劉文明 范燕云 田釗旭 周 飛 楊曉寧 胡益群

廈門大學附屬中山醫(yī)院消化內(nèi)科(361004)

外泌體在胰腺癌中的作用*

劉文明 范燕云 田釗旭 周 飛 楊曉寧 胡益群#

廈門大學附屬中山醫(yī)院消化內(nèi)科(361004)

外泌體是多種活細胞分泌的囊泡小體，含有蛋白質(zhì)和RNA等多種成分，在多種生理和病理過程中發(fā)揮重要作用。胰腺癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率、死亡率較高。外泌體作為腫瘤學研究的熱點，在胰腺癌發(fā)生、發(fā)展、診斷和治療方面具有重要的研究價值。本文就外泌體在胰腺癌中的作用作一綜述。

外泌體； 胰腺腫瘤； 診斷； 治療

胰腺癌的死亡率目前位列世界腫瘤相關死亡的第4位[1]。近年我國胰腺癌的發(fā)病率呈逐年升高的趨勢，國家癌癥中心的統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明，2015年我國胰腺癌發(fā)病率已上升至第9位，死亡率位居第6位[2]。胰腺癌起病隱匿，早期診斷缺乏高敏感性和高特異性的標記物，且對放療、化療反應較差，導致胰腺癌的早期發(fā)現(xiàn)和治療非常困難，僅不足20%的患者能在腫瘤仍局限于胰腺并能進行手術切除的階段被確診，因此胰腺癌患者的5年生存率小于6%。目前胰腺癌的診治已成為醫(yī)學界面臨的重大診療難題。

胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展除受個體遺傳背景因素的影響外，還與環(huán)境因素、個人生活習慣和其他疾病(如糖尿病)有關[3]，但相關機制尚不明確。目前認為胰腺癌是實體腫瘤中惡性程度最高的腫瘤，原因是胰腺癌具有特殊的腫瘤生物學特點：解剖結(jié)構(gòu)特殊、富間質(zhì)(復雜的腫瘤微環(huán)境)、乏血供、高度異質(zhì)性、細胞惡性潛能大、腫瘤代謝模式異常等。胰腺星狀細胞(pancreatic stellate cells,PSCs)、成纖維細胞、肌成纖維細胞、免疫細胞、血管內(nèi)皮細胞和細胞外間質(zhì)共同構(gòu)成了腫瘤微環(huán)境。腫瘤微環(huán)境在調(diào)節(jié)腫瘤細胞增殖行為、藥物抵抗、腫瘤轉(zhuǎn)移和調(diào)節(jié)腫瘤免疫反應中起重要作用[4]。外泌體作為腫瘤微環(huán)境的重要組成部分，可能參與其細胞間信號轉(zhuǎn)導和腫瘤發(fā)展過程，并起關鍵作用。本文就近年外泌體在胰腺癌中作用的研究進展作一綜述，旨在為進一步了解胰腺癌的生物學特性奠定基礎，有助于胰腺癌的早期診斷和治療。

一、外泌體概述

外泌體是一種由多種細胞分泌的、直徑為30～120 nm的亞細胞囊泡結(jié)構(gòu)，電鏡下呈球狀或杯狀[5]，來源于多種類型的活細胞內(nèi)吞途徑中的多泡小體(multivesicular body,MVB)。細胞內(nèi)MVB以鈣離子依賴的方式與細胞膜融合，并將其內(nèi)部所包含的多個膜性囊泡結(jié)構(gòu)釋放至細胞外基質(zhì)中，即形成外泌體[6-7]。

外泌體最早發(fā)現(xiàn)于1985年，Pan等[8]在網(wǎng)織紅細胞成熟過程中發(fā)現(xiàn)了一種膜性囊泡小體，其功能最初被誤認為是清除細胞成熟過程中產(chǎn)生的“垃圾”，并未引起關注。隨后的研究發(fā)現(xiàn)，B淋巴細胞被EB病毒轉(zhuǎn)化后，其分泌的外泌體攜帶MHC-Ⅱ、共刺激分子和黏附分子，能直接刺激CD4+T細胞增殖。研究指出，外泌體是具有功能活性并可通過多種途徑介導細胞間物質(zhì)與信息傳遞的囊泡小體[9]。

目前發(fā)現(xiàn)，所有真核細胞和眾多原核細胞均能釋放外泌體，如血小板、網(wǎng)織紅細胞、樹突細胞、淋巴細胞、肥大細胞、腸上皮細胞、脂肪細胞、肝細胞和腫瘤細胞等[10]。在正常和病理狀態(tài)下，外泌體廣泛分布于外周血、唾液、尿液、腹水、胸水、腦脊液、乳汁等多種體液中[11]。

外泌體組成結(jié)構(gòu)為脂質(zhì)雙分子膜包裹少量胞質(zhì)，胞質(zhì)中含有源細胞的各種成分，包括大量蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸等，但并不含細胞器[12]。根據(jù)外泌體內(nèi)容物數(shù)據(jù)庫的統(tǒng)計，目前已確定4 563種蛋白質(zhì)、194種脂質(zhì)、1 639種mRNA和764種微RNA(miRNA)存在于不同組織和細胞來源的外泌體中[13]，其中包括外泌體所共有的普遍性組分和根據(jù)外泌體來源不同而特有的組分，這些內(nèi)容物在外泌體介導的細胞間物質(zhì)和信息交流過程中均起有關鍵作用。外泌體中的Rab蛋白家族可促進膜轉(zhuǎn)運和融合。外泌體還包含熱休克蛋白(heat shock protein,HSP)70和HSP90，可促進肽整合MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ。外泌體中含有的脂質(zhì)成分(如膽固醇、甘油二酯、磷脂、前列腺素等)可作為信號分子，抑制Notch等腫瘤相關信號通路，引起細胞凋亡，并通過前列腺素、磷酸激酶A2、磷酸激酶C和磷酸激酶D等中間信號分子參與細胞通訊[14]。此外，外泌體中的miRNA還參與了干細胞分化、器官形成、血細胞形成、腫瘤發(fā)生和腫瘤轉(zhuǎn)移等機體重要的生命活動[15]。

近十年來有關外泌體與腫瘤關系的研究越來越多。研究[16]發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)腫瘤(包括黑色素瘤、結(jié)直腸癌、乳腺癌、肺癌等)細胞均可分泌外泌體。外泌體攜帶腫瘤細胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和miRNA等多種物質(zhì)，并以其功能和特性通過多種方式改變腫瘤微環(huán)境，參與腫瘤生長、轉(zhuǎn)移的調(diào)控。此外，腫瘤細胞的外泌體分泌量遠高于非腫瘤細胞，外泌體及其所含的miRNA存在于所有體液中，因此外泌體有望成為腫瘤無創(chuàng)診斷的標記物[17]。外泌體作為預測早期腫瘤的潛在生物學標志，可用來指導腫瘤的個體化治療，并可為胰腺癌早期診斷和治療提供新的方法和途徑。

二、外泌體與胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展

胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程中，腫瘤和非腫瘤細胞均可釋放一系列細胞因子、黏附分子和細胞外基質(zhì)蛋白，促進腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，而上述成分亦存在于外泌體中，從而對細胞通訊、細胞生長和免疫反應發(fā)揮重要作用[18]。

胰腺癌組織中存在大量PSCs，是胰腺癌微環(huán)境的重要組成部分[19]。胰腺癌細胞可使PSCs活化，分泌細胞外基質(zhì)蛋白，如膠原蛋白、纖連蛋白和骨膜蛋白，構(gòu)成大量致密纖維組織，從而形成缺乏血供的缺氧環(huán)境，有利于胰腺癌細胞的生長[20]。研究[21]表明，PSCs活化后會產(chǎn)生富含miR-21的外泌體，而miR-21高表達與胰腺癌患者生存率低相關[22]。體外研究[23]亦證實，miR-21過表達能促進胰腺癌細胞增殖、侵襲以及對吉西他濱產(chǎn)生耐藥，并增加胰腺癌細胞遠處轉(zhuǎn)移的能力。最新研究[24]進一步證實，胰腺癌患者miR-21確實存在于PSCs分泌的外泌體中，且這種外泌體可促進胰腺癌細胞株PANC-1和SUIT-2的增殖。

研究[25]發(fā)現(xiàn)，胰腺癌外泌體中的CD9、重組人腫瘤關聯(lián)鈣離子信號轉(zhuǎn)導因子2(TACSTD2)和CUB結(jié)構(gòu)域蛋白1(CDCP1)等蛋白是細胞外基質(zhì)的調(diào)節(jié)劑，在調(diào)控腫瘤細胞外基質(zhì)的成分、調(diào)節(jié)細胞間信息交流和細胞遷移中具有重要作用。

大量研究證實，腫瘤細胞來源的外泌體有免疫抑制作用，主要通過直接抑制免疫細胞功能或調(diào)節(jié)相關細胞因子表達分泌等途徑，促進腫瘤的免疫逃逸，進而在腫瘤的發(fā)生、進展中發(fā)揮關鍵作用。胰腺癌外泌體中的miR-203可通過抑制Toll樣受體4(TLR4)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細胞介素-12(IL-12)表達，使樹突細胞的免疫激活功能出現(xiàn)異常，從而導致腫瘤的免疫逃逸[26]。

胰腺癌患者易發(fā)生肝轉(zhuǎn)移。有研究發(fā)現(xiàn)，胰腺癌細胞釋放的外泌體能使肝臟形成腫瘤生長微環(huán)境，從而有利于胰腺癌發(fā)生肝轉(zhuǎn)移[27]。通過去除胰腺癌外泌體中的巨噬細胞遷移因子可阻止肝臟形成纖維化的腫瘤支持環(huán)境，因此，這一蛋白標記或許可作為胰腺癌肝轉(zhuǎn)移的預測指標和治療新靶點[28]。

三、外泌體與胰腺癌的診斷和治療

胰腺癌發(fā)病隱匿，目前的影像學等檢查難以對早期胰腺癌作出有效診斷，因此尋找新的有效的早期標記物已成為胰腺癌診治的重點。

Melo等[29]的研究發(fā)現(xiàn)，胰腺癌患者血清磷脂酰肌醇聚糖1(GPC1)陽性的循環(huán)外泌體(GPC1+crExos)與正常人相比顯著升高，且GPC1為癌癥細胞獨有；進一步研究發(fā)現(xiàn)，早期胰腺癌患者血清GCP1+crExos的豐度明顯高于正常人群和胰腺良性疾病患者，而接受手術切除腫瘤患者體內(nèi)的GPC1+crExos水平顯著下降。KRAS在胰腺癌中的突變率較高，研究顯示KRAS基因突變僅存在于GCP1+crExos中，提示高GPC1+crExos水平與胰腺癌密切相關。檢測GCP1+crExos的樣本需要量少，假陽性率低于MRI和CT，早期腫瘤的檢出率高，如結(jié)合KRAS基因突變檢測，可為胰腺癌的早期診斷開辟新的前景。

腫瘤外泌體的分子特征部分反映其腫瘤來源的表型，所攜帶的腫瘤特異性抗原和miRNA可作為腫瘤診斷標記物。研究[30]發(fā)現(xiàn)，胰腺癌患者血清外泌體中miR-17-5p和miR-21含量顯著升高，高水平miR-17-5p與胰腺癌分期和轉(zhuǎn)移有關，說明血清外泌體中的miRNA可作為胰腺癌診斷、評估臨床療效和預后判定的潛在血清學標記物和治療靶點。此外，有研究致力于開展其他類型外泌體蛋白和miRNA用于診斷胰腺癌的工作，但目前尚無突破性進展[31]。

表皮生長因子受體(epithelial growth factor receptor,EGFR)是目前腫瘤治療靶點研究中的焦點。EGFR在胰腺癌中呈高表達，在胰腺癌上皮細胞分泌的外泌體中可檢測到EGFR表達。外泌體可分泌EGFR完整受體和加長片段，該加長片段可與細胞內(nèi)的激酶C端殘基區(qū)域結(jié)合。這些不同形式的EGFR在體內(nèi)可能承擔著不同的功能，可成為腫瘤生物學標記物和治療靶點[32]。針對EGFR靶向治療的關鍵因素是突變基因編碼的下游效應蛋白，如胰腺癌中常見的突變——KRAS基因突變。目前研究[33]證實，通過檢測胰腺癌患者分泌的含有KRAS基因片段的外泌體，可有助于識別那些可能從EGFR靶向治療中獲益的患者，該檢測為無創(chuàng)性，無需行穿刺活檢等侵入性操作。

外泌體由人體自體產(chǎn)生，經(jīng)改造后作為載體攜帶藥物或藥效蛋白用于治療時，不會引起宿主的免疫反應，且其具有介導細胞通訊的作用，可增加藥物生物利用度，因此通過外泌體將促進化療的藥物運送至胰腺癌細胞已成為目前的研究熱點。體外實驗[34]發(fā)現(xiàn)，與外泌體結(jié)合的姜黃素可有效誘導針對胰腺癌細胞的細胞毒性。與單純使用紫杉醇相比，在前列腺癌細胞培養(yǎng)基中加入與外泌體結(jié)合的紫杉醇可提高細胞毒性[35]，在針對胰腺癌細胞的實驗中得到了類似結(jié)果[36]。外泌體與質(zhì)膜構(gòu)造十分相似，作為治療藥物的運輸載體與靶細胞結(jié)合時具有特定的靶向性，可為定向藥物運輸提供新的手段，但目前相關的研究僅限于體外實驗，隨著研究的深入，將來有望成為治療胰腺癌的新方法。

四、問題與展望

外泌體作為一種廣泛存在的亞細胞成分，主要功能是介導細胞間的信息交流和細胞內(nèi)廢物的清除，其內(nèi)容物可在細胞間傳遞，通過向靶細胞傳遞抗原、遺傳信息和信號分子，調(diào)控后者的信號轉(zhuǎn)導通路和基因表達，從而激活或抑制特定的生理功能。外泌體在胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用，為胰腺癌的診斷和治療提供了新思路。然而，目前針對胰腺癌外泌體的研究仍較少，尤其缺乏有關外泌體功能的在體研究，目前臨床應用仍有較大的局限性。許多復雜的問題亟待解決，如由于外泌體含量和結(jié)構(gòu)方面的因素，其分離純化困難，需要開發(fā)新的方法來提高分離外泌體的產(chǎn)量和純度；此外，相關臨床研究納入的病例數(shù)較少，外泌體用于胰腺癌診斷和治療的機制尚需進一步研究。隨著對外泌體及其載體功能研究的深入，其有望成為胰腺癌早期診斷的標記物，并可能成為胰腺癌治療的新靶點。

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(2016-10-28收稿；2017-01-24修回)

Role of Exosomes in Pancreatic Cancer

LIUWenming,FANYanyun,TIANZhaoxu,ZHOUFei,YANGXiaoning,HUYiqun.

DepartmentofGastroenterology,ZhongshanHospital,XiamenUniversity,Xiamen,FujianProvince(361004)

HU Yiqun,Email:hyq0826@yahoo.com

Exosomes are vesicular bodies secreted by living cells containing proteins and RNA,and play an important role in the process of physiology and pathology.Pancreatic cancer is one of the common gastrointestinal tumor with high morbidity and mortality.As a hotspot in oncology,exosomes have potential values in the research of development,diagnosis and treatment of pancreatic cancer.This article reviewed the role of exosomes in pancreatic cancer.

Exosomes; Pancreatic Neoplasms; Diagnosis; Therapy

10.3969/j.issn.1008-7125.2017.05.013

*本課題由廈門市科技重點項目(3502Z20149006)資助

#本文通信作者，Email:hyq0826@yahoo.com