm激光器可觀察RFP等熒光蛋白，及Rhodamine、Alexa-546、Cy3等染料；633 nm激光器可觀察Alexa-647和Cy5等染料。各大儀器公司的主頁(yè)也會(huì)有相應(yīng)的染料光譜數(shù)據(jù)以供參考。在做超分辨觀察時(shí)，如果使用技術(shù)研發(fā)團(tuán)隊(duì)自行開(kāi)發(fā)的染料，將獲得更高的成像效果和分辨率。熒光染料可以單獨(dú)使用，也可以組合使用，進(jìn)行多重標(biāo)記時(shí)，要盡量避免染料之間的串色，還要考慮各種抗體的來(lái)源，使用不同種屬來(lái)源的抗體進(jìn)行染色，并優(yōu)先選擇穩(wěn)定性和抗淬滅性強(qiáng)的染料。

3 圖像采集參數(shù)設(shè)置

3.1 掃描分辨率

（1）與物鏡NA值和檢測(cè)波長(zhǎng)有關(guān)[15]。在固定的物鏡倍率和Zoom下，掃描密度越高，即采樣點(diǎn)越多，圖像越細(xì)膩，但是速度會(huì)越慢，熒光強(qiáng)度也會(huì)越低，樣品淬滅的幾率也越大。Leica SP8 STED 3X的默認(rèn)值是512 pixel×512 pixel，一般在預(yù)覽模式下使用這個(gè)分辨率，可以方便我們更快的選擇視場(chǎng)、調(diào)制拍照的參數(shù)，也可以選擇更低的分辨率進(jìn)行預(yù)掃；在采集正式數(shù)據(jù)時(shí)可以選擇更高的分辨率以獲得更好的圖片質(zhì)量（圖2）。受限于計(jì)算機(jī)顯示屏的分辨率，通常用于發(fā)表文章的分辨率為1024 pixel×1024 pixel，因?yàn)檫@個(gè)分辨率與更高的相比直觀看去并無(wú)明顯差異。

（2）根據(jù)Nyquist-shannon采樣定律，像素點(diǎn)大小應(yīng)為物鏡XY平面分辨率的40%～50%。像素點(diǎn)隨掃描分辨率增大和Zoom的增加而減小。與高倍物鏡相比，低倍物鏡需要更高的掃描分辨率。

3.2 圖像亮度（信號(hào)強(qiáng)度）

（1）與物鏡NA值和針孔大小有關(guān)。當(dāng)NA值相同時(shí)，倍率越高，亮度越低；針孔越大，圖像越亮，但清晰度會(huì)下降，一般我們選擇針孔尺寸等于1時(shí)進(jìn)行拍照，根據(jù)樣品的實(shí)際情況再做以調(diào)整。

（2）與激發(fā)光的強(qiáng)度有關(guān)。激光強(qiáng)度越高，圖像越亮，但樣品也更容易淬滅，原則上在保證圖像質(zhì)量的前提下，激光強(qiáng)度越低越好。

（3）與接收發(fā)射熒光的帶寬有關(guān)。在熒光發(fā)射光譜范圍內(nèi)，增大采集的帶寬會(huì)使圖像更亮。

（4）與PMT有關(guān)。PMT的增大可使信號(hào)和噪音同步增強(qiáng)，在保證圖像質(zhì)量的前提下，增益（Gain）值越小越好；Gain值的正常范圍為 0～1250，我們?cè)趯?shí)際的檢測(cè)工作中，一般使其小于800；對(duì)于配備HyD檢測(cè)器（Hybrid Detector）的共聚焦顯微鏡，一般使Gain值小于100%，以避免損傷檢測(cè)器；

（5）可通過(guò)采集的平均次數(shù)來(lái)降噪。線平均（Line Average）和面平均（Frame Average）是兩種降低背景噪音的方式，可在拍照時(shí)結(jié)合樣品的情況設(shè)置平均參數(shù)，使圖像背景更干凈。

（6）可使用數(shù)碼增益和數(shù)碼降噪。對(duì)拍好的照片，使用軟件自帶的編輯功能及拖拉信號(hào)/背景工作條可以得到一定程度的背景降噪（圖3）。

此外，設(shè)置以上參數(shù)時(shí)應(yīng)避免圖像出現(xiàn)過(guò)曝和曝光不足，按LUT按鈕，在圖像優(yōu)化模式下，僅使少數(shù)點(diǎn)呈藍(lán)色（過(guò)曝），背景呈綠色，以保證圖像質(zhì)量和后期的數(shù)據(jù)分析（圖4）。

3.3 熒光的定量

由于熒光強(qiáng)度與特異性熒光標(biāo)記蛋白的表達(dá)量成正相關(guān)，因此可以通過(guò)分析熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量分析。在共聚焦軟件的Quantify模塊，Intensity工具可以針對(duì)不同通道、同一焦平面的不同感興趣域(Region of Interest，ROI)進(jìn)行熒光強(qiáng)度的量化分析，對(duì)于不同焦的數(shù)據(jù)也可以進(jìn)行分析（圖5）。

3.4 三維層切及重構(gòu)

此功能可以分層觀察并重構(gòu)整個(gè)掃描區(qū)，特殊合成的小分子或具有靶向性/特異性的物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞，通過(guò)三維重構(gòu)可以直觀的看到材料在亞細(xì)胞器不同焦面和部位的分布。

圖2 植物莖(Convallarla rhizome，樣片)切片在不同掃描分辨率下的照片

圖3 植物莖切片照片降噪(Noise Reduction)后的圖片

圖4 理想的熒光圖像

圖5 熒光定量分析

3.5 時(shí)間序列掃描

時(shí)間序列掃描多用于活細(xì)胞成像，記錄其動(dòng)態(tài)過(guò)程?？梢酝ㄟ^(guò)軟件設(shè)置拍照的頻率和拍照的采集位點(diǎn)，也可以在多個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行記錄。在活細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)觀察實(shí)驗(yàn)中，我們最久連續(xù)觀察過(guò)7 d，為了避免污染，觀察過(guò)程中沒(méi)有做換液處理。

3.6 光譜掃描

光譜掃描最常被用于進(jìn)行串色分離，因?yàn)橹参镱悩悠芬约袄淆g化較明顯的細(xì)胞會(huì)有比較嚴(yán)重的自發(fā)熒光現(xiàn)象，對(duì)有干擾的熒光使用這個(gè)功能可以得到良好的改善。此外，光譜掃描也被用于對(duì)研發(fā)的新染料進(jìn)行發(fā)射光譜的采集（圖6）。

圖6 染料的發(fā)射光譜圖

3.7 自動(dòng)拼接

對(duì)于腦片等厘米級(jí)別的生物樣本，筆者常使用自動(dòng)拼接功能，結(jié)合AFC和BEST FOCUS功能對(duì)樣本進(jìn)行掃描，最后的圖片由每一塊獨(dú)立的掃描區(qū)域拼接而成。如果樣品本身不平整或標(biāo)記不均勻，拼好的圖像會(huì)有比較明顯的圖縫間隙，可使用Zoom功能，對(duì)每個(gè)區(qū)域稍做放大，同時(shí)層掃后累加各層圖像，可以較好的改善腦片厚度不均一和熒光區(qū)域焦平面各異所導(dǎo)致的圖像明暗不均，獲得更好的數(shù)據(jù)（圖7）。

圖7 植物莖切片層掃后累加各層圖像并進(jìn)行自動(dòng)拼接拼接區(qū)域2×2

3.8 雙光子熒光成像

雙光子熒光成像技術(shù)采用長(zhǎng)波激發(fā)光，以脈沖激光的方式使兩個(gè)或多個(gè)光子同時(shí)到達(dá)被激發(fā)的電子，穿透深度比單光子更深，能實(shí)現(xiàn)組織深層次成像。原則上，采用合適的波長(zhǎng)（兩倍單光子激發(fā)波長(zhǎng)）即可達(dá)到激發(fā)條件，結(jié)合樣品的透明化處理和專用的長(zhǎng)工作距離物鏡，可以得到背景干擾低、成像深度達(dá)2～3 mm的圖像，如果進(jìn)行雙面拍攝再拼接，深度可以達(dá)到4～6 mm。Leica SP8 STED 3X配備的鏡頭是40×/0.60(WD 3.3～1.9 mm)，觀察經(jīng)透明化處理的腦塊，能得到很好的成像效果（圖8）。此外，由于雙光子的長(zhǎng)波激發(fā)能使特殊合成的小分子在特異性的波段產(chǎn)生發(fā)射光譜，部分研究材料和小分子的課題組也逐漸關(guān)注并使用雙光子成像技術(shù)。

圖8 腦塊三維重構(gòu)圖

3.9 超分辨成像

STED技術(shù)可以理解為兩束具有同軸光路的激光共同作用于一個(gè)位點(diǎn)，一束用于激發(fā)熒光物質(zhì)得到熒光(圓斑狀)，另一束環(huán)狀激光使圓斑外周部分區(qū)域受激發(fā)射(圓環(huán)狀)，中心無(wú)重合的熒光區(qū)域被采集，兩束激光重合的受激發(fā)射區(qū)域被濾光片阻擋，從而獲得了尺寸更小的光斑。這個(gè)技術(shù)通過(guò)控制環(huán)狀激光的大小，可以得到足夠小的無(wú)重合區(qū)域，再結(jié)合白激光的使用，分辨率能得到極大的提高，一般情況下XY平面分辨率可以達(dá)到50 nm以下，Z軸分辨率可到130 nm以下，獲得比常規(guī)共聚焦圖片更多的有效科學(xué)信息（圖9）。

圖9 共聚焦與使用STED技術(shù)的超分辨圖片對(duì)比

3.10 數(shù)據(jù)的后期處理及去卷積

圖像質(zhì)量主要受噪聲、散射、眩光和模糊等因素影響，其中散射和眩光是隨機(jī)發(fā)生的由光學(xué)元件和樣品本身所引起的干擾，可通過(guò)對(duì)光學(xué)元件進(jìn)行抗反射涂層處理加以改善；而噪聲和模糊是非隨機(jī)發(fā)生的干擾，由光學(xué)鏡片和信號(hào)本身或成像系統(tǒng)引起，市場(chǎng)上有多款相應(yīng)的軟件可以改善。Leica SP8 STED 3X配備的是荷蘭Scientific Volume Imaging（SVI）公司的Huygens去卷積軟件，可以有效去除非焦平面上的模糊和噪聲，增加圖片的對(duì)比度和分辨率，使圖片反映更多結(jié)構(gòu)信息。

4 激光共聚焦顯微鏡的維護(hù)和管理

4.1 日常維護(hù)注意事項(xiàng)

（1）嚴(yán)格遵守儀器的操作流程，尤其是正確的開(kāi)/關(guān)機(jī)流程，避免因操作不當(dāng)造成的儀器硬件的損壞。在關(guān)機(jī)環(huán)節(jié)，應(yīng)特別注意氬離子激光器需充分冷卻，應(yīng)等待風(fēng)機(jī)關(guān)閉后再關(guān)閉Laser Power按鈕[16]。

（2）置于顯微鏡下觀察的樣品，很多都是微小透明的，這些樣品即使出現(xiàn)在顯微鏡視野里也不易被察覺(jué)，一般鏡頭的焦距可被察覺(jué)的距離非常短，初學(xué)者很難找到焦距，因此在操作過(guò)程中，盡量在微調(diào)模式下（Fine）進(jìn)一步調(diào)焦，并且每次使用完畢做好清潔工作。載物臺(tái)、物鏡、目鏡等應(yīng)經(jīng)常用擦鏡紙蘸取清潔液擦拭。

（3）在觀察過(guò)程中，對(duì)于激光器的選擇應(yīng)根據(jù)所使用的染料，以延長(zhǎng)不必要使用的激光管的壽命。氬離子激光器建議不使用時(shí)不開(kāi)啟。

（4）如果雙光子激光器不常使用，可每月啟動(dòng)激活一次，啟動(dòng)期間保持激光器常開(kāi)，即激光開(kāi)關(guān)鑰匙在On狀態(tài)48 h再關(guān)閉。

（5）應(yīng)避免在一天中反復(fù)多次開(kāi)關(guān)機(jī)，實(shí)驗(yàn)間隙超過(guò)半小時(shí)，可將激光開(kāi)關(guān)鑰匙由On旋轉(zhuǎn)至Off，硬件和軟件系統(tǒng)保持開(kāi)啟。

（6）圖像和數(shù)據(jù)資料應(yīng)使用刻錄光驅(qū)刻錄，嚴(yán)禁使用U盤(pán)，防止電腦中毒。

（7）光學(xué)元件對(duì)環(huán)境溫濕度的要求比較高，室內(nèi)溫度應(yīng)保持在（21±2）℃，濕度 40%～60%，在雨季應(yīng)開(kāi)啟除濕機(jī)，在春夏秋季開(kāi)啟空調(diào)。

4.2 激光共聚焦顯微鏡的平臺(tái)管理

Leica SP8 STED 3X激光掃描共聚焦顯微鏡由上海交通大學(xué)分析測(cè)試中心定制的儀器共享平臺(tái)統(tǒng)籌管理。儀器的日常使用、培訓(xùn)和功能開(kāi)發(fā)等由專職技術(shù)人員完成，使用者經(jīng)過(guò)實(shí)名注冊(cè)，網(wǎng)上預(yù)約來(lái)使用儀器。這臺(tái)共聚焦顯微鏡自2016年3月投入使用以來(lái)，已服務(wù)全校7個(gè)學(xué)院24個(gè)課題組，面向的研究領(lǐng)域不僅有生命科學(xué)，還包括材料、化學(xué)、微納科學(xué)等專業(yè)，正逐漸為各領(lǐng)域?qū)W科所使用。

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本文編輯 蘇欣

Research of Using Laser Scanning Confocal Microscopy Leica SP8 STED 3X

DI Ling
Instrumental Analysis Center, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China

This paper mainly introduced the components, technical parameters, working principle of confocal laser scanning microscope Leica SP8 STED 3X equipped in the Instrumental Analysis Center of Shanghai Jiao Tong University. This microscope, based on the Leica TCS SP8 confocal microscope, is equipped with super resolution model - stimulated emission depletion, live cell station and two-photon module; it can be used to carry out nano-level sub-cellular structure and dynamics study, and can also be used to observe subcellular organelle movement characteristics and changes of living cell, is a ultra-high resolution confocal microscopy system of various detecting functions. Ultra-high resolution fuorescence microscopy includes super-resolution technology based on modulation of light spot to reduce point spread function of the system, as well as super-resolution technology based on single-molecule localization. Meanwhile, preparation method of the sample, parameter setting principle of the image capture, and the routine maintenance and management, were also discussed, which has great significance in clinical practice.

laser scanning; Leica SP8 STED 3X; image capture; confocal; microscope

TH742；TP273

A

10.3969/j.issn.1674-1633.2017.02.003

1674-1633(2017)02-0009-07

2016-11-10

科技創(chuàng)新專項(xiàng)基金（AF4040004）。

王瑾曄，教授。

通訊作者郵箱：jinyewang@sjtu.edu.cn