尚 瑞，吳 軍，鄭雪皎，盧光新，楊艷果

湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院 1.消化內(nèi)科； 2.藥學(xué)部，湖北 十堰 442000

外周血Th17、Treg細(xì)胞水平在潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩病中的比較研究

尚 瑞1，吳 軍1，鄭雪皎2，盧光新1，楊艷果1

湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院 1.消化內(nèi)科； 2.藥學(xué)部，湖北 十堰 442000

目的 觀察潰瘍性結(jié)腸炎(UC)和克羅恩病(CD)外周血單個(gè)核細(xì)胞 (PBMCs) 中Th17、Treg細(xì)胞水平和IL-17 mRNA表達(dá)水平的差異。探討Th17和Treg在UC和CD發(fā)病機(jī)制中的作用。 方法 選取2014年1月-2015年12月在湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院住院治療的IBD患者100例，其中UC患者50例，CD患者50例，應(yīng)用流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測(cè)兩組患者外周血中Th17與Treg細(xì)胞比例。應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)兩組患者IL-17和Foxp3 mRNA 水平的變化。結(jié)果 CD患者組外周血 Th17 細(xì)胞比例為(2.01±0.59)%，UC 患者外周血Th17 細(xì)胞比例(4.55±0.75)%，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；CD患者組外周血Treg細(xì)胞比例為(6.08±2.10)%，UC患者為(3.27±0.97)%,兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。UC患者組IL-17 mRNA水平約是CD患者的4.5倍；UC患者組Foxp3 mRNA水平約是CD患者的0.4倍，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 Th17與Treg細(xì)胞比例在UC和CD中有顯著性差異，可為臨床UC和CD提供新的診斷方法，從而提高UC和CD診斷的正確率。

炎癥性腸?。粷冃越Y(jié)腸炎；克羅恩病；Th17細(xì)胞；Treg細(xì)胞；IL-17

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease, IBD)，是一種常見(jiàn)的慢性特發(fā)性腸道炎癥性疾病，主要包括克羅恩病(Crohn’s disease,CD)和潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis, UC)。近些年來(lái)IBD的發(fā)病率呈出急速增長(zhǎng)的趨勢(shì)[1-2]。其確切發(fā)病機(jī)制雖然至今未知，但是有研究數(shù)據(jù)表明，其發(fā)病的部分原因是由于易感體質(zhì)腸道菌群放松了對(duì)宿主的免疫反應(yīng)[3-4]。免疫反應(yīng)在其發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著最主要的作用，而CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞(Treg)和輔助性T 細(xì)胞17(Th17)是參與免疫反應(yīng)的兩種關(guān)鍵性細(xì)胞。Treg和Th17是異于 Th1 和 Th2 的 CD4+T淋巴細(xì)胞。Treg 細(xì)胞是CD4+T 細(xì)胞的一類(lèi)特殊分支，主要作用是維持免疫系統(tǒng)的穩(wěn)定性以及耐受性，并且在防止免疫炎癥反應(yīng)的增加和保護(hù)免疫機(jī)體上也發(fā)揮重要作用。近幾年，在許多動(dòng)物和人的研究中得知，丟失Treg細(xì)胞將會(huì)造成嚴(yán)重的自身免疫性炎癥的發(fā)生；相反，增加Treg 細(xì)胞也不利于機(jī)體健康，在許多癌癥中，增加的Treg 細(xì)胞通過(guò)與自身免疫監(jiān)控系統(tǒng)相互作用，抑制抗腫瘤免疫活性細(xì)胞的活性，促進(jìn)腫瘤發(fā)生、發(fā)展。Foxp3 是 Treg 細(xì)胞的特異性標(biāo)記物，作為轉(zhuǎn)錄因子 Forkhead 家族的一員，具有調(diào)控 Treg 細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育的作用。而特異性產(chǎn)生IL-17的Th17細(xì)胞則被認(rèn)為是存在于天然性免疫系統(tǒng)與獲得性免疫系統(tǒng)之間的橋梁，是炎癥反應(yīng)的使動(dòng)和調(diào)節(jié)因素[5-8]。Th17 細(xì)胞在固有免疫、適應(yīng)性免疫和自身免疫方面均發(fā)揮至關(guān)重要的作用。Th17 細(xì)胞在炎癥反應(yīng)的過(guò)程中主要發(fā)揮促進(jìn)炎癥反應(yīng)的功效。

Treg 細(xì)胞和 Th17 細(xì)胞之間存在復(fù)雜的相互作用關(guān)系，在分化上二者相互協(xié)同，在功能上又相互競(jìng)爭(zhēng)，其平衡在炎癥反應(yīng)中起關(guān)鍵性作用。目前，Th17/Treg 兩種細(xì)胞的平衡紊亂已成為新的研究熱點(diǎn)，但是在CD和UC中研究很少。所以本文主要就兩種細(xì)胞在UC和CD中存在的比例差異進(jìn)行研究。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2014年1月-2015年12月在湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院住院治療的IBD患者，UC患者(活動(dòng)期)50例，男女比例為28∶22，年齡(45.45±8.34)歲，CD患者(活動(dòng)期)50例，男女比例為26∶24，年齡(48.35±7.56)歲。診斷標(biāo)準(zhǔn)按照中華醫(yī)學(xué)會(huì)消化道學(xué)分會(huì)制定的關(guān)于IBD診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]。兩組性別、年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。兩組患者均采集肘靜脈肝素抗凝血2.0 ml和EDTA抗凝血2.0 ml。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn)：(1) UC的納入標(biāo)準(zhǔn)：連續(xù)性結(jié)膜、無(wú)肉芽腫、結(jié)直腸受累；(2) CD的納入標(biāo)準(zhǔn)：從口腔至肛門(mén)慢性肉芽腫損害；呈跳躍性，延長(zhǎng)軸或腸周或分散的潰瘍的非連續(xù)性病變；活檢黏膜可見(jiàn)黏蛋白滯留。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn)：(1) 以各種有效的診斷方法，如細(xì)菌學(xué)、放射學(xué)、組織學(xué)排除感染性結(jié)腸炎、缺血性結(jié)腸炎、放射性結(jié)腸炎等；(2) 懷疑有結(jié)腸癌變的患者；(3) 心、腎功能顯著下降的患者；(4) 存在其他免疫學(xué)疾病的患者。所有入選患者均經(jīng)過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并且需取得每位患者的同意并簽署相應(yīng)的書(shū)面同意書(shū)。

1.3 試劑和儀器

1.3.1 試劑：布雷非得菌素A(BFA)、4%多聚甲醛(PFA)、細(xì)胞因子刺激劑(PMA)。FITC-IL-17流式抗體，APC-CD4流式抗體，F(xiàn)ITC-CD25流式抗體，PE- Foxp3流式抗體均購(gòu)自美國(guó)BD公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自中國(guó)全式金生物技術(shù)有限公司。

1.3.2 儀器：流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)；實(shí)時(shí)PCR儀(Life Technologies)。

1.4 流式細(xì)胞術(shù) 用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)兩組患者外周血PBMCs中細(xì)胞亞群Th17和Treg的比例。用IL-17抗體染色結(jié)果顯示為陽(yáng)性的細(xì)胞群稱(chēng)作Th17細(xì)胞，將CD4+CD25+Foxp3+三種抗體染色均顯示為陽(yáng)性的細(xì)胞群稱(chēng)作Treg細(xì)胞。

1.4.1 Th17細(xì)胞的檢測(cè)：用含有 100 g/L胎牛血清(FBS)的 1640 培養(yǎng)基，將PBMCs的濃度調(diào)節(jié)為 (1～5)×105個(gè)/ml； 一支試管加入淋巴細(xì)胞刺激劑混合液 3 μl(對(duì)照組不加淋巴細(xì)胞刺激劑混合液)；將試管放置于 37 ℃，且體積分?jǐn)?shù)5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中，孵育5 h；孵育完成后以 800 r/min 離心 5 min，去上清液；用 2 ml PBS 清洗兩次，800 r/min 離心 5 min；加入固定劑 100 μl，于漩渦震蕩器上震蕩 2～5 s混勻，然后避光，室溫孵育15 min，后加入3 ml PBS 洗液，800 r/min 離心 5 min，棄上清；加入100 μl破膜劑，避光孵育5 min，后不需清洗直接加入FITC-IL-17流式抗體10 μl，震蕩混勻，室溫避光孵育 30 min； Th17 細(xì)胞同型對(duì)照管則需要加 10 μl FITC-Ig G 單克隆熒光抗體；500 μl PBS 液重懸細(xì)胞，待測(cè)。

1.4.2 Treg細(xì)胞的檢測(cè)：取流式細(xì)胞儀上樣管；每管加入 APC-CD4、FITC-CD25、PE-Foxp3各10 μl；每管加 APC-lg G1，F(xiàn)ITC-Ig G1、PE-Ig G1 各 10 μl(作為對(duì)照管)，其中這三種流式抗體分別做一個(gè)單個(gè)抗體對(duì)照，以便于流式上機(jī)檢測(cè)時(shí)補(bǔ)償?shù)恼{(diào)節(jié)； 加入 100 μl 抗凝全血，于漩渦震蕩儀上振蕩 2～5 s混勻，避光室溫作用 30 min后加入 500 μl 溶血?jiǎng)?，振蕩混勻，放?37 ℃水浴箱中孵育 15 min； 待管內(nèi)液體透明后，以 800 r/min 離心 5 min，然后將上清倒掉后加入 500 μl PBS 重懸細(xì)胞，待測(cè)。

1.5 實(shí)時(shí)定量PCR(RT-PCR) RT-PCR檢測(cè)技術(shù)用于檢測(cè)PBMCs中細(xì)胞對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子。Th17細(xì)胞檢測(cè)IL-17，而Treg細(xì)胞檢測(cè)Foxp3。

2 結(jié)果

2.1 外周血PBMCs中Th17和Treg細(xì)胞比例 CD組患者外周血 Th17 細(xì)胞比例為(2.01±0.59)%，UC 組患者外周血 Th17 細(xì)胞比例為(4.55±0.75)%，UC組患者Th17 細(xì)胞比例明顯高于CD組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

Treg細(xì)胞：CD組外周血Treg細(xì)胞比例為(6.08±2.10)%，UC組為(3.27±0.97)%， CD組Treg細(xì)胞比例明顯高于UC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 兩組患者PBMCs中IL-17和Foxp3 mRNA水平變化 UC組IL-17 mRNA 水平約是CD患者的4.5倍，而UC組Foxp3 mRNA水平約是CD組的0.4倍， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討論

IBD是典型的消化系統(tǒng)疾病，臨床表現(xiàn)是腹瀉、黏液膿血便、腹痛、里急后重等。90%以上患者都有腹瀉，輕者每日排便3～4次或腹瀉與便秘交替，重者每日可達(dá)10～30次。且反復(fù)發(fā)作，屬慢性疾病。

IBD是一種誘因以及致病因素迄今尚且未完全闡明的腸道炎癥性疾病。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究認(rèn)為，免疫調(diào)節(jié)紊亂、基因遺傳是致病和發(fā)病機(jī)制的因素之一，但是免疫異常誘因在各種研究中占有重要地位。Th17細(xì)胞參與了系統(tǒng)免疫紊亂發(fā)生過(guò)程，Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞數(shù)量和(或)功能的相互作用(變化及轉(zhuǎn)化)可能是IBD的致病、發(fā)病的罪魁禍?zhǔn)譡10-11]。Th17與Treg細(xì)胞的失衡這一新的發(fā)現(xiàn)，給我們帶來(lái)了治療IBD的新靶點(diǎn)，我們可以通過(guò)各種干預(yù)手段把Th17/Treg細(xì)胞進(jìn)行權(quán)重配比以達(dá)到最初無(wú)炎癥時(shí)的平衡狀態(tài)，從而達(dá)到預(yù)防與治療的作用。其實(shí)，這已成為了研究的熱點(diǎn)，也是未來(lái)發(fā)展新方向。

不過(guò)，由于體內(nèi)環(huán)境錯(cuò)綜復(fù)雜，所以在這個(gè)層面上還有很多亟待解決的問(wèn)題，如在體內(nèi)消減Treg細(xì)胞的安全方法、在體內(nèi)的相互影響機(jī)制及操作穩(wěn)定性等。因此，我們?nèi)孕鑼?duì)Th17/Treg細(xì)胞進(jìn)行更深入的研究，從而為IBD預(yù)防和治療提供新的思路。

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(責(zé)任編輯：陳香宇)

A comparative study of the peripheral blood Th17 and Treg cells in Crohn’s disease and ulcerative colitis

SHANG Rui1, WU Jun1, ZHENG Xuejiao2, LU Guangxin1, YANG Yanguo1

1.Department of Gastroenterology; 2. Department of Pharmacy, Renmin Hospital, Hubei University of Medicine, Shiyan 442000, China

Objective To observe the levels of Th17 and Treg cells and the expression of IL-17 mRNA in peripheral blood mononuclear cells of Crohn’s disease(CD) and ulcerative colitis(UC), to investigate the role of Th17 and Treg in the mechanism of UC and CD.Methods One hundred patients with IBD including 50 cases of UC and 50 cases of CD were selected from Jan. 2014 to Dec. 2015. The Th17 and Treg cells proportion in peripheral blood were detected by flow cytometry instrument technology and expressions of IL-17 and Foxp3 mRNA in two groups were decteted by real-time PCR technology.Results The proportion of peripheral blood Th17 cells was (2.01±0.59) % in CD group, (4.55±0.75)% in UC group,there was significantly different between two groups(P<0.05). The proportion of peripheral blood Treg cells was (6.08±2.10)% in CD group, (3.27±0.97) % in UC group, there was significantyly different between two groups (P<0.05). The level of IL-17 mRNA in UC group was about 4.5 times of CD group; and the level of Foxp3 in UC group was about 0.4 times of CD group. There were significant differences (P<0.05).Conclusion The proportions of Th17 and Treg cells in UC and CD have significant differences. This can provide a new clinical diagnostic method for UC and CD, and improve the diagnosis accuracy of UC and CD.

Inflammatory bowel disease; Ulcerative colitis; Crohn’s disease; Th17 cell; Treg cell; IL-17

10.3969/j.issn.1006-5709.2017.05.021

尚瑞，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：消化系統(tǒng)腫瘤基礎(chǔ)與臨床相關(guān)研究。E-mail: shangree@126.com

吳軍，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：消化系統(tǒng)腫瘤基礎(chǔ)與臨床相關(guān)研究。E-mail: shangrkd@qq.com

R574.62

A

1006-5709(2017)05-0559-03

2016-08-23