李存玉+馬赟+劉奕洲+李紅陽+顧佳美+彭國(guó)平

[摘要]采用超濾納濾聯(lián)用技術(shù)濃縮益母草中生物堿，通過響應(yīng)面法建立二次回歸模型，優(yōu)化濃縮工藝。實(shí)驗(yàn)表明通過超濾預(yù)處理，益母草水提液中總蛋白去除率9438%，納濾技術(shù)相較于傳統(tǒng)熱濃縮優(yōu)勢(shì)明顯，益母草生物堿的最佳濃縮工藝為截留相對(duì)分子質(zhì)量450，pH 307，鹽酸水蘇堿質(zhì)量濃度8015 mg·L-1，總生物堿質(zhì)量濃度28573 mg·L-1，在此條件下，鹽酸水蘇堿和總生物堿的截留率分別為9337%，9585%，相對(duì)誤差為079%，116%，BoxBehnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法可以用于益母草生物堿的濃縮工藝優(yōu)化，納濾濃縮為熱敏性中藥成分的分離精制提供技術(shù)支撐。

[關(guān)鍵詞]生物堿； 益母草； 鹽酸水蘇堿； 納濾； 濃縮； 超濾

益母草為唇形科植物益母草Leonurus japonicus Houtt的新鮮或干燥地上部分，具有活血調(diào)經(jīng)，利尿消腫，清熱解毒的功效[1]，通過處方調(diào)劑廣泛用于臨床，如益母草顆粒、新生化顆粒等[23]。生物堿是益母草的主要藥效成分，其中指標(biāo)性成分水蘇堿和益母草堿在光照和長(zhǎng)時(shí)間加熱條件下均會(huì)降解，影響制劑質(zhì)量的同時(shí)也是藥用資源的浪費(fèi)，同時(shí)此技術(shù)難題在制藥行業(yè)中也難以避免[4]。膜分離技術(shù)在制藥行業(yè)中應(yīng)用日趨廣泛，其中納濾具有分離過程無熱效應(yīng)，能耗低等優(yōu)點(diǎn)[56]，超濾可以去除大分子雜質(zhì)而對(duì)小分子目標(biāo)成分影響較小，由于膜組件串聯(lián)應(yīng)用在中藥行業(yè)尚處于摸索階段[7]，本文探索超濾納濾聯(lián)用優(yōu)化益母草中生物堿的納濾濃縮參數(shù)。響應(yīng)面法（response surface methodology，RSM）是采用多元二次回歸方程擬合各因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，對(duì)回歸方程的分析而尋找最佳工藝參數(shù)，從而解決多變量問題的一種統(tǒng)計(jì)方法[89]。本文旨在單因素考察的基礎(chǔ)上[10]，以益母草中鹽酸水蘇堿和總生物堿為指標(biāo)，開展益母草水提液濃縮工藝研究，為含有熱敏性成分的中藥濃縮提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1材料

益母草藥材購自安徽亳州，批號(hào)20151005，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)陳建偉教授鑒定為唇形科植物益母草L japonicus的干燥地上部分。

復(fù)合聚酰胺納濾膜，截留相對(duì)分子質(zhì)量100，450，800，購自南京拓鉒醫(yī)藥科技有限公司；聚醚砜超濾膜，截留相對(duì)分子質(zhì)量1萬，5萬，10萬，購自南京拓鉒醫(yī)藥科技有限公司；鹽酸水蘇堿對(duì)照品（批號(hào)110773201313，純度≥98%），購自中國(guó)食品藥品檢定研究院；BCA蛋白含量檢測(cè)試劑盒購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；乙腈為色譜純，水為純化水，其他試劑均為分析純。

Waters e2695 高效液相色譜儀，蒸發(fā)光散射檢測(cè)器，購自美國(guó)Waters公司；TNZ1納濾分離設(shè)備（南京拓鉒醫(yī)藥科技有限公司）；T6紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；KH250B型超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；PB10型pH計(jì)（德國(guó)Sartorius公司）；蘇泊爾電磁爐（型號(hào)SDHC8E15210，浙江蘇泊爾股份有限公司）。

2方法

21益母草水提液制備

稱取益母草藥材10 kg，按照體積質(zhì)量比，分別加入10，8倍純化水提取2次，每次1 h，提取液使用045 μm微孔濾膜過濾，合并濾液，即得。

22超濾去除大分子

為提高納濾分離效率、減輕膜組件污染，采用超濾去除益母草提取液中的蛋白等大分子物質(zhì)。取益母草水提液，分別采用截留相對(duì)分子質(zhì)量1萬，5萬，10萬超濾膜過濾，以鹽酸水蘇堿、總生物堿和總蛋白質(zhì)含量的動(dòng)態(tài)變化為指標(biāo)，篩選超濾參數(shù)。

23納濾分離單因素考察

按照實(shí)驗(yàn)參數(shù)要求選擇納濾膜，組裝納濾濃縮裝置，取益母草超濾液（2 L）置于納濾系統(tǒng)中進(jìn)行循環(huán)平衡，待鹽酸水蘇堿在納濾膜中的吸附解吸附達(dá)到平衡時(shí)，取樣平衡液，進(jìn)而將溶液進(jìn)行納濾，待納濾完成后，取樣納濾液。

為了排除納濾分離過程中膜吸附對(duì)益母草中鹽酸水蘇堿等生物堿類成分的影響，同時(shí)確定納濾分離環(huán)境參數(shù)，以鹽酸水蘇堿和生物堿含量變化為指標(biāo)，選擇藥液平衡體積、溶液溫度、操作壓力對(duì)益母草超濾液的納濾濃縮效果進(jìn)行單因素試驗(yàn)，具體參數(shù)。

3結(jié)果與分析

31超濾去除大分子去除效果比較

3種截留相對(duì)分子質(zhì)量的超濾膜對(duì)益母草提取液中成分的分離情況對(duì)比見表3。

鹽酸水蘇堿相對(duì)分子質(zhì)量為1795，在3種孔徑的超濾膜中的透過率均高于98%，損失不明顯。益母草總生物堿隨著超濾膜孔徑增大，透過率明顯升高，其中在1萬時(shí)損失超過10%，說明益母草表3不同截留相對(duì)分子質(zhì)量超濾膜對(duì)益母草中生物堿和蛋白的分離效果

截留相對(duì)

分子質(zhì)量透過率鹽酸水蘇堿總生物堿總蛋白1萬987488611765萬9937972656210萬992699041445

中含有部分大分子或者多分子締合態(tài)形式存在的生物堿類成分。超濾技術(shù)在益母草水提液中的蛋白的去除方面優(yōu)勢(shì)明顯，1萬的超濾膜的蛋白的去除率高達(dá)98%以上，但隨著超濾膜截留相對(duì)分子質(zhì)量的增大，其透過率逐步升高，去除效果下降。在去除益母草水提液中大分子物質(zhì)的同時(shí)，保證生物堿類成分有效保留，選擇截留相對(duì)分子質(zhì)量為5萬的超濾膜對(duì)益母草水提液進(jìn)行預(yù)處理。

32單因素考察結(jié)果

321藥液循環(huán)平衡體積對(duì)納濾截留率的影響

在納濾平衡過程中，隨著益母草超濾液中生物堿類成分與納濾膜接觸，藥液中鹽酸水蘇堿和總生物堿的濃度均隨著膜吸附而逐步降低，見表4，當(dāng)平衡體積達(dá)到8 L時(shí)，溶液中生物堿濃度逐步穩(wěn)定，說明此時(shí)生物堿類成分與納濾膜之間的“吸附解吸附”達(dá)到平衡狀態(tài)[12]，與此同時(shí)鹽酸水蘇堿和總生物堿在450納濾膜中的截留率也趨于穩(wěn)定，因此選擇藥液平衡體積需大于8 L，可以保障納濾分離結(jié)果的重現(xiàn)性和準(zhǔn)確性。

4小結(jié)與結(jié)論

中藥制藥過程中通過加熱濃縮制劑中間體是常用技術(shù)手段，因此在加熱過程中出現(xiàn)的氧化反應(yīng)、聚合反應(yīng)和美拉德反應(yīng)等是難以避免的，生產(chǎn)能耗增加的同時(shí)直接導(dǎo)致中藥資源浪費(fèi)。此外，加熱濃縮過程中成分存在狀態(tài)、濃度以及成分間相互作用的差異性均與其穩(wěn)定性相關(guān)[15]，因此僅選擇加熱溫度、指標(biāo)性成分濃度等作為濃縮控制參數(shù)難以保障制劑中間體的質(zhì)量的均一性。因此在中藥制藥過程中尋找可以替代或者部分替代熱濃縮技術(shù)已迫在眉睫，在以益母草提取液的納濾濃縮工藝摸索中，以總生物堿和鹽酸水蘇堿為指標(biāo)，在保障生物堿得到充分截留的同時(shí)，益母草黃酮、萜類、糖類等成分仍然保留在提取液溶液中，因此納濾技術(shù)可以用于中藥制劑生產(chǎn)的濃縮環(huán)節(jié)，而針對(duì)中藥中某一類成分富集的選擇性較差，需要和樹脂等分離技術(shù)聯(lián)用才能達(dá)到預(yù)期精制目的。

膜分離技術(shù)具有分離參數(shù)易控、分離行為重現(xiàn)性、參數(shù)可線性放大等技術(shù)優(yōu)勢(shì)，基于此本論文選擇臨床常用中藥制劑中的益母草，結(jié)合膜分離技術(shù)優(yōu)勢(shì)，以鹽酸水蘇堿，總生物堿、蛋白含量為指標(biāo)，考察超濾預(yù)處理參數(shù)，以及納濾濃縮時(shí)藥液循環(huán)體積、溶液溫度、操作壓力、膜截留相對(duì)分子質(zhì)量、藥液濃度和pH對(duì)益母草中生物堿類成分的截留率，益母草生物堿在堿性至中性溶液環(huán)境中，多以游離態(tài)或部分離子態(tài)的形式存在，因此在進(jìn)行納濾濃縮時(shí)，多依靠膜分子篩分效應(yīng)進(jìn)行分離，隨著溶液pH降低，生物堿以解離態(tài)形式存在比例增加，且復(fù)合聚酰胺材質(zhì)納濾膜表面荷負(fù)電，成分與膜表面的電荷效應(yīng)增強(qiáng)而難以通過納濾膜，從而截留率升高，提升了納濾效果。

采用響應(yīng)面分析法中的BoxBehnken模式，對(duì)納濾濃縮參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化篩選，數(shù)學(xué)模型擬合程度高，實(shí)驗(yàn)誤差小，可用于實(shí)際預(yù)測(cè)。得到優(yōu)化工藝條件為：截留相對(duì)分子質(zhì)量450，pH 307，鹽酸水蘇堿質(zhì)量濃度8015 mg·L-1，總生物堿質(zhì)量濃度28573 mg·L-1，在此條件下鹽酸水蘇堿和總生物堿的截留率分別為9337%，9585%。在實(shí)驗(yàn)開展的同時(shí)，對(duì)比了常壓熱濃縮，發(fā)現(xiàn)在相同溶液環(huán)境下，采用85 ℃減壓熱濃縮至相同比重，鹽酸水蘇堿和總生物堿的保留率分別為7284%，8742%，說明采用納濾濃縮益母草提取液相較于傳統(tǒng)工藝優(yōu)勢(shì)明顯。但是納濾對(duì)分離對(duì)象的黏度具有一定要求，富含多糖等成分的高黏度中藥水提液納濾濃縮效率偏低，而傳統(tǒng)熱濃縮不受此項(xiàng)限制，也導(dǎo)致目前納濾技術(shù)在中藥濃縮應(yīng)用中尚有一定的局限性。

[參考文獻(xiàn)]

[1]中國(guó)藥典一部[S]2015：290

[2]王濤 新生化顆粒預(yù)防藥物流產(chǎn)后陰道出血的療效觀察[J]. 臨床合理用藥雜志， 2015（14）：63

[3]康明 益母草顆粒治療藥物流產(chǎn)后陰道出血的臨床觀察[J]. 吉林醫(yī)學(xué)， 2014（12）：2553

[4]黃鳴清，陳瑞云，謝友良，等 鹽酸水蘇堿在中藥生產(chǎn)過程中的含量變化及影響因素研究[J] 時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥， 2009， 20（10）：2587

[5]普文英，張衛(wèi)東 納濾新型的分離小分子有機(jī)物的膜技術(shù)[J] 中國(guó)藥房， 2000， 11（5）：234

[6]李存玉，錢祥，楊澤秋，等 基于納濾技術(shù)的消癌平注射液中的鉀離子去除工藝優(yōu)化[J] 中成藥， 2015， 37（2）：294

[7]韓偉，蔣一帥，魏雨恬 超濾納濾技術(shù)在金毛狗脊黃酮分離純化中的應(yīng)用[J] 南京工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版， 2015， 37（1）：1

[8]耿天華，汪濤，郭巧生，等 響應(yīng)面法優(yōu)化大孔樹脂純化昆侖雪菊色素的工藝[J] 中國(guó)中藥雜志， 2016， 41（2）：220

[9]金林，趙萬順，郭巧生，等 響應(yīng)面法優(yōu)化白芍提取工藝的研究[J] 中國(guó)中藥雜志， 2015， 40（15）：2988

[10]Andriy Y， Merlin L B， Edxon E L B SolutionDiffusionElectroMigration model and its uses for analysis of nanofiltration， pressureretarded osmosis and forward osmosis in multiionic solutions [J] J Membr Sci， 2013， 447：463

[11]曹玉華 BCA法測(cè)神奇靈顆粒劑中蛋白含量[J] 中國(guó)實(shí)用醫(yī)藥， 2009， 4（7）：43

[12]林立剛，葉卉，趙莉芝，等 膜吸附和膜吸收研究進(jìn)展[J] 中國(guó)工程科學(xué)， 2014（12）：59

[13]趙彥彥，袁其朋 有機(jī)相納濾分離過程中濃度、電荷、溶劑對(duì)溶質(zhì)截留行為的影響[J] 膜科學(xué)與技術(shù)， 2006， 26（5）：31

[14]Fang J， Deng B L Rejection and modeling of arsenate by nanofiltration：contributions of convection， diffusion and electromigration to arsenic transport [J] Membr Sci Technol， 2014， 453（453）：42.

[15]彭國(guó)平，蕭偉，倪健 中藥制藥化學(xué)[M] 北京：中國(guó)中醫(yī)藥出版社， 2016：203[責(zé)任編輯孔晶晶]

2017年1月 第42卷第1期Vol42， No 1January， 2017

[收稿日期]20160907

[基金項(xiàng)目]國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81274094）；國(guó)家“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng) （2012ZX09103201041）

[通信作者]*朱春燕，研究員，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)樾滦徒o藥系統(tǒng)，Tel：（010）57833263， Email：cyzhu@impladaccn

[作者簡(jiǎn)介]何亞麗，碩士研究生，Email：heyalisky@126com菠蘿葉提取物黏附漂浮微丸的

制備及評(píng)價(jià)