朱鳳 胡園??劉衡??肖懷 ??楊自忠 ?ふ院Ｈ? 張成桂 何苗

【摘要】目的：通過(guò)復(fù)制小鼠急性不完全性腦缺血模型，研究Ento-Ⅰa涂膜劑對(duì)腦缺血的保護(hù)作用。 方法：140只小鼠分為2批進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，每批70只。將70只小鼠隨機(jī)分為7組，每組10只，分別為假手術(shù)組、Ento-Ⅰa涂膜劑組（3750mg·kg-1、1875mg·kg-1、938mg·kg-1）、生理鹽水模型組、基質(zhì)模型組、尼莫地平組（18mg·kg-1，ig）。Ento-Ⅰa涂膜劑預(yù)防給藥7 d后，測(cè)定小鼠結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈帶迷走神經(jīng)后的存活時(shí)間及其腦組織SOD活性、MDA含量、EB含量。 結(jié)果：Ento-Ⅰa涂膜劑在劑量為1875 mg·kg-1時(shí)，可以明顯延長(zhǎng)小鼠結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈帶迷走神經(jīng)后的存活時(shí)間（P<005），延長(zhǎng)率為3955%；在劑量為3750mg·kg-1時(shí)效果最佳（P<001），小鼠存活時(shí)間的延長(zhǎng)率為4515%，與陽(yáng)性藥尼莫地平（18 mg·kg-1，延長(zhǎng)率4396%）相當(dāng)。與基質(zhì)模型組比較，Ento-Ia涂膜劑1875、3750 mg·kg-1劑量組均可提高腦組織內(nèi)SOD活性并能減少M(fèi)DA含量（中劑量組，P<005；高劑量組P<001）；同時(shí)，Ento-Ia涂膜劑能顯著降低小鼠急性不全性腦缺血小鼠腦組織EB含量（P<005）。結(jié)論：Ento-Ia涂膜劑經(jīng)皮給藥可對(duì)小鼠急性不完全性腦缺血誘發(fā)的腦損傷有明顯的保護(hù)作用，其機(jī)制可能通過(guò)干預(yù)腦缺血后腦組織的氧化應(yīng)激及其保護(hù)血腦屏障有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】Ento-Ia涂膜劑；經(jīng)皮給藥；急性不完全性腦缺血；存活時(shí)間；腦保護(hù)

【中圖分類號(hào)】R74331【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號(hào)】1007-8517（2017）02-0047-05

The Protect of Ento-Ⅰa Plastic on Acute Incomplete Cerebral Ischemia by Mice

ZHU Feng1，2HU Yuan1，2LIU Heng1，2，3XIAO Huai1，2，3YANG Zizhong1，2，3

ZHAO Hairong1，2，3

ZHANG Chenggui1，2，3HE Miao1，2，3*

1Yunnan Provincial Key Laboratory of Entomological Biopharmaceutical R&D， Institute of Entomoceutics Research， Dali University， Dali 671000， China；2National-Local Joint Engineering Research Center of Entomoceutics， Dali 671000， China；3Yunnan Provincial 2011 Collaborative Innovation Center for Entomoceutics， Dali University， Dali 671000， China

Abstract：Objective To investigote the protective effect of Ento-Ⅰa Plaster on acute mice incomplete cerebral ischemia. Methods 140 mice were divided into two batches to carry on the experiment， each batch 70. 70 rats were randomly divided into 7 groups， 10 in each group， the sham operation group， the Ento-Ⅰa coating group （3750mg·kg-1、1875mg·kg-1、938mg·kg-1）， the saline model group， the matrix model group， the nimodipine group （18 mg·kg-1， ig）. Ento-Ia plastic was given prophylactically for 5 days， establishment mice acute incomplete cerebral ischemia model by total bilateral carotid artery ligation in mice with vagus nerve， record survival time of mice after ischemia and the determination of mouse brain tissue SOD activity， MDA content and the content of Evans blueResults This research shows that Compared with the model group matrix， Ento-Ia plastic can significantly prolong the survival time of mice after ligation of bilateral common carotid artery with vagus nerve at a dose of 1875 mg·kg-1（P<005）， the extension rate was 3955%； At a dose of 13750 mg·kg-1， the effect was the best（P<001）， prolonged survival time of mice was 4515%， compared with the positive drug nimodipine （18mg·kg-1， the elongation rate of 4396%） Compared with the matrix model group， Ento-Ia plastic at the dose of 1875 and 3750mg·kg-1 dose group could increase the brain tissue SOD activity and reduce MDA content （middle dose group， P<005； high dose group P<001） At the same time， Ento-Ia plastic can significantly reduce the cerebral capillary permeability （P<005）， which is equivalent to the nimodipine group （P>005）. Conclusion Ento-Ⅰa plastic has obvious protective effect for transdermal delivery of mice with acute incomplete cerebral ischemia induced brain injury， its mechanism may be through the intervention of brain tissue of cerebral ischemia oxidative stress and protection of BBB.

Keywords：Ento-Ia Plastic； Transdermal Drug Delivery； Acute Incomplete Cerebral Ischemia； Survival Time； Cerebral Protection

卒中是人類致死和致殘的主要原因之一[1]，急性缺血性卒中（Acute Ischemic Stroke，AIS）約占全部卒中的80%。然而大多數(shù)情況下是非致死性卒中，長(zhǎng)期殘疾構(gòu)成人類的重大負(fù)擔(dān)[2]。AIS治療的關(guān)鍵在于盡早開通阻塞血管、挽救缺血半暗帶，然而，基于腦缺血的病理過(guò)程涉及復(fù)雜的時(shí)間和空間級(jí)聯(lián)反應(yīng)[3]，目前有關(guān)缺血性腦血管疾病的臨床治療依然存在很多問(wèn)題，因此開發(fā)保護(hù)缺血性腦損傷的藥物也同樣具有重要的理論意義和臨床價(jià)值[4]。同時(shí)，在急性腦卒中過(guò)程中的腦保護(hù)及神經(jīng)保護(hù)作用對(duì)于發(fā)病機(jī)制的研究是一項(xiàng)重大挑戰(zhàn)[5-7]。Ento-Ia是Ento-Ⅰ的同源性物質(zhì)，在現(xiàn)代應(yīng)用中可治療中風(fēng)偏癱后遺癥患者[8]，前期研究發(fā)現(xiàn)Ento-I具有防治腦血栓生成、恢復(fù)腦癱動(dòng)物活動(dòng)能力[9]、抗血小板聚集、減輕腦梗死面積[10]等作用，可用于制備防治心腦血管疾病創(chuàng)新生化藥物，用以預(yù)防和治療缺血性心腦血管等疾病，例如心梗、心血管血栓、腦血栓、腦梗、急/慢性腦卒中。本文通過(guò)采用小鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈帶迷走神經(jīng)結(jié)扎法觀察小鼠存活時(shí)間、小鼠腦組織超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）活性、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量的變化及通過(guò)測(cè)定腦組織伊文思藍(lán)（EB）含量，檢測(cè)小鼠的腦毛細(xì)血管通透性，以此初步評(píng)價(jià)Ento-Ia涂膜劑對(duì)小鼠急性不完全性腦缺血的保護(hù)作用，為臨床應(yīng)用和新藥研發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

11實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑動(dòng)物：雄性昆明種小鼠140只（由昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證編號(hào)：SCKX（滇）2011-0004），體重18～22 g。

試劑：尼莫地平組（拜耳醫(yī)藥保健有限公司，批號(hào)：BJ22848）；川芎嗪（針劑，哈爾濱三聯(lián)藥業(yè)有限公司，批號(hào)：121101A3）；Ento-Ⅰa涂膜劑（大理大學(xué)昆研院自制）；超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20141011）、丙二醛（MDA）試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20140422）。

12實(shí)驗(yàn)方法

121實(shí)驗(yàn)分組及給藥實(shí)驗(yàn)分為2批，每批70只小鼠，共140只。第一批用于測(cè)定Ento-Ia涂膜劑對(duì)小鼠急性不完全性腦缺血后的存活時(shí)間及腦缺血后小鼠腦組織中SOD、MDA含量的變化，第2批用于測(cè)定Ento-Ⅰa涂膜劑對(duì)急性不完全性腦缺血小鼠腦毛細(xì)血管通透性的影響。將70只小鼠平均分為7組，每組10只，分別是假手術(shù)組、生理鹽水模型組、基質(zhì)模型組、尼莫地平組（18mg·kg-1，ig）；Ento-Ⅰa涂膜劑3750、1875、938mg·kg-1劑量組。實(shí)驗(yàn)前將Ento-Ⅰa涂膜劑組及基質(zhì)涂膜劑組用人用脫毛膏在小鼠太陽(yáng)穴兩側(cè)部位進(jìn)行脫毛，7組小鼠分別按照實(shí)驗(yàn)分組及各組相應(yīng)的給藥劑量預(yù)防給藥7d，其中生理鹽水對(duì)照組及尼莫地平組灌胃給藥；Ento-Ⅰa涂膜劑高、中、低劑量組及基質(zhì)組按照相應(yīng)的含藥量太陽(yáng)穴涂抹給藥，30μL/只。

122Ento-Ia涂膜劑經(jīng)皮給藥小鼠急性不完全性腦缺血后存活時(shí)間及小鼠腦組織中SOD、MDA含量的影響造模方法：將小鼠用乙醚在密閉的玻璃缸中進(jìn)行淺麻醉，用小動(dòng)物手術(shù)器械仔細(xì)分離出雙側(cè)頸總動(dòng)脈，并在左側(cè)及右側(cè)頸總動(dòng)脈帶迷走神經(jīng)下穿過(guò)1根5-0號(hào)手術(shù)線，結(jié)扎兩側(cè)頸總動(dòng)脈帶迷走神經(jīng)造成小鼠急性不完全性腦缺血[11-12]。假手術(shù)組只分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，不結(jié)扎。

記錄結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈后各組小鼠的存活時(shí)間。待小鼠死亡后開顱取腦，去除嗅球、小腦和延髓，腦組織勻漿后離心取上清，置于-80℃保存，按照試劑盒說(shuō)明書分別測(cè)定腦組織中MDA含量和SOD活性。MDA含量測(cè)定采用硫代巴比妥酸法按操作步驟進(jìn)行，于532nm處測(cè)定吸光度；SOD活性采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定，于550nm處測(cè)定吸光度，考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白含量[13]。

123Ento-Ia涂膜劑經(jīng)皮給藥急性不完全性腦缺血對(duì)小鼠腦毛細(xì)血管通透性的影響繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：將伊文思藍(lán)配制成系列濃度（039、078、156、312、624、1248、2496μg/mL），在分光光度計(jì)620 nm處測(cè)定吸光度（A）值。以濃度為橫坐標(biāo)、吸光度（A）值為縱坐標(biāo)，得回歸直線方程：Y=00892X-0005，R2=09975。

124小鼠腦缺血后腦中伊文思藍(lán)含量的測(cè)定分組及給藥方法同上，并按“122”項(xiàng)方法進(jìn)行造模。末次給藥后1h，假手術(shù)組小鼠尾靜脈注射伊文思藍(lán)（50mg·kg-1），5min后分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈帶迷走神經(jīng)，但不結(jié)扎，其余各組小鼠在結(jié)扎兩側(cè)頸總動(dòng)脈帶迷走神經(jīng)前5min尾靜脈注射伊文思藍(lán)（50mg·kg-1），2h后斷頭，小心剝?nèi)蓚?cè)大腦半球，稱濕重（去小腦、延髓），加入05%硫酸鈉溶液3mL與丙酮7mL勻漿，密封放置1h，3000rpm離心10min，取上清液，以丙酮︰05%硫酸（7∶3）混合液調(diào)零，620nm處測(cè)定吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出腦內(nèi)伊文思藍(lán)的含量（μg/g腦濕重）。

2統(tǒng)計(jì)方法

計(jì)量資料以均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用單因素方差分析（one-way ANOVA）進(jìn)行組間均數(shù)的顯著性檢驗(yàn)，并以LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較；計(jì)數(shù)資料以χ2檢驗(yàn)及Fisher確切概率法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 170進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析（α=005）。

3實(shí)驗(yàn)結(jié)果

31Ento-Ia涂膜劑經(jīng)皮給藥對(duì)小鼠結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈帶迷走神經(jīng)后存活時(shí)間的影響生理鹽水模型組與基質(zhì)模型組比較，小鼠存活時(shí)間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>005）；假手術(shù)組小鼠剝離頸總動(dòng)脈和迷走神經(jīng)，小鼠正常存活，說(shuō)明手術(shù)操作對(duì)小鼠的存活無(wú)影響。與生理鹽水組比較，尼莫地平組（18 mg·kg-1）可以顯著延長(zhǎng)小鼠急性不完全性缺血后的存活時(shí)間，其延長(zhǎng)率為4396%；與基質(zhì)模型組比較，Ento-Ⅰ涂膜劑不同劑量組均可以延長(zhǎng)腦缺血小鼠的存活時(shí)間，Ento-Ia涂膜劑低劑量組延長(zhǎng)率為2164%，中劑量組為3955%，高劑量組為4515%，藥效呈現(xiàn)一定的劑量關(guān)系。提示Ento-Ia通過(guò)經(jīng)皮給藥途徑可以明顯延長(zhǎng)小鼠急性不完全性缺血存活時(shí)間。見(jiàn)表1。

32Ento-Ia涂膜劑對(duì)腦缺血小鼠腦組織SOD活力、MDA含量的影響生理鹽水模型組與基質(zhì)模型組比較，小鼠腦內(nèi)SOD和MDA含量變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>005）；兩組模型組與假手術(shù)組相比，SOD活力均顯著性下降、MDA含量均顯著性升高（P<001），證明小鼠結(jié)扎頸總動(dòng)脈造模形成的急性腦缺血，引發(fā)了機(jī)體SOD活力的迅速降低及MDA含量的迅速升高。與生理鹽水組比較，尼莫地平組可以顯著提高腦組織SOD活力、降低MDA含量（P<001）；與基質(zhì)模型組比較，Ento-Ia涂膜劑3750、1875、938 mg·kg-1劑量組能升高SOD的活力、降低MDA的含量，結(jié)果呈現(xiàn)一定的劑量依賴性，其中Ento-Ia涂膜劑高劑量組最明顯（P<001），且與假手術(shù)組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表2。

33Ento-Ia涂膜劑對(duì)腦缺血小鼠腦毛細(xì)血管通透性的影響小鼠腦缺血后腦中伊文思藍(lán)的含量可表示腦毛細(xì)血管的通透性。與假手術(shù)組相比，模型組小鼠腦缺血后腦中伊文思藍(lán)含量明顯增高（P<001），說(shuō)明小鼠急性非完全性腦缺血模型造模成功；與模型組比較，Ento-Ⅰa涂膜劑太陽(yáng)穴給藥能顯著降低小鼠腦缺血后腦中伊文思藍(lán)含量（P<005）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，Ento-Ⅰa涂膜劑太陽(yáng)穴給藥可以顯著降低小鼠腦缺血后的腦毛細(xì)血管的通透性，從而具有強(qiáng)效的腦缺血保護(hù)作用。見(jiàn)表3。

4討論

41腦缺血的發(fā)病機(jī)制缺血性腦血管病屬于中醫(yī)“中風(fēng)”范疇，多起病較緩，靜態(tài)發(fā)病，大多清醒，無(wú)頭痛嘔吐等癥狀。中風(fēng)主要是由脈絡(luò)閉阻、氣血逆亂和臟腑氣機(jī)失調(diào)等引起[14]。缺血性腦血管疾病的病因和缺血后腦損傷機(jī)制至今尚未完全闡明，而治療上又存在著臨床療效有限、時(shí)間窗窄及治療副作用大等一系列難題，針對(duì)這些難題尋找新的、更有效的治療方法就成為了亟待解決的科學(xué)問(wèn)題[15]。而大腦對(duì)缺血極為敏感，短期腦缺血即能導(dǎo)致一系列的功能及代謝紊亂。腦缺血導(dǎo)致腦梗死后可能引發(fā)能量損耗[16]、酸中毒[17]、細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載[18]、興奮性氨基酸毒性作用[19]、氧化應(yīng)激[19-20]和自由基損傷[25]、炎癥[21]和細(xì)胞凋亡[22]等繼發(fā)性腦損傷，這幾種因素之間相互作用、相互影響，構(gòu)成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，形成惡性循環(huán)，造成一系列病理級(jí)聯(lián)反應(yīng)，繼而導(dǎo)致病情加重[23]。

42腦缺血模型的制作及缺血后自由基的生成本實(shí)驗(yàn)復(fù)制小鼠急性不完全性腦缺血損傷模型[10]，由于血流的突然阻斷，組織嚴(yán)重缺氧，微循環(huán)血流障礙，最終導(dǎo)致供血區(qū)腦組織異常、壞死，以此來(lái)模擬臨床急性腦缺血患病的過(guò)程。小鼠急性腦缺血后存活時(shí)間不符合正態(tài)分布，在結(jié)果處理中采用非參數(shù)檢驗(yàn)的方式對(duì)其進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析[24]。

另有研究表明，氧化應(yīng)激是腦缺血再灌注后最早出現(xiàn)和最重要的損傷機(jī)制[25-27]。正常情況下，機(jī)體所產(chǎn)生的少量氧自由基，很快就會(huì)被體內(nèi)的自由基清除系統(tǒng)迅速清除，不會(huì)造成細(xì)胞、組織及機(jī)體損傷。腦缺血再灌注時(shí)所產(chǎn)生的大量自由基，如果體內(nèi)SOD等抗氧化酶的清除能力下降，將會(huì)導(dǎo)致氧自由基大量堆積，引發(fā)細(xì)胞膜的脂質(zhì)過(guò)氧化，從而破壞膜的結(jié)構(gòu)和功能。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化終產(chǎn)物，可間接反映出機(jī)體受自由基攻擊的嚴(yán)重程度。本研究表明，Ento-Ⅰa可升高腦缺血后腦組織內(nèi)SOD活力及明顯降低腦組織內(nèi)MDA含量，即Ento-Ia可減輕腦缺血引起的脂質(zhì)過(guò)氧化損傷。另外，實(shí)驗(yàn)亦表明，Ento-Ia涂膜劑可顯著延長(zhǎng)小鼠急性不完全性腦缺血的存活時(shí)間。

43血腦屏障對(duì)腦組織的保護(hù)作用Ento-Ia涂膜劑對(duì)腦缺血后腦組織的保護(hù)作用可能和其減輕血腦屏障（BBB）的損傷有關(guān)[10]。BBB是存在于血液和腦組織之間的一道屏障，對(duì)維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定起重要作用。伊文思藍(lán)為腦血管通透性指示劑，正常情況下不易通過(guò)血腦屏障，但血腦屏障受到破壞時(shí)，伊文思藍(lán)易于進(jìn)入腦組織。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用伊文思藍(lán)為示蹤劑，通過(guò)測(cè)定各組小鼠腦缺血后腦中伊文思藍(lán)含量，觀察藥物對(duì)急性不完全性腦缺血小鼠斷頭后腦毛細(xì)血管通透的影響，進(jìn)而評(píng)價(jià)其對(duì)腦缺氧動(dòng)物的腦保護(hù)功效。

綜上所述，Ento-Ia涂膜劑可以有效延長(zhǎng)小鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎后小鼠存活時(shí)間、升高SOD活性及降低MDA含量，并具有降低腦缺血損傷小鼠腦毛細(xì)血管通透性的作用。但是，本實(shí)驗(yàn)只是通過(guò)小鼠急性不完全性腦缺血這一種模型來(lái)驗(yàn)證Ento-Ia涂膜劑的藥效，并不能完全涵蓋腦缺血的臨床病因，關(guān)于Ento-Ia對(duì)不同原因所致腦缺血的保護(hù)作用及相應(yīng)的作用機(jī)制，我們會(huì)在后期研究中繼續(xù)深入探討。

目前由Ento-Ia毒素制備的透皮吸收制劑治療腦缺血的藥效研究工作正在開展，前期研究表明Ento-Ia毒素可減少M(fèi)CAO-I/R大鼠腦梗死面積，可能是恢復(fù)大鼠大腦皮質(zhì)區(qū)血流。提示其可用于臨床治愈癱瘓、失語(yǔ)的中風(fēng)病人，其機(jī)制可能與Ento-Ia毒素的抗凝、溶栓及其透過(guò)血腦屏障有關(guān)。因此下一步的工作是確定抗腦缺血的Ento-Ia毒素的組分及其抗腦缺血的機(jī)制。

致謝：云南省昆蟲及蛛形類資源開發(fā)利用工程實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期致力于昆蟲生物藥物的研發(fā)，在昆蟲藥物治療心腦血管疾病的研究方面擁有豐富的經(jīng)驗(yàn)，本實(shí)驗(yàn)的條件由工程實(shí)驗(yàn)室藥理藥效學(xué)研究平臺(tái)提供，非常感謝實(shí)驗(yàn)室老師對(duì)于本實(shí)驗(yàn)的指導(dǎo)、同學(xué)對(duì)于本實(shí)驗(yàn)的幫助。

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（編輯：梁志慶）