余鍵++呂德安++郭承亮++王世才

摘要：通過分子標(biāo)記輔助選擇，將早秈稻材料中的廣譜抗稻瘟病基因Pi2通過雜交轉(zhuǎn)入到中秈稻恢復(fù)系中，經(jīng)過多代自交以及田間農(nóng)藝性狀的選擇和自然誘發(fā)稻瘟病抗性鑒定，培育出了30個(gè)新的抗稻瘟病恢復(fù)系株系。通過對(duì)F6代抗性優(yōu)良的株系與優(yōu)良兩系不育系C815S的大量雜交組合測(cè)配，選擇出了3個(gè)高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的新雜交組合，均比對(duì)照品種豐兩優(yōu)香1號(hào)增產(chǎn)5%以上，且對(duì)稻瘟病的抗性均優(yōu)于對(duì)照品種，具有廣闊的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞：水稻（Oryza sativa L.）；稻瘟病；恢復(fù)系；Pi2基因；分子標(biāo)記輔助選擇

中圖分類號(hào)：S511；S336 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2017）01-0013-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.01.004

Developing New Restorer Lines with Pi2 Blast Resistance Gene by Molecular Marker Assistance Breeding in Rice

YU Jian1，2，L？譈 De-an1，2，GUO Cheng-liang1，2，WANG Shi-cai1，2，GENG Yue-ming1，2

（1.Hubei Provincial Seed Group Co. Ltd.， Wuhan 430206， China；

2.Key Laboratory of India Rice Breeding and Seed Technology， Ministry of Agriculture， Wuhan 430206， China）

Abstract： In this research， we used molecular marker assistance breeding （MAS） to translate broad spectrum blast resistance gene Pi2 from early indica rice into restorer lines of medium indica rice. Through inbreeding of many generations，selection of good agronomic characters and identifying of the blast resistance under blast natural incidence，30 new restorer lines with blast resistance were cultivated. 3 new combinations with high yield， good quality were obtained from combinations between good two-line C815S and F6 excellent resistance restorer lines，and yields of these 3 combinations were higher than Fengliangyouxiang No.1 by more 5%，the blast resistance was also superior than control，which had extensive application prospect.

Key words： rice （Oryza sativa L.）； blast； restorer lines； Pi2 Gene； molecular marker assistance breeding

水稻（Oryza sativa L.）稻瘟病是由子囊菌[Magnaporthe grisea （Hebert） Barrnov.]引起的真菌性病害，在全世界80多個(gè)國(guó)家和地區(qū)都有發(fā)生[1]。稻瘟病是限制水稻高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的主要因素之一，給中國(guó)水稻的產(chǎn)量帶來巨大的影響。20世紀(jì)90年代以來，中國(guó)稻瘟病的年發(fā)生面積在380萬(wàn)～400萬(wàn)hm2，造成稻谷年損失量達(dá)數(shù)億千克，嚴(yán)重時(shí)高達(dá)10億kg[2]。稻瘟病的變異性強(qiáng)，一般具有一定抗性的品種大面積推廣3～5年后就會(huì)出現(xiàn)抗性下降或喪失，給生產(chǎn)帶來極大的損失。長(zhǎng)期的實(shí)踐證明，發(fā)掘廣譜、持久和穩(wěn)定的抗稻瘟病新基因和培育新抗病性品種是亟待解決的問題，也是最經(jīng)濟(jì)有效的防治措施。

截至2013年8月，已至少報(bào)道了68個(gè)抗稻瘟病位點(diǎn)共83個(gè)主效基因。這些基因分布在除第3染色體以外的其他11條染色體上（2個(gè)隱性，其他顯性）[3]，其中第6、11、12號(hào)染色體上的抗性基因多且成簇分布[4]，是3個(gè)最大的稻瘟病抗性基因簇。廣譜抗稻瘟病基因Pi2位于第6染色體短臂近著絲粒附近[5]，對(duì)從中國(guó)收集的792個(gè)稻瘟小種中的絕大部分表現(xiàn)抗性[6]。通過分子標(biāo)記輔助選擇已經(jīng)在很多材料中得到應(yīng)用[7-9]。本研究通過雜交將早秈稻材料Z219中的抗稻瘟病基因Pi2轉(zhuǎn)入湖北省種子集團(tuán)有限公司選育的7個(gè)品質(zhì)優(yōu)、配合力強(qiáng)的恢復(fù)系中，然后通過自交、分子標(biāo)記輔助選擇和田間自然誘發(fā)抗性鑒定，選擇抗性好、農(nóng)藝性狀穩(wěn)定的株系與不育系進(jìn)行組合測(cè)配，擬在選育出含Pi2基因的新的抗稻瘟病優(yōu)質(zhì)恢復(fù)系材料。

1 材料與方法

1.1 植物材料與選育方法

供體親本：早秈稻抗稻瘟病材料Z219，含有廣譜抗稻瘟病的Pi2基因。受體親本：優(yōu)質(zhì)中秈稻材料R201、R202、R203、R204、R205、R206和R207，都為湖北省種子集團(tuán)有限公司自主選育。

從F2代開始結(jié)合分子標(biāo)記輔助選擇和表型鑒定，選擇農(nóng)藝性狀優(yōu)良、田間稻瘟病抗性良好的陽(yáng)性單株，在F5～F6代進(jìn)行稻瘟病自然誘發(fā)抗性鑒定、組合測(cè)配及組合抗性鑒定。

1.2 分子標(biāo)記輔助選擇

DNA的提取采用CTAB法；導(dǎo)入片段鑒定使用Pi2基因SSR標(biāo)記RM527的序列合成引物。PCR反應(yīng)體系總體積為20 μL，其中模板2 μL，去離子水12 μL，Buffer（10×）2 μL，Mg2+（25 mmol/L）1.8 μL，dNTP（5 mmol/L）1.8 μL，正反引物各0.2 μL，Taq酶0.2 μL。

擴(kuò)增程序：95 ℃變性4 min；95 ℃變性30 s， 55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35次循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠（PAGE）電泳，銀染檢測(cè)。

1.3 稻瘟病田間抗性鑒定

稻瘟病田間抗性鑒定設(shè)于湖北省宜昌市遠(yuǎn)安縣茍家埡鎮(zhèn)望家鄉(xiāng)以及恩施自治州白果鄉(xiāng)兩河村稻瘟病自然誘發(fā)鑒定圃，采用誘發(fā)品種和偏氮施肥及淹水保持高濕管理等措施輔助誘發(fā)。每份材料插2行，每行10株，單本插，株行距17 cm×17 cm。順序排列，無(wú)重復(fù)。每組材料設(shè)抗、感品種和生產(chǎn)主栽對(duì)照品種各1個(gè)，供試材料及鑒定圃周圍種植感病誘發(fā)品種。

葉瘟病于分蘗盛期對(duì)供試材料逐株調(diào)查發(fā)病病級(jí)，然后加權(quán)平均為發(fā)病等級(jí)；穗頸瘟病于收獲前1周內(nèi)分別調(diào)查發(fā)病率和損失率（統(tǒng)計(jì)穗數(shù)不少于100穗），分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參照湖北省水稻區(qū)域試驗(yàn)方法，即國(guó)家稻品種試驗(yàn)與審定規(guī)范《水稻抗主要病蟲鑒定及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)試行方案》。

1.4 選種、組合測(cè)配的田間種植及考種

選種種植：每個(gè)小區(qū)種植20苗，雙行區(qū)，每行10苗，單本插，密度16.7 cm×20.0 cm。記載生育期和整齊度。成熟時(shí)每個(gè)區(qū)選擇1個(gè)以上的優(yōu)良單株，收獲中選株的全部種子。

組合測(cè)配種植：每個(gè)小區(qū)3次重復(fù)，30株，單本插，每行10苗，密度16.7 cm×20.0 cm，設(shè)豐兩優(yōu)香1號(hào)為中稻對(duì)照，成熟時(shí)混收每個(gè)小區(qū)的種子，測(cè)定小區(qū)產(chǎn)量，并取中間縱向的3株進(jìn)行考種，考察其農(nóng)藝性狀?？疾斓霓r(nóng)藝性狀主要包括播始?xì)v期、株高、穗長(zhǎng)、有效穗數(shù)、實(shí)粒數(shù)、空粒數(shù)、結(jié)實(shí)率、千粒重和小區(qū)產(chǎn)量等。

1.5 稻米品質(zhì)分析

根據(jù)國(guó)家優(yōu)質(zhì)稻谷標(biāo)準(zhǔn)（GB/T 17891-1999）的測(cè)定方法，對(duì)配制的雜交組合以及2個(gè)對(duì)照品種進(jìn)行稻米品質(zhì)分析，包含的指標(biāo)有糙米率、精米率、整精米率、長(zhǎng)寬比、堊白粒率、堊白度、膠稠度和直鏈淀粉含量等8個(gè)性狀。

2 結(jié)果與分析

2.1 Pi2基因的分子檢測(cè)

圖1為Pi2基因親本的分子檢測(cè)結(jié)果，所用引物為共顯性標(biāo)記RM527。由圖1可知，供體親本和受體親本之間有顯著的多態(tài)性，可以用于Pi2基因的多態(tài)性檢驗(yàn)。

圖2為R201/Z219的自交F2代分子標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果，可以看出有明顯的分離現(xiàn)象，而且3種帶型符合1∶2∶1的孟德爾遺傳規(guī)律，說明該引物可以對(duì)陽(yáng)性純合、雜合和陰性純合個(gè)體進(jìn)行準(zhǔn)確的篩選。

2.2 親本及育成株系的稻瘟病抗性

2.2.1 親本的稻瘟病抗性 2012年和2013年在湖北省宜昌市遠(yuǎn)安縣望家鄉(xiāng)、2013年在恩施兩河鄉(xiāng)對(duì)8個(gè)親本株系進(jìn)行了2年3點(diǎn)的稻瘟病田間自然誘發(fā)抗性鑒定。由表1可知，供體親本Z219的葉瘟病病級(jí)、穗頸瘟發(fā)病率和穗頸瘟損失率在2012年遠(yuǎn)安和2013年恩施點(diǎn)的鑒定結(jié)果相同，達(dá)到R-MS-MR級(jí)別，都與2013年遠(yuǎn)安的鑒定結(jié)果MR-HS-HS級(jí)別有顯著差異。其他受體親本除葉瘟病級(jí)在3點(diǎn)都有差異外，穗頸瘟發(fā)病率和穗頸瘟損失率與供體親本的鑒定結(jié)果有一致的差異性。因此，認(rèn)為2012年遠(yuǎn)安和2013年恩施的鑒定結(jié)果可靠，而且以穗頸瘟發(fā)病率和穗頸瘟損失率作為抗性鑒定的標(biāo)準(zhǔn)。

2.2.2 育成株系的稻瘟病抗性 通過2012年在遠(yuǎn)安縣望家鄉(xiāng)對(duì)育成含Pi2基因的自交F5代恢復(fù)系株系進(jìn)行自然誘發(fā)稻瘟病抗性的鑒定，共篩選了19個(gè)綜合抗性為1級(jí)、44個(gè)3級(jí)的抗性株系。2013年在遠(yuǎn)安縣望家鄉(xiāng)對(duì)這63份稻瘟病綜合抗性3級(jí)及以上自交F6代恢復(fù)系株系進(jìn)行重復(fù)抗性鑒定，同時(shí)在恩施兩河鄉(xiāng)進(jìn)行異點(diǎn)的鑒定。

由表2穗頸瘟病發(fā)病率的抗病效果可知，2013年遠(yuǎn)安和恩施的抗病效果比2012年遠(yuǎn)安有明顯下降，其中恩施下降了9.52個(gè)百分點(diǎn)，遠(yuǎn)安下降了20.63個(gè)百分點(diǎn)。2013年恩施出現(xiàn)了感（S）和高感（HS）的株系，占鑒定株系數(shù)的38.10%；2013年遠(yuǎn)安出現(xiàn)的感（S）和高感（HS）的株系數(shù)達(dá)57.14%。2年3點(diǎn)的穗頸瘟發(fā)病率的抗病效果都低于30%，可能與供體親本的穗頸瘟發(fā)病率平均在感級(jí)別（S），受體親本在高感級(jí)別（HS）有關(guān)，也可能是由于部分株系未完全純合，從而出現(xiàn)分離，導(dǎo)致抗性差異。

表3為穗頸瘟損失率的抗病效果。由表3可知，2013年遠(yuǎn)安和恩施的穗頸瘟損失率的抗病效果都比2012年遠(yuǎn)安有明顯的降低，其中遠(yuǎn)安下降了14.29個(gè)百分點(diǎn)，恩施下降了25.40個(gè)百分點(diǎn)。2013年遠(yuǎn)安抗穗頸瘟病效果下降和出現(xiàn)感病株系可能與第二次重復(fù)鑒定有關(guān)，2013年恩施鑒定結(jié)果與2012年遠(yuǎn)安的差異可能與兩地自然條件不同有關(guān)。

通過表4和表5的穗頸瘟發(fā)病率和穗頸瘟損失率之間的相關(guān)關(guān)系可知，2012年遠(yuǎn)安和2013年遠(yuǎn)安、2013年遠(yuǎn)安和2013年恩施的穗頸瘟發(fā)病率之間和穗頸瘟損失率之間存在極顯著的相關(guān)關(guān)系，2012遠(yuǎn)安和2013恩施的穗頸瘟發(fā)病率之間和穗頸瘟損失率之間沒有相關(guān)性。這可能與2012年和2013年遠(yuǎn)安為同地點(diǎn)，環(huán)境相同，2013年恩施和遠(yuǎn)安為同年，氣候相差不大有關(guān)；而2013年恩施和2012年遠(yuǎn)安環(huán)境和氣候都不相同。

根據(jù)對(duì)2年3點(diǎn)的氣候和抗性結(jié)果分析，認(rèn)為2012年遠(yuǎn)安和2013年恩施的鑒定結(jié)果是比較可靠的。2013年遠(yuǎn)安鑒定田，在水稻成熟期出現(xiàn)低溫，可能對(duì)鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性具有一定的影響。表6是綜合分析2012年遠(yuǎn)安和2013年恩施的鑒定結(jié)果，選出的抗性較好的株系。這30個(gè)株系的稻瘟病抗性明顯比原來的中稻親本有所提高，在今后雜交組合選育中，可能有較好的應(yīng)用價(jià)值。

2.3 育成株系所配雜交組合的稻瘟病抗性鑒定結(jié)果

于2013年在遠(yuǎn)安縣望家鄉(xiāng)對(duì)2012年綜合抗性級(jí)別達(dá)到1（R）級(jí)的19個(gè)恢復(fù)系株系與C815S所配的雜交組合進(jìn)行田間自然誘發(fā)稻瘟病抗性鑒定。表7為所配組合抗性鑒定穗頸瘟發(fā)病率和穗頸瘟損失率的級(jí)別。由表7可知，各組合的穗頸瘟發(fā)病率絕大部分都達(dá)到了高感（HS）；各組合的穗頸瘟損失率大部分都為中感（MS），少部分為中抗（MR），都明顯低于親本恢復(fù)系株系的抗性。這可能與雜交組合的抗性是由父母本共同的基因型決定有關(guān)，由于母本不具有稻瘟病抗性，甚至高感稻瘟病，從而導(dǎo)致了雜交組合的抗性顯著下降。但與不育系C815S所配組合的穗頸瘟損失率級(jí)別都優(yōu)于對(duì)照豐兩優(yōu)香1號(hào)，絕大部分都在中感（MS）及以上，說明這些組合具有一定的穗頸瘟損失率抗性。

2.4 育成株系所配增產(chǎn)雜交組合的生育期、產(chǎn)量和主要農(nóng)藝性狀表現(xiàn)

表8為4個(gè)高產(chǎn)中稻雜交組合的生育期、產(chǎn)量和主要農(nóng)藝性狀表現(xiàn)。由表8可知，播始?xì)v期4個(gè)雜交組合都長(zhǎng)于或與對(duì)照相當(dāng)；株高都低于對(duì)照；單株有效穗數(shù)都高于對(duì)照；平均穗長(zhǎng)都短于對(duì)照；每穗總粒數(shù)除C815S/Q191-3低于對(duì)照外，其他雜交組合都高于對(duì)照；結(jié)實(shí)率和千粒重所有雜交組合都低于對(duì)照。雜交組合C815S/Q221-2-2與對(duì)照豐兩優(yōu)香1號(hào)產(chǎn)量相當(dāng)。

2.5 育成株系所配增產(chǎn)雜交組合稻米品質(zhì)表現(xiàn)

對(duì)由C815S所配的中稻雜交組合進(jìn)行稻米品質(zhì)分析，結(jié)果（表9）表明，增產(chǎn)的4個(gè)中稻雜交組合中，糙米率除C815S/Q213-2為國(guó)標(biāo)2級(jí)外，其他3個(gè)組合均為國(guó)標(biāo)1級(jí)，與對(duì)照豐兩優(yōu)香1號(hào)相當(dāng)；整精米率均低于對(duì)照，僅C815S/Q191-3達(dá)國(guó)標(biāo)3級(jí)水平；堊白粒率和堊白度均高于對(duì)照；粒型所有雜交組合均與對(duì)照相當(dāng)；直鏈淀粉含量?jī)HC815S/Q213-1達(dá)國(guó)標(biāo)3級(jí)，其他3個(gè)組合均與對(duì)照相當(dāng)；膠稠度均與對(duì)照相當(dāng)，達(dá)國(guó)標(biāo)1級(jí)水平。

3 討論

本研究旨在創(chuàng)建抗稻瘟病的新恢復(fù)系，但是并沒有選擇雙親都具有抗性的親本進(jìn)行雜交，從而聚合抗稻瘟病基因，獲得抗性更好的株系這種途徑，而是通過含有廣譜抗稻瘟病基因Pi2的早秈稻材料Z219與不含抗稻瘟病基因的優(yōu)良恢復(fù)系雜交，通過分子標(biāo)記輔助選擇含有Pi2基因的株系自交，最后獲得穩(wěn)定的新的抗病恢復(fù)系。這樣做的目的有兩點(diǎn)：一是為了育種的需要，不需要改良某個(gè)特定的恢復(fù)系的抗性，而是創(chuàng)建新的恢復(fù)系，為育種提供新材料；二是育成的新株系可以直接用于組合測(cè)配，加快了抗病雜交育種的進(jìn)程。

本研究育成的新株系分為3種類型：第一種是含有Pi2基因，但稻瘟病抗性卻差于供體親本Z219，可能原因是由于基因沒完全純合或基因的表達(dá)出現(xiàn)問題；第二種是含有Pi2基因，抗性與供體親本相當(dāng)，可能是Pi2基因的結(jié)構(gòu)沒有發(fā)生改變；第三種是含有Pi2基因，抗性優(yōu)于供體親本，可能是Pi2基因純合，然后經(jīng)過染色體的交換或重組，獲得新的未知抗稻瘟病基因或QTL位點(diǎn)。具體原因還需進(jìn)一步驗(yàn)證。

王久林等[10]認(rèn)為雜種的稻瘟病抗性與不育系和恢復(fù)系都有關(guān)，且偏向于恢復(fù)系。鄭軼等[11]認(rèn)為雜交組合的葉瘟病和穗頸瘟病抗性與母本葉瘟病均呈極顯著正相關(guān)關(guān)系，而與父本的相關(guān)性不顯著，母本的抗性越好，則配制的雜交組合抗性更好。本研究通過對(duì)C815S與育成的稻瘟病綜合抗性1級(jí)的恢復(fù)系配制的雜交組合進(jìn)行自然誘發(fā)的稻瘟病抗性鑒定，結(jié)果表明雜交組合葉瘟病抗性處于抗-中抗級(jí)別，穗頸瘟發(fā)病率為感或高感級(jí)別，穗瘟損失率為中抗-中感級(jí)別，綜合抗性中抗-中感級(jí)別，優(yōu)于對(duì)照豐兩優(yōu)香1號(hào)（感）。

水稻葉瘟病與穗頸瘟病之間的關(guān)系一直存有爭(zhēng)論，一種認(rèn)為它們之間存在著正相關(guān)關(guān)系[12-14]，另一種認(rèn)為互相之間沒有相關(guān)性，甚至是由不同的基因決定。本研究分析了2012年遠(yuǎn)安葉瘟發(fā)病率和穗頸瘟發(fā)病率之間的相關(guān)關(guān)系，結(jié)果表明葉瘟發(fā)病率和穗瘟發(fā)病率之間存在極顯著的正相關(guān)關(guān)系。但是本試驗(yàn)中大部分葉瘟病鑒定表現(xiàn)為抗病級(jí)別的株系，但穗頸瘟發(fā)病率卻表現(xiàn)為感病級(jí)別，即李樺[12]所認(rèn)為的“R，S”型，這是因?yàn)樾掠傻闹晗党樗氩徽R且呈分離特點(diǎn)導(dǎo)致的。因此，需要對(duì)育成的株系進(jìn)一步選擇、純化，以提高新育成株系整體的稻瘟病抗性水平。

本研究對(duì)兩年同點(diǎn)和同年不同點(diǎn)的鑒定結(jié)果之間進(jìn)行了相關(guān)性分析，結(jié)果表明，兩年同點(diǎn)的葉瘟病級(jí)別之間以及與其他的抗性之間沒有顯著的相關(guān)關(guān)系，同年不同點(diǎn)的結(jié)果與兩年同點(diǎn)的結(jié)果相似，說明葉瘟病在兩年同點(diǎn)和同年不同點(diǎn)之間都不具有重復(fù)性；而穗頸瘟發(fā)病率與損失率在同年不同點(diǎn)及兩年同點(diǎn)間都有顯著的相關(guān)關(guān)系，所以在品種和新株系的稻瘟病抗性鑒定時(shí)，應(yīng)以穗頸瘟發(fā)病率和損失率作為鑒定的標(biāo)準(zhǔn)，提高鑒定的準(zhǔn)確性。

4 結(jié)論

本研究通過分子標(biāo)記輔助選擇將抗稻瘟病Pi2基因轉(zhuǎn)入自育的恢復(fù)系中，育成了一批新的抗稻瘟病恢復(fù)系，通過2年3點(diǎn)的自然誘發(fā)田間抗性鑒定，獲得了30個(gè)稻瘟病抗性明顯優(yōu)于原始受體親本的新抗病恢復(fù)系，與不育系C815S測(cè)配雜交組合的抗性鑒定表明，雜交組合的稻瘟病抗性提升不明顯，但要優(yōu)于對(duì)照品種豐兩優(yōu)香1號(hào)，且產(chǎn)量、米質(zhì)方面都比對(duì)照有所提高，具有一定的應(yīng)用前景。

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