徐凱悅(XU Kai-yue)，強(qiáng)翠欣(QIANG Cui-xin)，趙建宏(ZHAO Jiang-hong)

(河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院 河北省臨床檢驗(yàn)中心，河北 石家莊 050000)

·綜述·

細(xì)菌對(duì)利福平耐藥機(jī)制研究進(jìn)展

徐凱悅(XU Kai-yue)，強(qiáng)翠欣(QIANG Cui-xin)，趙建宏(ZHAO Jiang-hong)

(河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院 河北省臨床檢驗(yàn)中心，河北 石家莊 050000)

利福平； 耐藥機(jī)制； RNA聚合酶； 利福平耐藥決定區(qū)； rpoB

利福霉素為袢霉素類家族成員，可用于治療多種感染，如結(jié)核病、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌感染、艱難梭菌引起的艱難梭菌相關(guān)性腹瀉(Clostridiumdifficile-associated diarrhea, CDAD)、衣原體的持續(xù)感染[1]、旅行者腹瀉[2]等。然而，利福霉素廣泛用于臨床感染治療的同時(shí)，細(xì)菌耐藥問(wèn)題卻使該殺菌“利器”變得“鈍化”。結(jié)核分枝桿菌極易對(duì)利福平(rifampin, RIF)耐藥，約有3.6%新增結(jié)核病和20.2%復(fù)治結(jié)核病為耐多藥結(jié)核病[3]。CDAD是成人醫(yī)院獲得性腹瀉的主要原因[4]，利福霉素類中利福昔明因其口服不易被吸收，用于治療復(fù)發(fā)性CDAD[5]，然而艱難梭菌對(duì)利福霉素耐藥率高達(dá)11%[6]。如何在正常發(fā)揮藥物抗菌作用的同時(shí)減少細(xì)菌耐藥的產(chǎn)生，關(guān)系臨床抗感染治療的成敗。本文在介紹RIF抗菌機(jī)制的基礎(chǔ)上，對(duì)細(xì)菌耐RIF的機(jī)制予以綜述，為臨床開(kāi)發(fā)新的細(xì)菌轉(zhuǎn)錄抑制劑類藥物提供幫助，以便更加有效的治療感染。

1 RIF抗菌機(jī)制

因此，細(xì)菌可通過(guò)β亞基的編碼基因—rpoB突變，造成氨基酸的改變，導(dǎo)致對(duì)RIF親和力降低，進(jìn)而對(duì)RIF耐藥。然而作用靶點(diǎn)突變并不是唯一的耐藥機(jī)制，其他耐藥機(jī)制亦有報(bào)道，如對(duì)藥物的修飾滅活作用、膜通透性改變、外排泵等。

2 rpoB突變是細(xì)菌對(duì)利福平耐藥(RIFr)主要機(jī)制

有關(guān)大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌和結(jié)核分枝桿菌等細(xì)菌對(duì)RIF的耐藥機(jī)制已有報(bào)道，其中最常見(jiàn)且可引起高水平耐藥的機(jī)制為rpoB突變。

由于RNAP在細(xì)菌中較為保守，因此RIFr株的rpoB突變位點(diǎn)也較保守，故常將其他細(xì)菌的突變位點(diǎn)與大腸埃希菌相應(yīng)序列進(jìn)行比對(duì)。本文涉及不同細(xì)菌耐藥突變位點(diǎn)時(shí)，除非有特別說(shuō)明，一律使用大腸埃希菌β亞基氨基酸的相應(yīng)位點(diǎn)進(jìn)行描述。

2.1 大腸埃希菌RIFr盡管大腸埃希菌感染不在RIF的適應(yīng)證范圍，但大腸埃希菌為細(xì)菌研究的模式菌株，且該菌轉(zhuǎn)錄起始及終止過(guò)程研究也較為詳盡。20世紀(jì)80年代，Jin等[8]對(duì)引起大腸埃希菌RIFr的rpoB位點(diǎn)突變進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)耐藥突變位點(diǎn)位于rpoB的中部，分為三個(gè)區(qū)域：cluster I(507-533位氨基酸)，cluster II(563-572位氨基酸)，cluster III(687位氨基酸)。rpoB中所包含這些耐藥突變的區(qū)域稱為利福平耐藥決定區(qū)(rifampin resistance determing region, RRDR)。上述提到的水生棲熱菌RNAP中與RIF存在氫鍵或范德華力的12個(gè)氨基酸，均位于RRDR cluster I—II中，且除E445(水生棲熱菌RpoB蛋白編碼)外，其他11個(gè)氨基酸的突變均可引起RIFr[7]。此外，還有一個(gè)靠近β亞基N端的區(qū)域(N cluster)，其突變亦可導(dǎo)致RIFr。研究[9]發(fā)現(xiàn)，大腸埃希菌RIFr株β亞基第146位氨基酸存在替換，而該位點(diǎn)位于cluster I—III外。隨后， Severinov等[10]通過(guò)基因定點(diǎn)突變方法，證實(shí)了rpoB N cluster(143-148位氨基酸)突變可導(dǎo)致RIFr。

正如Jin等[8]所假設(shè)的，核心酶中β亞基各部分間似乎通過(guò)彼此合作形成RIF結(jié)合區(qū)。利用某些間接方法，我們可知大腸埃希菌RNAP活性中心及其與RIF結(jié)合位點(diǎn)相互作用的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，如將聚合酶-啟動(dòng)子復(fù)合物與β亞基交聯(lián)到一起后，進(jìn)行限制性酶解和化學(xué)降解，發(fā)現(xiàn)RRDR中的cluster I參與活性中心的形成[11]。

2.2 結(jié)核分枝桿菌RIFr結(jié)核分枝桿菌為緩慢生長(zhǎng)菌，其鑒定及傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)約需12周，時(shí)間長(zhǎng)，使得患者早期不能得到個(gè)性化的治療，增加耐藥株出現(xiàn)的風(fēng)險(xiǎn)。而RIFr為耐多藥結(jié)核的一個(gè)可靠標(biāo)志，到目前為止，大部分RIFr結(jié)核分枝桿菌同時(shí)也對(duì)異煙肼耐藥[12]。因此，盡可能全面地了解結(jié)核分枝桿菌中與RIFr有關(guān)的rpoB突變，有利于從分子角度快速檢測(cè)耐藥株。

結(jié)核分枝桿菌RIFr突變主要集中在rpoB中一個(gè)長(zhǎng)度為81bp(β亞基第507-533位氨基酸，位于cluster I內(nèi))的熱點(diǎn)突變區(qū)中，稱為結(jié)核分枝桿菌的RIFr決定區(qū)。報(bào)道顯示，約95%的結(jié)核分枝桿菌RIFr突變位于該區(qū)內(nèi)[13]，其中第516、526和531位氨基酸替換最多見(jiàn)[14]。Jamieson等[15]在2株耐多藥結(jié)核分枝桿菌中發(fā)現(xiàn)V146F替換，而該位點(diǎn)位于大腸埃希菌rpoB N cluster(β亞基第143-148位氨基酸)，同樣引起RIFr[10]。

了解結(jié)核分枝桿菌RIFr株的rpoB突變情況，有助于利用分子方法快速檢測(cè)疑似感染患者體內(nèi)的結(jié)核分枝桿菌及其耐藥性?，F(xiàn)已有多種快速檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌RIFr株的方法，如高分辨率溶解曲線分析[16]以及基于鎖核酸(locked nucleic acid, LNA)探針的實(shí)時(shí)PCR技術(shù)[17]等。2013年美國(guó)食品藥品管理局(FDA)批準(zhǔn)了一種商品化的基于PCR法檢測(cè)痰標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌DNA的試劑盒，可同樣檢測(cè)RIFr株[18]。

2.3 艱難梭菌RIFr艱難梭菌是專性厭氧革蘭陽(yáng)性芽孢桿菌, 被認(rèn)為是引起抗生素相關(guān)性腹瀉的主要病原菌之一，嚴(yán)重感染者可發(fā)生假膜性腸炎、腸壞死甚至死亡。近年由于艱難梭菌高產(chǎn)毒株(027/NAP1/BI型)在世界多個(gè)地區(qū)的暴發(fā)流行，使艱難梭菌成為醫(yī)院獲得性腹瀉的主要病原菌[19]。利福霉素類抗生素，尤其是利福昔明可用于治療復(fù)發(fā)性CDAD[5]。然而，艱難梭菌對(duì)利福霉素的耐藥時(shí)有發(fā)生。據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)[6]估計(jì)，艱難梭菌對(duì)RIF的耐藥率達(dá)11%，且有升高趨勢(shì)。Freeman等[20]對(duì)歐洲22個(gè)國(guó)家艱難梭菌耐藥監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)，17個(gè)國(guó)家出現(xiàn)RIFr艱難梭菌，尤其是意大利、捷克、丹麥和匈牙利出現(xiàn)了高比率耐藥(57%～64%)。有報(bào)道[21]指出，利福霉素暴露是患者發(fā)生耐藥艱難梭菌感染的危險(xiǎn)因素之一，甚至在用利福霉素治療期間就可發(fā)生耐藥艱難梭菌感染[22]。面對(duì)日益嚴(yán)峻的耐藥形勢(shì)，了解其耐藥機(jī)制尤為重要。目前認(rèn)為艱難梭菌RIFr通常與rpoB突變有關(guān)，涉及的氨基酸替換為第502、505、548、488、492和498位(艱難梭菌RpoB蛋白編碼)等，大多對(duì)應(yīng)于RRDR cluster I，其中第502、505位氨基酸替換最為多見(jiàn)[21,23-27]。

3 其他RIFr機(jī)制

除上述耐藥機(jī)制之外，某些菌屬本身的RNAP對(duì)RIF不敏感，如密螺旋體屬、疏螺旋體屬、端螺旋體屬和一些土壤放線菌，原因在于其rpoB第531位的密碼子為天冬酰胺而非敏感菌屬中的絲氨酸[28]。

除rpoB突變外，細(xì)菌可通過(guò)其他方式對(duì)RIF產(chǎn)生低水平耐藥，如RNAP結(jié)合蛋白的保護(hù)作用、對(duì)RIF修飾滅活、膜通透性改變和外排泵的過(guò)度表達(dá)等。

天藍(lán)色鏈霉菌可耐受低濃度RIF，Newell等[29]研究顯示其RNAP結(jié)合蛋白R(shí)bpA介導(dǎo)該菌的低水平耐藥，另外，該研究發(fā)現(xiàn)在結(jié)核分枝桿菌、麻風(fēng)分枝桿菌和白喉棒狀桿菌中亦存在rbpA同源基因。近來(lái)有研究[30]顯示，結(jié)核分枝桿菌RbpA通過(guò)間接的方式介導(dǎo)耐藥，并不影響RNAP對(duì)RIF的敏感性，而是調(diào)整RNAP核心酶結(jié)構(gòu)，增加核心酶對(duì)σA的親和性，加速σA指導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄，從而產(chǎn)生耐藥。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)，RbpA結(jié)合于RNAP β亞基Sandwich-Barrel Hybrid模體上，且該區(qū)域并不與RIF結(jié)合位點(diǎn)重合。DnaA蛋白可與RNAP結(jié)合，在一定程度上削弱RIF對(duì)RNAP的抑制作用[31]。Dey等[32]經(jīng)體內(nèi)及體外研究證實(shí)，恥垢分枝桿菌MsRbpA蛋白可與RNAP β亞基相互作用，提高RNAP對(duì)RIF的耐受水平，介導(dǎo)低水平耐藥，同時(shí)該研究發(fā)現(xiàn)MsRbpA同源體保守存在于分枝桿菌屬中。Weiss等[33]研究顯示，在結(jié)核分枝桿菌中削弱CarD/RNAP β亞基的相互作用可增加該菌對(duì)RIF敏感性。

某些細(xì)菌可通過(guò)對(duì)RIF修飾使其失活從而產(chǎn)生耐藥。常見(jiàn)的修飾方式為糖基化、核糖基化、磷酸化和脫色效應(yīng)，其中脫色效應(yīng)與單加氧酶有關(guān)[34]。在敲除皮疽諾卡菌rpoB2后，單加氧酶介導(dǎo)的脫色效應(yīng)成為其耐藥的主要方式[35]。恥垢分枝桿菌可使RIF核糖基化而對(duì)其天然耐藥，該菌表達(dá)的Arr蛋白具有單ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶作用，催化利福霉素類藥物ADP-核糖基化，使其失活[36]。此外，該研究發(fā)現(xiàn)，arr同源基因廣泛存在于環(huán)境細(xì)菌及嗜麥芽窄食單胞菌、洋蔥伯克霍爾德菌、天藍(lán)色鏈霉菌和谷氨酸棒狀桿菌等細(xì)菌中。研究[37]顯示，對(duì)RIF同系物C25位修飾后可抵抗恥垢分枝桿菌ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶對(duì)其滅活作用。Spanogiannopoulos等[38]從環(huán)境放線菌中分離出1株RIFr放線菌—WAC1438，發(fā)現(xiàn)其可對(duì)RIF進(jìn)行糖基化失活，rgt1438為其糖基轉(zhuǎn)移酶編碼基因。1994年研究[39]發(fā)現(xiàn),細(xì)菌可以通過(guò)磷酸轉(zhuǎn)移酶將RIF磷酸化而失活，然而，直到最近才有研究揭示了放線菌中該酶的編碼基因rph[40]。該研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)rph上游的一段保守序列——利福平相關(guān)元件(RAE)，該序列與RIF滅活酶編碼基因有關(guān)。同時(shí)研究指出，RIF敏感菌中亦存在rph同源基因，如產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌和臘樣芽孢桿菌。近來(lái)，Qi等[41]獲得產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌RIF磷酸轉(zhuǎn)移酶(LmRPH)在不同催

另外，細(xì)菌還可通過(guò)降低膜通透性、調(diào)節(jié)外排泵或膜通道蛋白的表達(dá)而耐藥。分枝桿菌屬細(xì)菌由于其獨(dú)特的富于脂質(zhì)的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)導(dǎo)致膜通透性低，因而對(duì)多種抗生素天然耐藥。有研究[43]顯示，恥垢分枝桿菌細(xì)胞壁中Wag31-AccA3與胞壁脂質(zhì)的通透性和對(duì)親脂性藥物(如RIF)耐藥有關(guān)，敲除Wag31后胞壁對(duì)親脂性分子通透性增強(qiáng)，對(duì)RIF敏感性增加，AccA3過(guò)度表達(dá)則結(jié)果反之。許多細(xì)菌外排泵可將RIF排至細(xì)胞外，導(dǎo)致低水平耐藥,如結(jié)核分枝桿菌[44-45]。波賽鏈霉菌可產(chǎn)生2種抗腫瘤分子——阿霉素和道諾霉素，其drrAB編碼的DrrAB外排系統(tǒng)，屬ABC結(jié)合盒類轉(zhuǎn)運(yùn)體，可將該2種分子排至細(xì)胞外。近有研究[46]顯示，該轉(zhuǎn)運(yùn)體為多藥轉(zhuǎn)運(yùn)體，RIF為其底物之一。恥垢分枝桿菌中，marRAB操縱子編碼兩種ABC結(jié)合盒類轉(zhuǎn)運(yùn)體，MarR蛋白通過(guò)調(diào)節(jié)marRAB操縱子的表達(dá)，進(jìn)而影響細(xì)菌對(duì)RIF的耐藥性。與其他外排泵不同的是，該菌中此2種ABC結(jié)合盒類轉(zhuǎn)運(yùn)體過(guò)度表達(dá)反而增加細(xì)菌對(duì)RIF的敏感性，因此，該菌中的MarR蛋白為阻遏蛋白，抑制marRAB操縱子的表達(dá)，產(chǎn)生耐藥[47]。此外，某些細(xì)菌可通過(guò)膜表面通道蛋白的表達(dá)調(diào)節(jié)對(duì)RIF的耐藥性。Danilchanka等[48]研究顯示，牛分枝桿菌卡介苗膜通道蛋白CpnT的編碼基因cpnT的突變，可導(dǎo)致RIFr，與此同時(shí)，研究人員認(rèn)為該CpnT膜通道蛋白可能與臨床分離的無(wú)法用已知耐藥基因突變解釋的結(jié)核分枝桿菌耐藥有關(guān)。

4 總結(jié)與展望

rpoB RRDR堿基突變是細(xì)菌對(duì)RIF呈高水平耐藥的主要機(jī)制。此外，細(xì)菌對(duì)RIF的共價(jià)修飾、RNAP結(jié)合蛋白的保護(hù)作用以及外排泵的過(guò)度表達(dá)等亦為細(xì)菌對(duì)RIFr的機(jī)制。對(duì)耐藥機(jī)制的研究有助于優(yōu)化治療，減少耐藥的產(chǎn)生，如外排泵抑制劑與利福霉素的聯(lián)合應(yīng)用或許可縮小單藥對(duì)細(xì)菌的耐藥突變選擇窗，有利于減少耐藥的產(chǎn)生；對(duì)利福霉素某些位點(diǎn)進(jìn)行改造，抵抗滅活酶的修飾；根據(jù)細(xì)菌rpoB耐藥突變情況，優(yōu)化或開(kāi)發(fā)新的利福霉素等。

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(本文編輯：熊辛睿)

Advances in rifampin resistance mechanism in bacteria

(The Second Hospital of Hebei Medical University Hebei Provincial Center for Clinical Laboratories, Shijiazhuang 050000, China)

2016-08-20

河北省自然科學(xué)基金(H2013206450)；河北省科技廳基礎(chǔ)條件平臺(tái)建設(shè)項(xiàng)目(10966142D)；河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院科研基金(2h2201605)

徐凱悅 (1990-)，女(漢族)，河北省石家莊市人，檢驗(yàn)師，主要從事細(xì)菌感染性病原體的檢測(cè)與流行病學(xué)研究。

趙建宏 E-mail：zhaojh_2002@yahoo.com

10.3969/j.issn.1671-9638.2017.02.021

R378

A

1671-9638(2017)02-0186-05