劉露

摘 要：為建立一種快速檢測錦鯉皰疹病毒（CyHV-3）的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法（LAMP），本研究根據(jù)GenBank中登錄的CyHV-3 TK基因編碼區(qū)序列設(shè)計(jì)了LAMP特異性引物，通過優(yōu)化反應(yīng)條件，建立了檢測CyHV-3的LAMP方法。表明本實(shí)驗(yàn)建立的該檢測方法具有高靈敏度、高特異性、快速和簡便的特性，適用于臨床上對(duì)錦鯉皰疹病毒3的快速診斷。

關(guān)鍵詞：LAMP；CyHV-3；快速檢測

0 引言

錦鯉皰疹病毒病是由鯉皰疹病毒3型Cyprinid herpesvirus 3（CyHV-3）感染引起鯉魚、錦鯉以及普通變種鰓壞死和間質(zhì)性腎炎的一種高致病性、高傳染性、高死亡率疾病?，F(xiàn)已在全世界范圍內(nèi)流行，嚴(yán)重威脅著鯉魚和錦鯉養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。

目前，已經(jīng)建立的對(duì)CyHV-3的檢測方法有DNA雜交、PCR、套式PCR、熒光定量PCR和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法（loop-mediatedisothermal amplification，LAMP）等。以上檢測方法在臨床檢測中均存在局限，如儀器設(shè)備，技術(shù)人員和成本等。LAMP檢測方法對(duì)儀器要求低，根據(jù)顏色變化通過肉眼可以對(duì)結(jié)果進(jìn)行判斷，適用于現(xiàn)地檢測。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料

含有CyHV-3 TK基因的重組質(zhì)粒，Bst DNA聚合酶（長片段）、Thermopol II反應(yīng)緩沖液，SYBR Green I熒光染料，Betaine，dNTP，DNAMarker，病毒DNA提取試劑盒，

1.2 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)中華人民共和國水產(chǎn)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中，鯉皰疹病毒檢測方法要求的CyHV-3的TK基因的序列，使用Primer Explorer V4設(shè)計(jì)8條特異性引物（表1），并交由上海生工合成。

1.3 LAMP擴(kuò)增

LAMP反應(yīng)體系：1μl F3/F3（10μM），1μl B3/B3（10μM），1μl FIP/FIP（50μM），1μl BIP/BIP（50μM），4μl dNTPs（25mM），4μl 10xThermopol buffer，8U BstDNA聚合酶，3μl Betaine（0.8M），2.5μl MgCl2（25mM），2μl模板DNA和4.5μl ddH2O，石蠟密封液面，之后加入2μlSYBR Green I，65℃孵育60min，80℃10min滅活酶終止反應(yīng)。

反應(yīng)管淡綠色為陽性，淡橘黃色為陰性。結(jié)果判定采用瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4 LAMP反應(yīng)條件優(yōu)化

分別通過不同溫度以及不同時(shí)間進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，優(yōu)化dNTPs、Betaine、MgCl2等其他反應(yīng)條件。

2 結(jié)果

LAMP的建立和檢測：以特異性引物對(duì)CyHV-3進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，肉眼觀察，CyHV-3陽性管渾濁.而陰性管未見渾濁，加入熒光染料SYBR Green I后，CyHV-3陽性管反應(yīng)液變?yōu)榈G色，而陰性對(duì)照管為棕色。

瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果顯示，CyHV-3陽性管出現(xiàn)典型的梯形條帶，而陰性管沒有產(chǎn)生條帶。

經(jīng)優(yōu)化后，LAMP體系最佳反應(yīng)時(shí)間為40min，最佳反應(yīng)溫度為65℃，dNTPs最適濃度為1.2mM、Betaine最佳濃度為0.8mM、MgCl2最佳濃度為8mM。

3 討論

自從錦鯉皰疹病毒發(fā)現(xiàn)以來，各個(gè)地區(qū)幾乎每年都有流行。目前，錦鯉皰疹病毒病的全球性暴發(fā)，給錦鯉觀賞業(yè)、鯉魚養(yǎng)殖業(yè)以及國際貿(mào)易造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

PCR是目前較為精確檢測CyHV-3感染的方法。Bercovier等基于CyHV-3的胸苷激酶基因建立的PCR方法，能夠區(qū)分CyHV-3與CyHV-1和CCV。劉葒等建立了nestedPCR，已作為我國檢測CyHV-3的標(biāo)準(zhǔn)方法。范萬紅等建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR縮短了檢測時(shí)間，適用于進(jìn)出口檢驗(yàn)檢疫。LAMP法是一種新式恒溫核酸擴(kuò)增方法，該擴(kuò)增法具有簡便、快速、準(zhǔn)確、廉價(jià)、易檢測等特點(diǎn)。Gunimaladevi等基于TK基因設(shè)計(jì)引物，建立了快速檢測CyHV-3的LAMP法。Soliman等在產(chǎn)物中加入SYBR GreenⅠ，根據(jù)其顏色的變化來判定結(jié)果，從而更加直觀。LAMP檢測法不需要特殊的儀器設(shè)備，適合現(xiàn)場診斷。因此LAMP法具有良好的應(yīng)用前景。

本實(shí)驗(yàn)建立的LAMP方法具有以下特點(diǎn)：第一速率快，僅40min左右即達(dá)到反應(yīng)的平臺(tái)期；第二、對(duì)反應(yīng)裝置要求較低，恒溫水浴鍋、PCR儀均能作為LAMP的恒溫反應(yīng)裝置；第三、結(jié)果觀察簡單，添加SYBR Green I核酸染料后肉眼即可觀察。本文提供了穩(wěn)定的CyHV-3檢測體系，為控制CyHV-3的流行與及時(shí)檢測提供了技術(shù)支持。

致謝

本研究由河北省研究生創(chuàng)新項(xiàng)目提供資金支持

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