薛晶晶, 陳松筆

(中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶作物品種資源研究所/農(nóng)業(yè)部木薯種質資源保護與利用重點實驗室，海南 儋州 571737)

木薯環(huán)指蛋白基因MeRFP8克隆及表達

薛晶晶, 陳松筆

(中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶作物品種資源研究所/農(nóng)業(yè)部木薯種質資源保護與利用重點實驗室，海南 儋州 571737)

采用RT-PCR方法，首次從木薯華南8號(SC8)克隆一個環(huán)指蛋白RFP基因家族成員MeRFP8.該基因cDNA包含1 059 bp的開放閱讀框，編碼一個由352個氨基酸殘基組成的蛋白質.該蛋白質分子質量為39.23 ku，理論等電點為4.84，C末端含有保守的結構域RING finger domain (Ring-H2 zinc finger)，屬于C3H2C3型環(huán)指蛋白.利用實時熒光定量PCR分析MeRFP8基因在木薯SC8及其同源四倍體葉片的表達水平，結果顯示：5 ℃低溫脅迫24 h內(nèi)，SC8和其四倍體MeRFP8基因先下調表達，后上調表達，呈“V”字型.而且MeRFP8基因在SC8的表達變化水平比其同源四倍體大.推測MeRFP8基因可能參與木薯的低溫響應.

木薯; 環(huán)脂蛋白;MeRFP8; 基因克隆; 冷脅迫

環(huán)境脅迫如高溫、低溫、干旱以及鹽脅迫等對植物生長，發(fā)育以及生物產(chǎn)量和品質特性產(chǎn)生很大影響[1,2].為響應環(huán)境脅迫，植物會促使某些生理機制和代謝通路發(fā)生改變，以適應新的環(huán)境變化[3,4].許多轉錄因子，如AP2/EREBP，bZIP，WARKY，MYB和一些鋅指蛋白，已有報道在植物應對環(huán)境脅迫中起著重要作用[5].

鋅指蛋白是真核生物中較豐富的一類蛋白質，在生物體生長發(fā)育的各個階段起著重要作用，包括激活轉錄，調控細胞凋亡，蛋白質折疊和組裝等[6].環(huán)指蛋白(ring finger protein, RFP)是一類特殊的鋅指蛋白，一般包含40～60殘基，結合2個鋅原子[7]，含有1個C-X2-C-X(9-39)-C-X(1-3)-H-X(2-3)-(N/C/H)-X2-C-X(4-48)C-X2-C的“交叉”模型；可能參與介導蛋白-蛋白互作，存在2個變種，C3HC4型和C3H2C3 (RING-H2 finger) 型，具有不同的半胱氨酸/組氨酸模式[8].含有環(huán)指特征的基因RING1[9]在16年前首次在人類中發(fā)現(xiàn)，隨后，大量含有環(huán)指特征的蛋白被報道[10]，迄今為止，環(huán)指的特定功能還不清楚.目前，許多含有環(huán)指結構的蛋白質主要參與轉錄調控和蛋白-蛋白互作等[7,11,12]，最新研究表明，大部分環(huán)指蛋白具有E3泛素連接酶活性，能特異地與E2泛素結合酶相互作用，從而促進泛素化[13]，通過泛素化降解蛋白質是植物在許多逆境信號途徑中的重要環(huán)節(jié).因此，推測環(huán)指蛋白主要對環(huán)境刺激的反應起重要作用.例如，它們參與光系統(tǒng)建成的負調控[14,15]，非生物脅迫等[16,17].研究發(fā)現(xiàn)擬南芥COP1基因編碼一個抑制光形態(tài)建成和光調控發(fā)育分子的環(huán)指蛋白[18,19]；沙蒿AdZFP1編碼環(huán)鋅指錨蛋白基因，在干旱脅迫中起重要作用[20]；擬南芥HOS1基因屬于C3HC4型環(huán)指蛋白，具有E3泛素連接酶活性，主要在低溫信號轉導中起作用[16].野生型番茄ShATL78L基因編碼C3H2C3型環(huán)指蛋白，主要在低溫脅迫下起作用，同時也對干旱、鹽、熱和滲透性應激等非生物脅迫起作用[21].馬鈴薯SbRFP1屬于C4HC4型環(huán)指蛋白，能夠在低溫脅迫下對馬鈴薯塊莖的糖分積累進行負調控[22].木薯MeRZF基因屬于C3H2C3型環(huán)指蛋白，從木薯塊根中獲得，主要在干旱脅迫中起重要作用[23].

木薯(ManihotesculentaCrantz)是大戟科(Euphorbiaceae)木薯屬(ManihotP. Mill.)的多年生植物[24,25]，原產(chǎn)南美洲熱帶，是世界三大薯類作物之一.木薯貯藏根淀粉含量在27%～34%之間，被譽為“淀粉之王”，是世界熱帶地區(qū)繼水稻、玉米、高粱之后的第四大糧食作物，為熱帶、亞熱帶近8億人口提供了基本食糧，是我國重要的工業(yè)淀粉和生物質能源原料，也是我國潛在的糧食作物[26].低溫是限制植物自然分布和栽培區(qū)域的主要因素，寒害使木薯北移擴大種植受到較大影響.因此，改良木薯品種，發(fā)掘耐寒基因，選育耐寒種質，擴大木薯北移種植面積成為木薯研究的重要方面.目前關于木薯環(huán)指蛋白基因(RFP)與低溫脅迫相關的研究還未見報道.本研究從木薯葉片中克隆了環(huán)指蛋白基因MeRFP8，研究在低溫脅迫下該基因在木薯SC8及其同源四倍體的表達水平，為開展木薯抗寒性分子標記輔助育種提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

木薯(ManihotesculentaCrantz)華南8號(SC8)及其同源四倍體組培苗，南植199(NZ199)及其同源四倍體組培苗.RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒，Dnase Ⅰ，DNA凝膠回收試劑盒購自天根公司.反轉錄試劑盒RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit購自Ferments公司.PrimeSTAR Max DNA Polymerase，實時熒光定量PCR試劑SYBR Premix Ex TaqⅡ(TliRNaseH Plus)購自大連寶生物公司.pEASY-Blunt Simple Cloning Kit購自北京全式金公司.其它生化試劑均為進口或國產(chǎn)分析純試劑.引物合成和DNA測序由Invitrogen公司完成.

1.2 方法

1.2.1 材料處理 對生長約50 d的SC8及其同源四倍體組培苗進行5 ℃低溫處理，在處理0、2、4、8和24 h后，一部分葉片用于酶活性測定；另一部分葉片經(jīng)液氮速凍后，用于RNA提取.每個處理時間進行3次重復.

對生長約50 d的NZ199及其同源四倍體組培苗進行5 ℃低溫處理，在處理0、4和8 h后，取葉片經(jīng)液氮速凍后用于RNA提取.每個處理時間進行3次重復.

1.2.2 生理指標測定 植物丙二醛(MDA)測試盒，過氧化氫(H2O2)測試盒，過氧化氫酶(CAT)測試盒，過氧化物酶(POD)測試盒均購自南京建成生物工程研究所，測試方法按照說明書進行.

表1 引物序列Table 1 List of primer sequences

1.2.3 總RNA提取與cDNA合成 木薯葉片RNA的提取參照RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒的操作說明進行，用DnaseⅠ柱上消化RNA樣品中殘留的微量DNA.cDNA第一鏈的合成參照Ferments公司試劑盒的說明書進行.

1.2.4MeRFP8基因全長cDNA擴增 從木薯低溫脅迫處理后的MSAP分析中分離到一段包含Ring-finger domain結構域的序列，將該序列比對Phytozome11中Manihotesculentav6.1(Cassava)數(shù)據(jù)庫，以比對獲得的DNA序列設計引物(表1), 采用PrimeSTAR Max DNA Polymerase進行序列的克隆.用1 μg葉片RNA，20 μL反應體系，逆轉錄合成第一鏈cDNA.全長cDNA的擴增體系含PrimeSTAR Max Premix (2×) 25 μL、RFP8-F (10 μmol·L-1) 2.5 μL、RFP8-R (10 μmol·L-1) 2.5 μL、cDNA模板0.5 μL、滅菌水補足50 μL.擴增程序為：95 ℃預變性4 min；94 ℃變性30 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸90 s、共30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min.0.8%的瓊脂糖凝膠電泳分離PCR擴增產(chǎn)物，回收純化目的條帶，克隆至pEASY-Blunt Simple Cloning Vector載體上測序.利用BLAST檢索GenBank數(shù)據(jù)庫，進行同源性分析.

1.2.5 生物信息學分析 利用DNAMAN軟件對MeRFP8全長cDNA序列進行比對分析，NCBI網(wǎng)站ORF Finder軟件進行開放閱讀框(ORF)預測，同時翻譯成蛋白序列.ProtParam軟件分析該蛋白的分子質量與等電點；NCBI在線軟件CDD分析蛋白的保守結構域；TMHMM Server v. 2.0在線軟件進行跨膜結構域分析；PSORT在線軟件對該蛋白進行亞細胞定位預測；ProtScale在線軟件預測該氨基酸序列的疏水性/親水性；SOPMA SECONDARY STRUCTURE PREDICTION METHOD在線軟件預測蛋白的二級結構.從NCBI數(shù)據(jù)庫下載其它植物的RFP蛋白序列，首先用Clustal W進行序列多重比對，再利用MEGA 4.0軟件，選擇neighbour-joining(NJ)模型，并進行1 000次bootstrap統(tǒng)計學檢驗，構建包括MeRFP8蛋白序列在內(nèi)的植物RFP蛋白的系統(tǒng)進化樹.

1.2.6 實時熒光定量PCR分析 采用Bio-Rad公司的CFX實時熒光定量PCR系統(tǒng)，實驗操作按儀器使用說明書進行.取1 μg RNA，逆轉錄合成第一鏈cDNA，稀釋10倍后作為實時定量PCR分析的模板.20 μL反應體系中，包含1 μL模板、10 μL 2×SYBR Premix、10 μmol·L-1QPCR-RFP8-F和QPCR-RFP8-R引物(表1)各0.6 μL、滅菌水補足20 μL.PCR反應程序為：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性10 s、60 ℃退火20 s、72 ℃延伸20 s、共40個循環(huán)，循環(huán)完后進行產(chǎn)物溶解曲線分析.以MeActin作為內(nèi)參基因(表1)，利用CFX manager 3.0軟件自動進行基線和Cq值分析，以2-△△Cq算法進行基因的相對定量表達.采用Duncan多重比較對對照和處理樣品的相對定量結果進行統(tǒng)計分析.

*標示終止密碼子.圖1 MeRFP8核苷酸序列和推導的氨基酸序列Fig.1 Nucleotide and derived amino acid sequences of MeRFP8

1.2.7 分析方法及數(shù)據(jù)處理 采用GraphPad Prifm 5.0軟件進行數(shù)據(jù)分析和作圖，采用SPSS 18.0軟件進行差異性等相關統(tǒng)計分析.

2 結果與分析

2.1MeRFP8基因全長cDNA克隆及蛋白質結構特性

通過RT-PCR擴增及測序，獲得MeRFP8基因編碼框序列1 059 bp，編碼352個氨基酸(圖1)，分子質量為39.23 ku，理論等電點為4.84，不穩(wěn)定系數(shù)為55.50，屬于不穩(wěn)定類蛋白.通過NCBI在線軟件CDD分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白在C末端含有植物RFP基因共有的保守結構域RING finger domain (Ring-H2 zinc finger)，屬于C3H2C3型環(huán)指蛋白.TMHMM Server v. 2.0在線軟件預測顯示，該蛋白無跨膜結構域；PSORT分析顯示，MeRFP8定位于細胞核的可能性為65.2%；ProtScale預測表明，MeRFP8蛋白屬于疏水性蛋白；SOPMA分析顯示，MeRFP8蛋白二級結構由24.72% α-螺旋、21.31%延伸鏈、7.39% β-轉角和46.59%無規(guī)則卷曲組成.

2.2MeRFP8推導的氨基酸序列比對及進化樹構建

采用DNAMAN軟件對MeRFP8推導的氨基酸序列與其它植物中的RFP蛋白序列進行比對(圖2)，結果顯示，MeRFP8蛋白序列與麻風樹RING-H2 finger protein ATL52-like (Jatrophacurcas，XP_012070295.1)、楊樹POPTR_0013s07100g (Populustrichocarpa，XP_002319229.2)、可可RING/U-box superfamily protein, putative (Theobromacacao，XP_007029812.1)、胡楊RING-H2 finger protein ATL52 (Populuseuphratica，XP_011011235.1)、甜橙hypothetical protein CISIN_1g036833mg (Citrussinensis，KDO46830.1)、金錢橘CICLE_v10031956mg (Citrusclementina，XP_006437376.1)、梅RING-H2 finger protein ATL52-like (Prunusmume，XP_008232120.1)蛋白相似性分別為60.15%、58.17%、55.20%、55.69%、53.71%、53.22%、47.52%.

下劃線表示Ring-finger domain結構域；*表示特征序列中保守的氨基酸殘基.圖2 MeRFP8推導氨基酸序列與其它植物RFP蛋白序列比對Fig.2 Amino acid alignment of MeRFP8 with RFPs from other plant species

選取NCBI數(shù)據(jù)庫中與MeRFP8蛋白較相似序列7條以及低溫響應的RFP蛋白序列4條，利用軟件MEGA 4.0構建系統(tǒng)進化樹.聚類結果顯示，木薯MeRFP8與麻瘋樹Jatrophacurcas，XP_012070295.1聚為一類，親緣關系最近(圖3).

2.3 低溫脅迫對SC8及其同源四倍體生理指標的影響

5 ℃低溫處理4 h后，SC8組培苗的葉片開始出現(xiàn)萎縮現(xiàn)象，而SC8四倍體的組培苗葉片直到24 h才出現(xiàn)局部萎縮.同時，低溫脅迫會使植物體內(nèi)產(chǎn)生大量活性氧，進而對植物細胞形成氧化脅迫傷害.CAT、POD是酶促防御系統(tǒng)中重要的保護酶，可以有效地清除膜脂過氧化物對植物造成的傷害.低溫處理下，MDA含量的變化可以作為衡量植物抗寒性的重要生理指標.

5 ℃處理下，SC8及其四倍體組培苗的MDA含量均有所增加，但是SC8增加的幅度大于其四倍體，與抗寒能力越強，MDA含量增加越慢是一致的.CAT是對H2O2分解的活力單位，5 ℃處理達到24 h時，SC8中CAT的活力達到了最大值，而SC8四倍體在整個處理過程中CAT的變化沒有顯著差異.POD的活力在整個處理過程中呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，而SC8四倍體的上升幅度大于SC8.結合5℃處理后的表型觀察，推測SC8四倍體的耐寒性比SC8強.

圖4 低溫(5 ℃)脅迫下生理指標的變化趨勢Fig.4 Variation tendency of physiological indexes under low-temperature treatments (5 ℃)

2.4MeRFP8基因表達分析

采用實時熒光定量PCR技術對MeRFP8基因在5 ℃低溫脅迫下的基因表達水平進行分析.將SC8組培苗5 ℃低溫處理24 h，結果表明，與0 h相比，MeRFP8基因在5 ℃低溫處理2 h表達量開始下降，4 h時表達水平最低，表達量是對照的0.27倍；處理8h后表達量開始上升，處理24 h后基因表達上調至最高，但表達量依然低于對照，是對照的0.6倍.而SC8同源四倍體組培苗中MeRFP8基因表達在5 ℃低溫處理4 h下調幅度達到最大，8 h后基因表達量逐漸上升，24 h時表達量與對照相同，且整個低溫處理過程中表達量變化幅度較小，沒有顯著性差異.在5個處理時間點，SC8組培苗MeRFP8基因的表達變化比四倍體明顯(圖5).

NZ199及其四倍體組培苗5 ℃低溫處理0 、4和8 h后，表達結果顯示：MeRFP8在NZ199及其四倍體中的表達趨勢與SC8一致(圖5).結合SC8及其四倍體5 ℃低溫脅迫下生理指標結果以及已報道的文獻[27,28]，即四倍體比二倍體耐寒性強，推測MeRFP8基因可能參與木薯的低溫響應.

圖5 低溫(5 ℃)脅迫下MeRFP8基因的表達Fig.5 MeRFP8 expression in response to low-temperature treatments (5 ℃)

3 討論

低溫脅迫是影響木薯生長發(fā)育和產(chǎn)量提高的重要限制性因素，培育耐低溫品種是促進木薯北移的重要手段之一.植物多倍體具有植株粗壯、葉片增大、花器官增大和抗逆性強等特點，因而倍性育種具有很大的潛在商業(yè)價值[29,30,31].An et al[32]研究表明，木薯多倍體表現(xiàn)出植株粗壯、塊根增大、葉片變厚、葉色變深，葉綠素含量和CAT、POD等酶活性均顯著優(yōu)于二倍體，在木薯耐寒育種中具有顯著優(yōu)勢.

環(huán)指蛋白是一類重要的鋅指蛋白，在應對環(huán)境刺激中起關鍵作用.木薯具有RFP特征結構的家族基因報道較少，而與低溫脅迫相關的RFP家族基因的研究還未見報道.本研究從低溫脅迫的木薯SC8組培苗中克隆到一個含C3H2C3-type Ring Finger基因MeRFP8.CDD分析顯示MeRFP8氨基酸序列具有保守結構域Ring finger motif，屬于植物RFP基因家族成員.聚類分析結果顯示，木薯MeRFP8蛋白與麻瘋樹(XP_012070295.1)蛋白聚為一類，進一步驗證了木薯與麻風樹同屬于大戟科，具有較近的親緣關系.基因表達結果顯示，SC8葉片中MeRFP8基因表達受5 ℃低溫誘導4 h時表達水平最低，表達量是對照的0.27倍；隨著處理時間的延長，表達量逐漸升高，但比對照時的表達水平低.這與硬粒小麥的低溫響應基因TdRF1[33]表達模式相似，而與擬南芥AtAIRP1[34]，玉米ZmRFP1[35]和蕪菁BrRZFP1[36]的低溫響應基因表達模式相反(表達量先升高，隨著處理時間的延長，表達量降低)；大豆GmRFP1基因在低溫脅迫時則下調表達[37].而馬鈴薯SbRFP1基因在耐低溫植株中的表達水平明顯高于低溫敏感型植株[22].本研究中MeRFP8在SC8及其同源四倍體，NZ199及其四倍體中先下調表達，后上調表達，且表達模式是一致的，但SC8中MeRFP8的表達受低溫脅迫誘導的程度比SC8四倍體強.因此，推測木薯MeRFP8可能與馬鈴薯SbRFP1基因具有相似的功能，在低溫響應中發(fā)揮作用.而從木薯塊根中克隆的木薯MeRZF(AEQ20638.1)基因[23]，也含有RING-H2 zinc finger protein特征結構，但其氨基酸序列比本研究中的MeRFP8短，兩個基因的同源性也很低，且MeRZF基因主要在干旱脅迫中起作用，推測MeRFP8和MeRZF雖然都含有RING-H2特征結構，但兩者屬于不同的家族，因此兩者的同源性較低，且對不同的逆境起主要作用.

在后續(xù)研究中，將著重分析不同逆境處理下，SC8及其同源四倍體的生理參數(shù)以及MeRFP8蛋白的活性變化，采用酵母雙雜交鑒定與MeRFP8互作的ABA和Glc信號通路；并試圖通過轉化MeRFP8活性形式驗證MeRFP8的功能，希望建立木薯低溫響應的泛素化信號途徑，為開發(fā)抗寒分子標記輔助木薯抗寒種質的選育提供依據(jù).

[1] CHINNUSAMY V, ZHU J, ZHU J-KANG. Gene regulation during cold acclimation in plants[J]. Physiol Plant, 2006,126(1):52-61.

[2] AHIN-C S, EVIK M, MOORE G A. Isolation and characterization of a novel RING-H2 finger gene induced in response to cold and drought in the interfertileCitrusrelativePoncirustrifoliata[J]. Physiol Plant, 2006,126(1):153-161.

[3] BRAY E A. Molecular responses to water deficit[J]. Plant Physiol, 1994,103(4):1 035-1 040.

[4] BOHNERT H J, NELSON D E, JENSEN R G. Adaptation to environmental stresses[J]. Plant Cell, 1995,7(7):1 099-1 111.

[5] CHEN B J, WANG Y, HU Y L, et al. Cloning and characterization of drought-inducible MYB gene fromBoeacrassifolia[J]. Plant Sci, 2005,168(2):493-500.

[6] LAITY J H, LEE B M, WRIGHT P E. Zinc finger proteins: new insights into structural and functional diversity[J]. Curr Opin Struct Biol, 2001,11(1):39-46.

[7] FREEMONT P S. The RING finger: a novel protein sequence motif related to the zinc finger[J]. Ann N Y Acad Sci, 1993,684(6):174-192.

[8] BORDEN K L B, FREEMONT P S. The RING finger domain: a recent example of a sequence-structure family[J]. Curr Opin Struct Biol, 1996,6(3):395-401.

[9] FREEMONT P S, HANSON I M, TROWSDALE J. A novel cysteine rich sequence motif[J]. Cell, 1991,64(3):483-484.

[10] FREEMONT P S. Ubiquitination: RING for destruction?[J]. Curr Biol, 2000,10(2):84-87.

[11] BORDEN K, BODDY M N, LALLY J, et al. The solution structure of the RING finger domain from the acute promyelocytic leukaemia proto-oncoprotein[J]. PML EMBO J, 1995(14):1 532-1 541.

[12] SATIJN D P, GUNSTER M J, VAN DER VLAG J, et al. RING1 is associated with the polycomb group protein complex and acts as a transcriptional repressor[J]. Mol Cell Biol, 1997,17(7):4 105-4 113.

[13] JOAZEIRO C A P, WEISSMAN A M. RING finger proteins: mediators of ubiquitin ligase activity[J]. Cell, 2000,102(5):549-552.

[14] HARDTKE C S, OKAMOTO H, STOOP-MYER C, et al. Biochemical evidence for ubiquitin ligase activity of theArabidopsisCOP1 interacting protein 8 (CIP8)[J]. Plant J, 2002,30(4):385-394.

[15] SEO H S, WATANABE E, TOKUTOMI S, et al. Photoreceptor ubiquitination by COP1 E3 ligase desensitizes phytochrome A signaling[J]. Genes Dev, 2004,18(6):617-622.

[16] LEE H, XIONG L, ZHU J K, et al. TheArabidopsisHOS1 gene negatively regulates cold signal transduction and encodes a RING finger protein that displays cold-regulated nucleocytoplasmic partitioning[J]. Genes, 2001,15(7):912-924.

[17] DONG C H, AGARWAL M, ZHU J K, et al. The negative regulator of plant cold responses, HOS1, is a RING E3 ligase that mediates the ubiquitination and degradation of ICE1[J]. Proc Natl Acad Sci, 2006,103(21):8 281-8 286.

[18] MCNELLIS T W, ARNIM A G, DENG X W. Overexpression ofArabidopsisCOP1 results in partial suppression of light mediated development: evidence for a light-inactivable repressor of photo morphogenesis[J]. Plant Cell, 1994,6(10):1 391-1 400.

[19] MCNELLIS T W, TORII K U, DENG X W. Expression of an N-terminal fragment of COP1 confer a dominant-negative effect on light-regulated seedling development inArabidopsis[J]. Plant Cell, 1996,8(9):1 491-1 503.

[20] YANG X H, SUN C, LIN Z P, et al. Molecular cloning and characterization of a gene encoding RING zinc finger ankyrin protein from drought-tolerantArtemisiadesertorum[J]. J Biosci, 2008,33(1):103-112.

[21] SONG J W, XING Y L, SHOAIB M, et al. An ATL78-like RING-H2 finger protein confers abiotic stress tolerance through interacting with RAV2 and CSN5B in tomato[J/OL]. Frontiers in Plant Science, 2016, 7 (e50785), doi: 10.3389/fpls. 01305.

[22] ZHANG H L, LIU X, LIU J, et al. A novel RING finger gene, SbRFP1, increases resistance to cold-induced sweetening of potato tubers[J]. FEBS Letters, 2013,587(6):749-755.

[23] REIS S P, TAVARES L S, COSTA C N, et al. Molecular cloning and characterization of a novel RING zinc-finger protein gene up-regulated under in vitro salt stress in cassava[J]. Mol Biol Rep, 2012,39(6):6 513-6 519.

[24] FAO. Food and agricultural organization of the United Nations (http://www.fao.org/search/zh/)[EB/OL]. Production year book, Rome, 2014.

[25] ROGERS D J. Studies onManihotesculentaCrantz (cassava) and related species[J]. Bull Torrey Bot, 1963,90(1):42-54.

[26] GU B, YAO Q Q, LI K M, et al. Change in physicochemical traits of cassava roots and starches associated with genotypes and environmental factors[J]. Starch/Starke, 2013,65(3-4):253-263.

[27] 商宏莉,郭啟高,宋明,等.生姜四倍體抗熱性與抗寒性的初步研究[J].西南農(nóng)業(yè)大學學報,2003,25(3):210-211,233.

[28] LIU S Y, CHEN S M, CHEN Y, et al.Invitroinduced tetraploid of Dendranthema nankingense (Nakai) Tzvel. shows an improved level of abiotic stress tolerance[J]. Sci Hort-Amsterdam, 2011,127(3):411-419.

[29] HUANG H P, GAO S L, CHEN L L.Invitroinduction and identification of autotetraploids ofDioscoreazingiberensis[J]. In Vitro Cell Dev Biol-Plant, 2008,44(5):448-455.

[30] GU X F, YANG A F, MENG H, et al.Invitroinduction of tetraploid plants from diploidZizyphusjujubeMill cv. Zhanhua[J]. Plant Cell Rep, 2005,24(11):671-676.

[31] ALLUM J F, BRINGLOE D H, ROBERTS A V. Chromosome doubling in aRosarugoseThunb hybrid by exposure ofinvitronodes to oryzalin the effects of node length, oryzalin concentration and exposure time[J]. Plant Cell Rep, 2007,26(11):1 977-1 984.

[32] AN F F, FAN J, CHEN S B, et al. Comparison of leaf proteomes of cassava (ManihotesculentaCrantz) cultivar NZ199 diploid and autotetraploid genotypes[J/OL]. PLOS ONE, 2014,9(4):e85991. doi:10.1371/journal.pone.0085991.

[33] GUERRA D, MASTRANGELO A M, LOPEZ-TORREJON G, et al. Identification of a protein network interacting with TdRF1, a wheat RING ubiquitin ligase with a protective role against cellular dehydration[J]. Plant Physiol, 2012,158(2):777-789.

[34] MOON Y R, SEOKKEUN C, WOO T K. TheArabidopsisC3H2C3-Type RING E3 ubiquitin ligase AtAIRP1 is a positive regulator of an abscisic acid-dependent response to drought stress[J]. Plant Physiol, 2010,154(4):1 983-1 997.

[35] XIA Z L, LIU Q J, DING J Q, et al. ZmRFP1, the putative ortholog of SDIR1, encodes a RING-H2 E3 ubiquitin ligase and responds to drought stress in an ABA-dependent manner in maize[J/OL]. Gene, 2012,495(2):146-153.

[36] JUNG Y J, LEE I H, NOU I S, et al. BrRZFP1 aBrassicarapC3HC4-type RING zinc finger protein involved in cold, salt and dehydration stress[J]. Plant Biol (Stuttg), 2013,15(2):274-283.

[37] DU Q L, CUI W Z, ZHANG C H, et al. GmRFP1 encodes a previously unknown RING-type E3 ubiquitin ligase in soybean (Glycinemax)[J]. Mol Biol Rep, 2010,37(2):685-693.

(責任編輯:吳顯達)

Cloning and expression of aMeRFP8 gene in cassava (ManihotesculentaCrantz)

XUE Jingjing, CHEN Songbi

(Tropical Crops Genetic Resources Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences/Key Laboratory of Conservation and Utilization for Cassava Germplasm Resources, Danzhou, Hainan 571737, China)

To investigate the role of ring finger protein in plant′s response to cold, a full-length cDNA sequence ofMeRFP8 was firstly cloned from cassava SC8 by RT-PCR. The results showed thatMeRFP8 gene contained a 1 065 bp open reading frame (ORF), and encoded 352 amino acid residues, with a predicted molecular mass of 39.23 ku and theoretical isoelectric points (pI) of 4.84. It had a conserved RING finger domain (Ring-H2 zinc finger) at the C-terminal region, which belonged to C3H2C3 type ring finger protein. Then expression levels ofMeRFP8 gene in cassava SC8 and its autotetraploid genotypes were analyzed using real-time RT-PCR. The results showed that the expression ofMeRFP8 in SC8 and its autotetraploid was firstly down-regulated and then up-regulated, presenting a “V” pattern during 24 h at 5 ℃. Moreover, expression level ofMeRFP8 gene was higher in SC8 than its autotetraploid. To summarize,MeRFP8 is likely to be involved in the low temperature response of cassava.

cassava; ring finger protein;MeRFP8; gene clone; cold-resistant

2015-10-22

2016-07-04

國家自然科學基金(31271776)；中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務費專項資助項目(1630032013005).

薛晶晶(1983-)，女，助理研究員，博士.研究方向：木薯基因克隆和表觀遺傳學.Email：xuetao608@163.com.通訊作者陳松筆(1966-)，男，博士，研究員.研究方向：木薯蛋白質組學.Email：songbichen@hotmail.com.

S533

A

1671-5470(2017)01-0073-08

10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2017.01.012