魏曉驍, 王士亞, 陳瀟瀟, 汪鳳林, 曹光球, 曹世江

(1.福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院;2.國(guó)家林業(yè)局杉木工程技術(shù)研究中心，福建 福州 350002)

一個(gè)新杉木纖維素合酶ClCesA基因的克隆與植物表達(dá)載體構(gòu)建

魏曉驍1,2, 王士亞1,2, 陳瀟瀟1,2, 汪鳳林1,2, 曹光球1,2, 曹世江1,2

(1.福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院;2.國(guó)家林業(yè)局杉木工程技術(shù)研究中心，福建 福州 350002)

為探索杉木木材形成的分子機(jī)制，以杉木嫩葉總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，運(yùn)用RT-PCR技術(shù)克隆出一個(gè)新杉木纖維素合酶基因ClCesA.該基因的開(kāi)放閱讀框(ORF)為2 955 bp，共編碼984個(gè)氨基酸.通過(guò)TMHMM Server v.2.0和MEGA 5.1軟件預(yù)測(cè)ClCesA蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)和功能，發(fā)現(xiàn)該蛋白N端含有鋅指結(jié)構(gòu)，共有8個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)，平均跨膜區(qū)域18個(gè)氨基酸殘基，并具有保守的DDDQXXLRW結(jié)構(gòu)域.系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果表明，ClCesA可能與細(xì)胞次生壁形成有關(guān).熒光定量PCR分析表明，ClCseA基因在杉木的不同器官(根、莖、葉)中均有表達(dá)，但在杉木根中的表達(dá)含量最高，莖中次之，葉中最低.隨后，為后續(xù)該基因功能驗(yàn)證提供基礎(chǔ)，將ClCesA克隆到含有GFP標(biāo)簽和潮霉素抗性的pGWB506載體，構(gòu)建植物過(guò)表達(dá)載體pGWB506-35S-ClCesA-GFP.

杉木; 纖維素合酶; 基因克隆; 表達(dá)分析; 載體構(gòu)建

纖維素作為地球上最豐富的可再生資源，是木材次生木質(zhì)部細(xì)胞壁的主要組成成分之一，約占木材干重的40%，是決定木材品質(zhì)的重要因子之一.為此揭示植物纖維素生物合成機(jī)制對(duì)木材材質(zhì)改良、木材定向培育都具有十分重要的意義.纖維素合酶(CesA)是纖維素生物合成的關(guān)鍵酶之一[1,2].研究表明，CesA基因通過(guò)在轉(zhuǎn)錄水平上對(duì)纖維素合成進(jìn)行調(diào)控，對(duì)植物細(xì)胞壁發(fā)育起到重要作用[3-5].美國(guó)密西根大學(xué)在2000年初次從歐洲顫楊(Populustremuloides)中克隆得到林木的纖維素合酶基因PtrCesA1[6]，并且研究發(fā)現(xiàn)該基因主要在植物莖中表達(dá)，表達(dá)高峰期主要出現(xiàn)在次生壁形成期間.此后，在毛果楊(Populustrichocarpa)[7]、大青楊(Populusussuriensis)[8]、松樹(shù)(Pinusradiata)[9]、苧麻(Boehmerianivea)[10]、桉樹(shù)(Eucalyptus)[11]、馬尾松(Pinusmassoniana)[12]、杉木(Cunninghamialanceolata)[13]、毛竹(Phyllostachysedulis)[14]等木本植物中都陸續(xù)克隆分離出CesA基因，其中毛果楊中鑒定出18個(gè)CesA基因[7]，雜交楊(Populustremula(L)×P.tremuloides)中鑒定出10個(gè)CesA基因，綠竹(Bambusabambusaoldhami)中鑒定出8個(gè)CesA基因[14].這些基因共同構(gòu)成了林木的纖維素合酶基因家族.對(duì)ClCesA基因功能的研究結(jié)果表明，PtrCesA1、PtrCesA2、PtrCesA3這3個(gè)基因可能組成同一個(gè)纖維素合成酶復(fù)合體，共同完成楊樹(shù)次生壁的合成[15]；而PtrCesA4、PtrCesA5、PtrCesA7這3個(gè)基因可能與初生壁的形成有關(guān)[16].在毛果楊中，PtCesA4、PtCesA5、PtCesA7、PtCesA8、PtCesA17和PtCesA18在木質(zhì)部特異高表達(dá)[17].Song et al[18]通過(guò)研究楊樹(shù)的纖維素合酶發(fā)現(xiàn)，楊樹(shù)的木質(zhì)部細(xì)胞膜上至少具有2種纖維素合酶復(fù)合體，復(fù)合體Ⅰ由CesA4、CesA7、CesA8、CesA17和CesA18組成，參與細(xì)胞次生壁的合成；復(fù)合體Ⅱ由CesA3、CesA10、CesA11、CesA13、CesA15和CesA16組成，參與細(xì)胞初生壁和次生壁的合成.

杉木作為中國(guó)南方重要的速生用材樹(shù)種之一，用途非常廣泛.近幾年，與杉木材性相關(guān)的分子機(jī)制研究取得一定進(jìn)展[19,20]，而有關(guān)杉木的纖維素生物合成分子機(jī)制的研究報(bào)道甚少.彭沙沙等[21]克隆了杉木纖維素合成酶類似蛋白ClCslD1；而龐景等[13]克隆了杉木纖維素合成酶基因CesA，通過(guò)將本研究克隆出的基因ClCseA與龐景等克隆的CesA基因的DNA和蛋白序列進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)2個(gè)基因在核苷酸的編碼區(qū)有11處位點(diǎn)存在差異，分別為773、821、1 249、1 537、1 545、1 554、2 166、2 436、2 580、2 823、2 856位點(diǎn)；在氨基酸的編碼區(qū)序列也發(fā)現(xiàn)3處位點(diǎn)存在差異，分別為258、274、513位點(diǎn).由于杉木基因組測(cè)序未完成，關(guān)于杉木纖維素合成酶基因家族的數(shù)量、各個(gè)基因的確切功能，以及各基因間的相互作用關(guān)系均不清楚.雖然克隆出的2個(gè)基因存在相似性，但也存在差異，有可能為2個(gè)不同的基因.關(guān)于基因的功能尚需進(jìn)一步驗(yàn)證.探索杉木中纖維素合酶基因家族的功能，特別是相關(guān)次生細(xì)胞壁形成的纖維素合酶基因，對(duì)于利用現(xiàn)代分子生物學(xué)手段改良杉木木材品質(zhì)具有重要意義.本研究以杉木三代種子園種子發(fā)育植株為材料，利用RT-PCR技術(shù)分離克隆出1個(gè)新的杉木ClCesA基因，長(zhǎng)度為2 955 bp，編碼984個(gè)氨基酸；同時(shí)進(jìn)行了生物信息學(xué)分析以及不同器官表達(dá)情況的研究；采用Invitrogen公司的gateway特異性位點(diǎn)重組技術(shù)將ClCesA基因構(gòu)建到植物表達(dá)載體中，以期為進(jìn)一步的功能解析提供依據(jù)，同時(shí)也為杉木材性的改良提供重要的基因資源.

1 材料與方法

1.1 材料收集與RNA提取

試驗(yàn)材料由國(guó)家林業(yè)局杉木工程技術(shù)研究中心提供，為杉木種子發(fā)育而成的杉木幼苗.取長(zhǎng)勢(shì)好的杉木幼嫩葉片組織0.2 g，按照TIANGEN公司的總RNA提取試劑盒操作說(shuō)明書(shū)提取杉木總RNA，通過(guò)1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的瓊脂糖凝膠電泳和超微量分光光度計(jì)Nanodrop分別檢測(cè)樣品的RNA質(zhì)量及濃度.

1.2ClCesA基因克隆與序列分析

利用NCBI網(wǎng)上的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)查詢到已知杉木的DNA序列，采用gateway技術(shù)設(shè)計(jì)特異引物(表1).取檢測(cè)合格的杉木總RNA，利用TIANScript cDNA第一鏈合成試劑盒進(jìn)行第1條鏈cDNA的合成.合成的cDNA稀釋10倍后進(jìn)行PCR反應(yīng)，具體反應(yīng)體系見(jiàn)表2.反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性1 min，53 ℃退火3 min，72 ℃延伸3 min，共30循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min.擴(kuò)增后的產(chǎn)物經(jīng)1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，通過(guò)BP連接到pDONR207載體上，熱激轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH-5α感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行Gen抗性篩選.選取單菌落做菌落PCR，將檢測(cè)為陽(yáng)性的菌落進(jìn)行液體LB過(guò)夜培養(yǎng)，使用天根質(zhì)粒試劑盒提取質(zhì)粒，并送鉑尚生物公司進(jìn)行全長(zhǎng)測(cè)序.利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀研究ClCesA基因在不同組織的表達(dá)情況.qPCR擴(kuò)增試劑為SYBR Premix Ex Taq，采用的熒光染料為SYBR GreenⅠ，以杉木EF1α基因作為內(nèi)參基因.在進(jìn)行qCR分析前，先使用普通PCR檢測(cè)體系的反應(yīng)條件，如退火溫度、模板量等，并將PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，以保證qPCR結(jié)果的準(zhǔn)確性.

表1 基因克隆及q-PCR反應(yīng)中所用引物序列Table 1 Primers used in gene cloning and q-PCR reaction

1.3 植物表達(dá)載體的構(gòu)建

表2 PCR反應(yīng)體系Table 2 Reaction System of PCR

使用Gateway BP反應(yīng)試劑盒，將回收帶有attB位點(diǎn)的ClCesA基因PCR產(chǎn)物與入門(mén)載體pDONR207在室溫下進(jìn)行BP反應(yīng)1 h.反應(yīng)體系為：PCR產(chǎn)物0.6 μL，入門(mén)載體0.4 μL，BP酶0.25 μL.隨后將反應(yīng)產(chǎn)物全部轉(zhuǎn)化到E.coliTrans 5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含Gen(50 mg·L-1)的LB平板；次日隨機(jī)挑選陽(yáng)性克隆搖菌并提取質(zhì)粒，經(jīng)PCR檢測(cè)驗(yàn)證正確后進(jìn)行測(cè)序，即可獲得入門(mén)克隆載體pDONR207-ClCesA.參考Gateway LR反應(yīng)試劑盒的操作說(shuō)明書(shū)，將入門(mén)載體與目的載體pGWB506進(jìn)行LR反應(yīng)，室溫25 ℃，反應(yīng)后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，并涂布于LB平板(含50 mg·L-1潮霉素)，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜.次日挑單菌落，搖菌后用試劑盒提取質(zhì)粒，經(jīng)PCR檢測(cè)載體構(gòu)建的正確性，并進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證.

1. 4 纖維素合酶基因的序列分析

在DNAMAN V6軟件上設(shè)計(jì)引物；通過(guò)Vecter NTI軟件進(jìn)行序列比對(duì)；在TMHMM Server v.2.0軟件上進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析；運(yùn)用MEGA 5.1軟件通過(guò)鄰接法構(gòu)建不同植物的基因進(jìn)化樹(shù)；采用Microsoft Excel 2007軟件對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行作圖.

2 結(jié)果與分析

2.1 杉木總RNA提取

杉木葉片總RNA經(jīng)1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果見(jiàn)圖1.從圖1可以看出，RNA條帶完整，28 S rRNA和18 S rRNA 2條主帶明顯，28 S rRNA的亮度約為18 S rRNA的2倍，且無(wú)DNA污染.采用超微量分光光度計(jì)進(jìn)行濃度測(cè)定和質(zhì)量分析、檢測(cè)，結(jié)果顯示，樣品總RNA濃度為231 μg·μL-1，D260 nm/D280 nm=1.86，其濃度與質(zhì)量均滿足反轉(zhuǎn)錄的要求，可用于后續(xù)試驗(yàn).最后，將總RNA樣品置于-80 ℃冰箱保存.

2.2 擴(kuò)增產(chǎn)物的堿基序列測(cè)定與分析

取上述總RNA，采用天根公司的逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒獲得cDNA，通過(guò)RT-PCR反應(yīng)得到1個(gè)約3 000 bp的產(chǎn)物(圖2)，將該產(chǎn)物連接到pDONR207載體且轉(zhuǎn)化DH-5α，挑取陽(yáng)性克隆測(cè)序.測(cè)序結(jié)果顯示該序列與CesA基因的同源性很高，并含有保守結(jié)構(gòu)域.其氨基酸序列及結(jié)構(gòu)如圖3所示.

2.3 蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)

從圖4可以看出，新的ClCesA蛋白具有8個(gè)跨膜區(qū)，分別為175～197、204～223、760～782、794～816、831～853、878～900、910～932、945～964，最大跨膜區(qū)域?yàn)?2個(gè)氨基酸殘基，最小跨膜區(qū)域?yàn)?2氨基酸殘基，平均跨膜區(qū)域?yàn)?8個(gè)氨基酸殘基.

2.4 基因序列系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)

本研究運(yùn)用MEGA 5.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，將克隆到的杉木ClCesA基因編碼區(qū)與擬南芥(Arabidopsisthaliana, At)、顫楊(P.tremuloides, Ptr)、歐洲山楊×顫楊(Populustremula×P.tremuloides, Ptt)、火炬松(PinustaedaL., Pt)、銀灰楊(Populuscanescens(Ait.) Smith, Pca)、毛白楊(PopulustomentosaCarrière, Pto)的初生壁和次生壁形成的CesA基因進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析.初生壁有關(guān)基因有AtCesA1(O48946)、AtCesA2(O48947)、AtCesA5(Q8L778)、AtCesA9(Q9SJ22)、PtrCesA7(AAO25581)、PttCesA2(AAT09895)、PtrCesA4(AAO25536)、PtrCesA6(AAP40636).次生壁有關(guān)基因有PtCesA1(AAX18647)、PtCesA2(AAX18648、PtCesA3(AAX18649)、PtrCesA2(AAM26299)、PtrCesA7(AAO25581)、PtrCesA3(AAQ08987)、PcaCesA1(AAC78476)、PttCesA1(AAT09894)、PttCesA3-1(AAT09896)、PttCesA3-2(AAT09897)、AtCesA4(Q84JA6)、AtCesA8(Q8LPK5)、PtoCesA1(AAY21910).從圖5可以看出ClCesA分布在次生壁較密集的分支，且與杉木ClCesA1在一個(gè)小分支，說(shuō)明兩者的親緣關(guān)系較近，可能執(zhí)行類似的功能，由此推測(cè)ClCesA基因可能與次生壁合成有關(guān).

圖1 杉木幼苗總RNA瓊脂糖凝膠電泳Fig.1 Agarose gel of total RNA extracted from seedling of Chinese fir

圖4 杉木ClCesA蛋白氨基酸序列跨膜區(qū)域預(yù)測(cè)Fig.4 Prediction on trasmembrane domains of amino acids of ClCesA

2.5ClCesA基因在不同組織的表達(dá)

杉木纖維素合酶基因在不同器官表達(dá)情況的分析結(jié)果(圖6)顯示，杉木的根、莖、葉3個(gè)器官均有纖維素合酶基因表達(dá)，而且相對(duì)表達(dá)量在杉木根中最高，莖中次之，葉中最低.因此，可以推測(cè)ClCesA基因與杉木木材生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控有著密切關(guān)系.

圓圈代表與次生細(xì)胞壁有關(guān)的基因；三角形代表與初生細(xì)胞壁有關(guān)的基因.

圖6 不同器官中ClCesA基因的相對(duì)表達(dá)量Fig.6 Relative expressions of ClCesA gene in different organs

2.6 植物過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建

將檢測(cè)正確的入門(mén)載體pDONR207-ClCesA和目的載體pGWB506進(jìn)行LR反應(yīng)，獲得植物表達(dá)載體pGWB506-35S-ClCesA-GFP，載體構(gòu)建策略如圖7所示.使用特異性的載體引物和基因特異性引物做菌落PCR，擴(kuò)增出1 000 bp的片段(圖8)，表明LR反應(yīng)成功.重組質(zhì)粒的測(cè)序結(jié)果顯示，ClCesA并未產(chǎn)生突變，并且和原序列相同，說(shuō)明本試驗(yàn)的植物表達(dá)載體連接正確.

圖7 植物表達(dá)載體pGWB-35S-ClCesA-GFP的構(gòu)建策略Fig.7 Construction strategy of vector pGWB-35S-ClCesA-GFP

3 討論

圖8 菌落PCR反應(yīng)Fig.8 Colony PCR reaction

通過(guò)序列比對(duì)與分析，Pear et al[22]首先從棉花中克隆得到與細(xì)菌CelA基因同源的纖維素合酶基因GhCesA1、2.通過(guò)基因組學(xué)分析研究，Richmond et al[23]得到了擬南芥基因組中的10個(gè)CesA基因的蛋白質(zhì)序列結(jié)構(gòu)特點(diǎn).Suzuki et al[17]分析了楊樹(shù)基因組的18個(gè)CesA基因的結(jié)構(gòu)特點(diǎn).目前為止，研究發(fā)現(xiàn)CesA基因編碼的蛋白質(zhì)有著相類似的結(jié)構(gòu)，共有8個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域， N端有2個(gè)， C端有6個(gè).1個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域在N端，可能和蛋白質(zhì)之間的相互作用有關(guān).CesA蛋白都含有較典型的結(jié)構(gòu)如DDDQxxRW(天冬氨酸、天冬氨酸、天冬氨酸、谷氨酞胺-x-x精氨酸—色氨酸)[24].通過(guò)對(duì)CesA基因功能的研究，已陸續(xù)鑒定出與初生壁和次生壁形成相關(guān)的基因.在歐洲顫楊中，PtrCesA1、PtrCesA2、PtrCesA3可能形成一個(gè)纖維素合成酶復(fù)合體，共同完成楊樹(shù)次生壁的合成[15,24]，而PtrcesA4、PtrCesA5、PtrCesA7可能與初生壁的形成有關(guān)[16].本研究克隆到一個(gè)新杉木ClCesA基因，通過(guò)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，該基因與聚類在一個(gè)進(jìn)化分支并在根中表達(dá)量最高，推測(cè)該基因可能參與植物次生細(xì)胞壁的形成.而龐景等克隆到的2個(gè)CesA基因，ClcesAl與PtrCesAl的同源性最高；ClCesA2與ZmCesA2聚類在一起，兩者在莖中高度表達(dá).本研究中所用材料為培養(yǎng)30 d左右的杉木種子萌發(fā)而成的幼苗，而龐景所用的杉木材料為1年生杉木幼苗，且纖維素合酶CesA在植物不同發(fā)育階段、不同器官中的表達(dá)量不同，所以這可能是造成ClCesA在杉木器官中表達(dá)量不同的原因.植物中除了CesA基因外，還有類纖維素合酶(cellulose synthase-like, CSL)基因家族參與纖維素的生物合成.擬南芥CSL蛋白有9個(gè)家族，分別為CSL(A/B/C/D/E/F/G/H/J)[25]；在基因序列上，CSL基因與CesA基因具有部分同源，主要參與各種β-聚糖鏈的合成[23,25].彭莎莎等[21]也從杉木中克隆到了CSL基因，并分析其序列結(jié)構(gòu)特點(diǎn).

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(責(zé)任編輯:葉濟(jì)蓉)

Cloning of a newClCesAgene ofCunninghamialanceolataand plant expression vector construction

WEI Xiaoxiao1,2, WANG Shiya1,2, CHEN Xiaoxiao1,2, WANG Fenglin1,2, CAO Guangqiu1,2, CAO Shijiang1,2

(1.College of Forestry, Fujian Agriculture and Forestry University; 2.Chinese Fir Engineering, Technology Research Center under State Forestry Administration, Fuzhou, Fujian 350002, China)

In order to explore the molecular mechanism of Chinese fir wood formation, total RNA was extracted from Chinese fir new leaves and cDNA was synthesized. A newClCesAwas cloned using RT-PCR. The length of open reading frame ofClCesAis 2 955 bp, with 984 amino acids. Based on TMHMM Server v. 2.0 and MEGA5.1 software,ClCesAproteins consist of 8 across-membrane structures, with average 18 amino acid residues and zinc finger in N end. Also, a conservative DDDQXXLRW structure domain was found inClCesAprotein. Phylogenetic tree analysis showed thatClCesAmay be associated with secondary cell wall formation. The fluorescent quantitative PCR analysis showed thatClCesAcan be expressed in organs of root, stem and leaf in Chinese fir, with the highest expression in the root and the least in leaf. Lastly, a plant overexpression vector pGWB506-35s-ClCesA-GFP was successfully constructed from pGWB506 vector which contains GFP tag and hygromycin resistance gene by Gateway technology.

Cunninghamialanceolata; cellulose synthase; gene cloning; expression analysis; vctor construction

2016-07-03

2016-09-20

福建農(nóng)林大學(xué)校重點(diǎn)建設(shè)項(xiàng)目(6112C039B);福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院青年基金項(xiàng)目(k13xjj02a).

魏曉驍(1990-)，女，碩士研究生.研究方向:森林培育理論與技術(shù).Email：695194330@qq.com.通訊作者曹世江(1984-)，男，講師,博士.研究方向:樹(shù)木遺傳育種教學(xué)與科研.Email:379612064@qq.com.

Q785; S791.27

A

1671-5470(2017)01-0066-07

10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2017.01.011