田紅林++宮海燕++馮易++沈孝云++郭童童++孫蕓

摘要：用溶劑提取法制備新疆沙棗樹葉的提取物，得到沙棗樹葉乙酸乙酯提取物、沙棗樹葉正丁醇提取物和沙棗樹葉水提取物；用體外α-葡萄糖苷酶抑制模型，對3種沙棗樹葉提取物進(jìn)行α-葡萄糖苷酶抑制活性篩選，并與陽性對照藥阿卡波糖進(jìn)行比較。采用腹腔注射四氧嘧啶構(gòu)建糖尿病動物模型，造模成功后，將糖尿病小鼠分為模型對照組、二甲雙胍處理組、新疆沙棗樹葉乙酸乙酯提取物和水提取物處理組，另設(shè)正常對照組。連續(xù)灌胃給藥18 d，每天一次，采血測空腹血糖。結(jié)果表明，新疆沙棗樹葉的3種提取物對α-葡萄糖苷酶的活性有較好的抑制作用，有2個提取物的抑制率明顯高于阿卡波糖，其中新疆沙棗樹葉乙酸乙酯提取物活性最強(qiáng)，在濃度為0.075 g/L時(shí)，其酶抑制率為76.62%。阿卡波糖及3種提取物對α-葡萄糖苷酶抑制作用的IC50分別為阿卡波糖IC50 891.38 mg/L，沙棗樹葉乙酸乙酯提取物IC50 9.28 mg/L，沙棗樹葉正丁醇提取物IC50 103.5 mg/L，沙棗樹葉水提取物IC50 73.99 mg/L。結(jié)果顯示，新疆沙棗樹葉提取物對四氧嘧啶所致糖尿病小鼠的血糖有降低的作用，和對照組比較有顯著差異（P<0.05）。新疆沙棗樹葉提取物能顯著抑制α-葡萄糖苷酶活性，對糖尿病小鼠具有降糖作用。

關(guān)鍵詞：新疆沙棗樹葉；提取物；α-葡萄糖苷酶；糖尿病小鼠

中圖分類號：R285 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）01-0103-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.01.026

The Effects of Extracts from Elaeagnus angustifolia L. Leaves of Xinjiang on Blood Glucose of Diabetic Mice

TIAN Hong-lin1，GONG Hai-yan2，F(xiàn)ENG Yi3，SHEN Xiao-yun4，GUO Tong-tong4，SUN Yun4

（1. The TCM Hospital Affiliated to XinJiang Medical University，Urumqi 830000，China；2.The Fifth Hospital Affiliated to Xinjiang Medical University，Urumqi 830000，China；3.Chengdu Medical College， Chengdu 610083，China；4.School of Traditional Chinese Medicine，Xinjiang Medical University，Urumqi 830011， China）

Abstract： Three kinds of extracts of Xinjiang Elaeagnus angustifolia L. Leaves（EAL） including EAL ethylacetate extraction，EAL normal butyl alcohol extraction and EAL water extraction were prepared by solvent extraction. The inhibitory effects of these extracts to α-glucosidase activity were investigated by in vitro enzymatic method；and akarbose was used as positive reference substance. The diabetic model were induced by peritoneal injection of alloxan. Then the diabetic mice were divided into model control group，metformin treated group，EAL ethylacetate extraction treated groups，EAL water extraction treated groups and normal control group was another one. The drugs were chronically administrated to diabetic mice once a day for 18 days. The blood glucose（GLu） were determined. The results showed that， the extracts of EAL showed obviously inhibitory action against α-glucosidase activity in which three extracts have higher effects compared to those of acarbose，among them，the extract of EAL ethylacetate extraction was more effective for enzyme inhibition with a inhibitory rate of 76.62%. The EAL IC50 of the three extracts were：Acarbose IC50 891.38 mg/L，EAL ethylacetate extraction IC50 9.28 mg/L，EAL normal butyl alcohol extraction IC50 103.5 mg/L and EAL water extraction IC50 73.99 mg/L. The result indicate that EAL extraction has the effect which can lower the level of blood sugar of tetroxide pyrimidine diabetes mice，comparing with control group，the difference is obviously（P<0.05）. Xinjiang E. angustifolia L. Leaves extracts had remarkable inhibitory effect to α-glucosidase activity. The EAL can decrease the blood glucose.

Key words： Xinjiang Elaeagnus angustifoliaon L. leafs；extract；α-glucosidase；diabetes mellitus mice

沙棗（Elaeagnus angustifolia L.）屬胡頹子科植物，維藥名為吉嘎旦，具有健脾胃、止瀉澀腸的作用[1]。沙棗在新疆是防風(fēng)林主要植物，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。沙棗葉中含有多種黃酮類化合物、阿魏酸等大量有機(jī)酸，鞣質(zhì)等[2，3]。有文獻(xiàn)報(bào)道[4]，沙棗樹葉總黃酮提取物對慢性氣管炎、腹瀉和菌痢、冠心病、心律失常等有治療作用。

糖尿病是威脅人類健康的第三大疾病，因此研究天然降血糖活性成分用以開發(fā)降血糖藥物甚至功能食品具有重要意義。本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)，新疆沙棗樹葉的總黃酮含量為（18.75±0.1106） mg/g，明顯高于沙棗樹枝和果實(shí)[5]。為此，制備新疆沙棗樹葉的不同極性提取物，采用體內(nèi)外試驗(yàn)觀察其對血糖的影響，以期為新疆沙棗樹葉的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

新疆沙棗樹葉：2015年6月采摘于新疆烏魯木齊市，于陰涼處晾干。經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)徐海燕副教授鑒定為胡頹子科（Elaeagnaceae）胡頹子屬（Elaeagnus）堅(jiān)果沙棗的干燥樹葉。陰干，密封保存。

試劑：α-葡萄糖苷酶（α-glucosidase，G5003-100UN，美國Sigma公司）；4-硝基苯-d-D-吡喃葡萄糖苷（4-N—trophenyl-α-D-glucopyranoside，PNPG，026K1516，美國Sigma公司）；阿卡波糖水合物（Acarbose，A129816-1g，德國拜耳公司）；二甲基亞砜（DMSO），四氧嘧啶Alloxan（美國Sigma公司）；鹽酸二甲雙胍片（北京京豐制藥有限公司，生產(chǎn)批號：130114）。小鼠血糖（blood glucose）酶聯(lián)免疫分析（ELISA）試劑盒（批號DGE30814，武漢基因美生物科技有限公司）。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

儀器：RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；循環(huán)水式真空泵；Coda全自動酶標(biāo)儀（法國Bio-Rad公司）；H13221型pH計(jì)（HANNA）；Exceed-cd-16型純水儀（臺灣艾柯）；電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；96微孔板。LNBROREB型電子天平（日本島津公司生產(chǎn)）；AUTOTEC-120型離心機(jī)（意大利COBA公司生產(chǎn)）；粵制00000348大鼠稱（中山市衡新電子有限公司生產(chǎn)）；ZF-型紫外分析儀（上海顧村電子儀器廠生產(chǎn)）；血糖儀（強(qiáng)生穩(wěn)豪倍易型）。

動物：KM小鼠100只，雌雄各半，體重（20±2） g，由新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

1.2 方法

1.2.1 提取物的制備 稱取干燥的新疆沙棗樹葉50 g，分別按以下提取流程制備提取物：沙棗樹葉用石油醚脫脂后，其濾渣依次用乙酸乙酯和正丁醇索氏提取、水回流提取，過濾減壓濃縮，干燥，得到沙棗樹葉乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物和水提物，備用。

1.2.2 新疆沙棗樹葉提取物對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用[6]

1）相關(guān)溶液的配制[7，8]。

0.1 mmol/L磷酸鹽緩沖液（PBS）：KH2PO4 4.599 g，K2HPO4·3H2O 7.646 g，用蒸餾水定容至500 mL，調(diào)節(jié)pH至6.8。

酶溶液：用0.1 mmol/L的PBS配制成0.2 U/mL α-葡萄糖苷酶溶液。

底物溶液：用0.1 mmol/L的PBS配制成2.5 mmol/L PNPG溶液。

終止溶液（0.2 mol/L Na2CO3溶液）：Na2CO3 2.119 8 g定容至100 mL。

2）α-葡萄糖苷酶活力測定與標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。酶活力測定：在96微孔板上進(jìn)行，反應(yīng)體系參照文獻(xiàn)[9]的方法，112 μL磷酸鹽緩沖液（pH 6.8），加入0.2 U/mL α-葡萄糖苷酶溶液20 μL，DMSO 8 μL，37 ℃恒溫15 min后加入2.5 mmol/L PNPG 溶液20 μL，37 ℃恒溫反應(yīng)15 min。再加入0.2 mol/L的Na2CO3溶液80 μL，于405 nm波長下測A值。

酶活力單位定義：37 ℃，pH 6.8條件下，每1 min水解底物產(chǎn)生1 μmol/L對硝基苯酚的酶量，定義為1個酶活力單位（U）。

標(biāo)準(zhǔn)曲線制作根據(jù)采用的反應(yīng)體系，用磷酸鹽緩沖液（pH 6.8）配制1 000 μmol/L PNP，稀釋成400、300、200、150、100、50、0 μmol/L。分別取7種不同濃度的PNP溶液各160 μL，加入0.2 mol/L Na2CO3的水溶液80 μL混勻，在405 nm下測定A值，測6組取平均值。以A為縱坐標(biāo)，對硝基苯酚濃度為橫坐標(biāo)，得標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3）測定α-葡萄糖苷酶抑制活性的反應(yīng)體系方法[10]。抑制劑活力單位定義為：pH 6.8，37 ℃時(shí)使一個酶活力單位失活為一個抑制劑活力單位。

抑制率=（抑制劑活力/酶活力）×100%

測定組：將pH 6.8的磷酸鹽緩沖液112 μL，加入0.2 U/mL α-葡萄糖苷酶溶液20 μL，抑制劑8 μL（待測目標(biāo)產(chǎn)物）溶液，在37 ℃下保溫15 min。加入20 μL PNPG溶液，在37℃下保溫15 min后，再加入0.2 mol/L的Na2CO3溶液，水溶液80 μL，于405 nm波長下測A值，為Ati（表1）。

體系空白組：相對于測定組不加抑制劑和α-葡萄糖苷酶，用蒸餾水作空白，為Ab。

未加抑制劑測試組：相對于測定組不加抑制劑，為Ato。

未加酶空白組：相對于測定組不加α-葡萄糖苷酶，為Abi。

按下式計(jì)算目標(biāo)化合物（抑制劑）對α-葡萄糖苷酶活性的抑制率。

抑制率=（△A-△AEi）/△A×100%

式中，△A=未加酶抑制劑與底物反應(yīng)后的吸光度變化值（Ato-Ab）；△AEi=加入酶抑制劑后與底物反應(yīng)后的吸光度變化值（Ati-Abi）。

4）新疆沙棗樹葉提取物對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用。按照上述方法，測定新疆沙棗樹葉3種提取物對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用。

1.2.3 對四氧嘧啶所致糖尿病小鼠血糖的影響[11-13]

1）糖尿病小鼠模型的制備。取健康KM小鼠100只，18～20 g，雌雄各半，先適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，禁食不禁水12 h，將四氧嘧啶用生理鹽水配制成2%濃度，按照220 mg/kg劑量分3次腹腔注射。3 d后測定血糖，選擇血糖在11.4～20.0 mmol/L的定為高血糖造模成功組。

2）新疆沙棗樹葉提取物對四氧嘧啶致糖尿病小鼠空腹血糖的影響。取造模成功KM小鼠50只，分為空白組、模型組、陽性藥對照組、沙棗樹葉水提取物組、沙棗樹葉乙酸乙酯提取物組，共5組，陽性對照組、新疆沙棗樹葉水提取物組和乙酸乙酯提取物組分別灌喂鹽酸二甲雙胍片、新疆沙棗樹葉水提取物和乙酸乙酯提取物的0.5% CMC-Na溶液?？瞻捉M和模型對照組給予蒸餾水。每日給藥1次，連續(xù)給藥18 d。末次給藥前禁食不禁水12 h，末次給藥后2 h，眼眶取血，采用酶聯(lián)免疫分析（ELISA）試劑盒測定小鼠空腹血糖。

3）數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 新疆沙棗樹葉提取物對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用

2.1.1 α-葡萄糖苷酶活力測定與標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 以A為縱坐標(biāo)，對硝基苯酚濃度為橫坐標(biāo)，得標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=0.006 9x+0.019 2（r=0.999 8）。

2.1.2 新疆沙棗樹葉提取物對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用 試驗(yàn)結(jié)果見表2。從表2可知，新疆沙棗樹葉3種提取物及阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶的活性均有抑制作用。其中沙棗樹葉乙酸乙酯提取物的抑制率最高可達(dá)76.62%。阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶的抑制作用隨著濃度的增加呈上升趨勢，存在比較好的量效關(guān)系。當(dāng)正丁醇提取物的濃度低于0.10 g/L時(shí)，乙酸乙酯提取物濃度低于0.005 0 g/L時(shí)，其抑制率變?yōu)樨?fù)值，即可能在濃度比較低時(shí)，沙棗樹葉正丁醇提取物和沙棗樹葉乙酸乙酯提取物的抑制作用轉(zhuǎn)化為促進(jìn)作用。

2.2 新疆沙棗樹葉提取物對四氧嘧啶所致糖尿病小鼠血糖的影響

2.2.1 行為學(xué)觀察 KM小鼠腹腔注射3次四氧嘧啶后，出現(xiàn)明顯的多飲、多食、多尿等現(xiàn)象，測定空腹血糖值明顯高于正常值，說明造模成功。

2.2.2 新疆沙棗樹葉提取物對四氧嘧啶致糖尿病小鼠空腹血糖的影響 試驗(yàn)結(jié)果見表3。由表3可知，與模型對照組相比，空白對照組有極顯著差異（P<0.01）；陽性對照組可極顯著降低小鼠血糖濃度（P<0.01）；沙棗樹葉水提取物組和乙酸乙酯提取物組均可顯著降低小鼠血糖濃度（P<0.05）。

3 小結(jié)

新疆沙棗是具有廣闊應(yīng)用前景和研究價(jià)值的品種。由于本試驗(yàn)的新疆沙棗樹葉提取物中含有大量的脂溶性成分，因此采用DMSO進(jìn)行溶解，經(jīng)試驗(yàn)確定，當(dāng)DMSO所占反應(yīng)體系的體積百分?jǐn)?shù)小于1%時(shí)不會對α-葡萄糖苷酶產(chǎn)生抑制作用。

α-葡萄糖苷酶活力隨溫度、pH改變會有較大變化，且不同批次之間也有差異，因此試驗(yàn)前應(yīng)先測定酶活力。

四氧嘧啶所致糖尿病小鼠造模過程中，發(fā)現(xiàn)使用含有4個結(jié)晶水的四氧嘧啶，小鼠血糖始終無法達(dá)到糖尿病的造模要求。在連續(xù)造模兩次失敗之后，改用含有1個結(jié)晶水的四氧嘧啶，其造模效果與文獻(xiàn)報(bào)道一致[11]。

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