任怡然 程雪蓮 梁昊岳 白 楊 楊晚竹 于文穎 陳 婷 付偉超 郭 丹*

超微量蛋白分析儀在微量樹突細(xì)胞中ERK蛋白及其磷酸化修飾檢測中的應(yīng)用研究*

任怡然①程雪蓮①梁昊岳①白 楊①楊晚竹①于文穎①陳 婷①付偉超①郭 丹①*

目的：建立利用超微量蛋白分析儀檢測微量細(xì)胞樣品中低豐度細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)及其磷酸化修飾的應(yīng)用方法，為在科研工作中應(yīng)用該儀器提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法：采用配制樣品溶液，上樣、分離、固定、免疫雜交和軟件定量等實(shí)驗(yàn)步驟，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測，對(duì)不同數(shù)目樹突狀細(xì)胞中ERK蛋白及其磷酸化修飾的定性及定量結(jié)果進(jìn)行分析。結(jié)果：超微量蛋白分析儀能夠檢測到低至2000個(gè)細(xì)胞中的目的蛋白并獲得定量數(shù)據(jù)，該儀器還能夠有效分辨出20000個(gè)細(xì)胞中ERK蛋白不同形式的磷酸化修飾。結(jié)論：超微量蛋白分析儀有效完成了對(duì)低豐度細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白以及蛋白質(zhì)翻譯后修飾檢測。

超微量蛋白分析儀；微量細(xì)胞；翻譯后修飾；定量；化學(xué)發(fā)光

[First-author’s address]State Key Laboratory of Experiment Hematology, Institute of Hematology, Hospital of Blood Disease, Chinese Academy of Medical Sciences &Peking Union Medical College, Tianjin 300020, China.

疾病標(biāo)志物往往是那些生物體內(nèi)的低豐度蛋白，傳統(tǒng)的蛋白分析技術(shù)所用的蛋白量通常很大，所得結(jié)果的分辨率及重復(fù)性很有限。超微量蛋白分析儀是一種新的蛋白質(zhì)分析系統(tǒng)，使用超微量蛋白分析儀的納米技術(shù)的超微量蛋白免疫分析(nanofluidic proteomic immunoassay，NIA)方法可做到對(duì)少量樣品、低豐度蛋白以及蛋白質(zhì)翻譯后修飾的定量研究[1-4]。超微量蛋白分析儀所用樣本量少，根據(jù)等電聚焦原理分離蛋白質(zhì)，能夠靈敏地鑒定出低豐度靶蛋白，并且能夠得到大量數(shù)據(jù)，定量地分析結(jié)果[4-6]。對(duì)于蛋白質(zhì)的研究而言，如何更加靈敏、快速、準(zhǔn)確地獲得相關(guān)蛋白質(zhì)的定量信息，對(duì)日后蛋白質(zhì)研究發(fā)展成果向臨床醫(yī)療轉(zhuǎn)化具有重要的意義。

細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated Protein kinase，ERK)1/2是絲裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)家族中一條重要信號(hào)通路，能夠被多種細(xì)胞外刺激激活，調(diào)控細(xì)胞生長、增殖、分化以及死亡[7-11]。本研究以樹突狀細(xì)胞為樣本，研究不同細(xì)胞數(shù)目的樣品中ERK，以及采用脂多糖刺激后ERK蛋白產(chǎn)生磷酸化修飾的定性及定量信息，為微量細(xì)胞中低豐度蛋白質(zhì)及蛋白質(zhì)翻譯后修飾研究提供更加全面的幫助和支持。

1 超微量蛋白分析儀原理

自然界存在的天然蛋白質(zhì)分子帶有電荷，而蛋白質(zhì)的翻譯后修飾，如磷酸化、乙酰化、甲基化等會(huì)改變蛋白質(zhì)的電荷。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)所處溶液的pH值不等于其等電點(diǎn)時(shí)蛋白質(zhì)帶有電荷，并會(huì)在電場中移動(dòng)；當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)處于穩(wěn)定的pH值梯度中，即pH值等于等電點(diǎn)時(shí)蛋白質(zhì)凈電荷為0，在電場中不再移動(dòng)，因此通過等電點(diǎn)分離，可以有效區(qū)分同一蛋白質(zhì)的不同異構(gòu)體及不同修飾?；诖嗽恚⒘康鞍追治鰞x運(yùn)行可以分為上樣、分離、固定、免疫雜交和定量5個(gè)步驟。將樣品與兩性電解質(zhì)、熒光pH值指示劑混合，進(jìn)行毛細(xì)管電泳，蛋白質(zhì)會(huì)根據(jù)等電點(diǎn)在毛細(xì)管里等電聚焦，遷移到固定位置后由紫外光線激活毛細(xì)管壁的化學(xué)交聯(lián)作用，將蛋白質(zhì)捕獲，再用高靈敏度一抗、二抗進(jìn)行免疫雜交，在顯色液作用下檢測到化學(xué)發(fā)光信號(hào)值，獲得定量信息[3，6，12]。

2 超微量蛋白分析儀的應(yīng)用

2.1 設(shè)備與材料

(1)采用Nanopro 1000超微量蛋白分析儀(美國ProteinSimple公司)；384孔板(美國ProteinSimple公司)；細(xì)胞裂解液Bicine/CHAPS Lysis Buffer(美國ProteinSimple公司)；熒光指示劑PI Ladder 3(美國ProteinSimple公司)；蛋白酶抑制劑(美國ProteinSimple公司)；兩性電解質(zhì)G3 premix(美國ProteinSimple公司)；抗體稀釋液(美國ProteinSimple公司)。

(2)樹突狀細(xì)胞(DC細(xì)胞)、一抗anti-ERK1/2抗體(ml)、一抗(抗磷酸)ERK1/2抗體[細(xì)胞信號(hào)技術(shù)(cell signaling technology，CST)]以及二抗(抗磷酸) HRP(細(xì)胞生物科學(xué))均來自美國CST公司。

2.2 實(shí)驗(yàn)流程

2.2.1 配制上樣溶液

不同樣品細(xì)胞數(shù)目分別為500個(gè)、1000個(gè)、2000個(gè)、4000個(gè)和8000個(gè)，陰性對(duì)照不加細(xì)胞，陽性對(duì)照加入20000個(gè)細(xì)胞，結(jié)合ERK1/2抗體。將脂多糖刺激的細(xì)胞分為兩組，每組細(xì)胞數(shù)目為20000個(gè)，一組與ERK1/2抗體孵育，一組與抗磷酸ERK1/2抗體孵育。上樣溶液配制為下述步驟。

(1)通過流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)，直接將一定數(shù)目細(xì)胞分選到384孔板內(nèi)，在384孔板內(nèi)加入10 μl Bicine/ CHAPS裂解緩沖液裂解，冰上裂解30 min。

(2)將G3 premix與PI Ladder 3按44 μl∶1 μl的比例配成預(yù)混液，渦旋振蕩15 s；將細(xì)胞裂解液與預(yù)混液按1∶3混合。同時(shí)加入蛋白酶抑制劑，使終濃度為1×磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffered saline，PBS)。

(3)按1∶50將一抗與抗體稀釋液混勻，總體積50 μl，按1∶100將二抗與抗體稀釋液混勻，總體積50 μl；按1∶1將底物發(fā)光液A與B混勻，總體積50 μl。

(4)將含有樣品的混合液、一抗稀釋液、二抗稀釋液以及底物發(fā)光液加入384孔板不同排。樣品每孔5 μl，其他每孔6 μl。

(5)加樣后將384孔板置于4 ℃離心機(jī)，2500 r/min離心5 min，須保證孔板里無氣泡。離心后將孔板置于冰上等待上機(jī)。

2.2.2 上機(jī)設(shè)置及實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

(1)打開Compass軟件，在Assay界面設(shè)置板布局：A排為樣品，B排為一抗稀釋液，C排為二抗稀釋液，F(xiàn)排為底物發(fā)光液；設(shè)置蛋白質(zhì)分離時(shí)間為40 min；一抗孵育時(shí)間為2 h，二抗孵育時(shí)間為1 h；設(shè)置曝光時(shí)間分別為30 s、60 s、120 s、240 s、480 s和960 s；附件設(shè)備：清洗瓶裝滿超純水，廢液瓶倒空；實(shí)驗(yàn)試劑盒耗材：放置毛細(xì)管盒，儀器清洗液、陽極液和陰極液；將384孔板放入儀器；運(yùn)行程序。

(2)使用Compass軟件分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 毛細(xì)管中蛋白分離情況監(jiān)測

超微量蛋白分析儀Compass軟件可實(shí)時(shí)監(jiān)控蛋白質(zhì)在毛細(xì)管中的分離情況。該實(shí)驗(yàn)根據(jù)ERK等電點(diǎn)，使用兩性電解質(zhì)G3 premix，其分離范圍為等電點(diǎn)5～8，熒光指示劑PI Ladder 3會(huì)根據(jù)等電點(diǎn)分離，在等電點(diǎn)4.9、6.0、6.4、7.0和7.3處有熒光標(biāo)志(如圖1所示)。

圖1 毛細(xì)管中蛋白分離情況示圖

圖中每一橫排代表一個(gè)樣品，隨著分離時(shí)間的增加，熒光標(biāo)志也會(huì)分離在毛細(xì)管不同位置以實(shí)時(shí)監(jiān)測蛋白質(zhì)分離情況。實(shí)驗(yàn)中ERK蛋白的等電點(diǎn)為5～7，如果能看到熒光指示劑4.9和7.3在視野內(nèi)則能說明蛋白也在此區(qū)間內(nèi)。選取5個(gè)樣品為例，由圖1中A觀察顯示，每個(gè)樣品中5個(gè)不同等電點(diǎn)的熒光標(biāo)志均在視野內(nèi)顯示，表示蛋白質(zhì)在毛細(xì)管中分離情況正常。圖1中B顯示的是不同時(shí)間監(jiān)測窗口中熒光標(biāo)志的變化，分別為5 min時(shí)和10 min時(shí)PI Ladder 3在毛線管中的分離狀態(tài)。在5 min時(shí)熒光指示劑彌漫在整個(gè)毛細(xì)管中，隨著時(shí)間的增加，而10 min時(shí)熒光指示劑已經(jīng)慢慢等電聚焦。整個(gè)分離時(shí)間為40 min，最終熒光指示劑在毛細(xì)管中的分布會(huì)形成圖1A所示。

3.2 不同細(xì)胞數(shù)目樣品結(jié)果

(1)當(dāng)細(xì)胞數(shù)目樣品為8000個(gè)細(xì)胞時(shí)可以看到清晰的蛋白峰，為4000個(gè)細(xì)胞時(shí)仍可以看到蛋白峰，但峰型較小。ERK1和ERK2蛋白質(zhì)的熒光信號(hào)值分別為19.5和105.4，ERK2的S/N＞10，為19.3。2000個(gè)細(xì)胞時(shí)，ERK1和ERK2的熒光信號(hào)值分別為5.9和27.7，ERK1和ERK2的S/N＜10，但軟件仍可以檢測到蛋白峰。1000個(gè)細(xì)胞組和500個(gè)細(xì)胞時(shí)蛋白峰與背景噪音不可區(qū)分，軟件不可檢出。對(duì)照組結(jié)果，正對(duì)照含有20000個(gè)細(xì)胞，蛋白峰圖清晰且熒光信號(hào)值強(qiáng)，ERK1和ERK2蛋白質(zhì)的熒光信號(hào)值分別為1262.8和3845.4，ERK1和ERK2的S/N遠(yuǎn)＞10，為107.3和436.5。但由于細(xì)胞數(shù)目多，除了目的蛋白，會(huì)出現(xiàn)少量雜蛋白峰。負(fù)對(duì)照組無細(xì)胞，可以看到圖中無任何信號(hào)。不同細(xì)胞數(shù)目樣品的蛋白峰如圖2所示。

圖2 不同細(xì)胞數(shù)目樣品中ERK蛋白峰示圖

(2)ERK1和ERK2的熒光信號(hào)值分別為130.8和470.7且信噪比(S/N)均＞10，分別為23.6和85.9，表明該結(jié)果有意義?？梢愿鶕?jù)蛋白峰面積信息對(duì)目的蛋白進(jìn)行定量研究，不同細(xì)胞數(shù)目樣品的定量信息見表1。

表1 不同細(xì)胞數(shù)目樣品中ERK蛋白定量信息

(3)Nanopro 1000超微量蛋白分析儀相當(dāng)于更加靈敏和精準(zhǔn)的微量western，該系統(tǒng)可以生成模擬western結(jié)果的泳道圖，如圖3所示。

圖3 不同細(xì)胞數(shù)目樣品中目的蛋白的模擬western泳道圖

圖3 顯示的是不同細(xì)胞數(shù)目樣品中ERK蛋白的模擬western泳道圖，該結(jié)果與蛋白峰圖顯示結(jié)果一致，正對(duì)照組有明顯的ERK1、ERK2蛋白條帶以及少量雜蛋白。負(fù)對(duì)照無條帶。在8000個(gè)細(xì)胞時(shí)顯示明顯的ERK1、ERK2蛋白條帶。在4000個(gè)細(xì)胞時(shí)仍可見ERK1、ERK2條帶，但是顏色略淺，其他細(xì)胞數(shù)目樣品條帶不可見。

3.3 ERK蛋白磷酸化修飾結(jié)果

(1)使用總ERK抗體去結(jié)合樣品時(shí)，ERK1、ERK2、pERK1、pERK2、ppERK1以及ppERK2都有清晰的蛋白峰。用ERK蛋白磷酸化抗體結(jié)合樣品時(shí)，峰圖中只顯示幾個(gè)有磷酸化修飾的峰。結(jié)果表明，nanopro 1000超微量蛋白分析儀能夠靈敏的檢測出蛋白質(zhì)翻譯后修飾，將有修飾的蛋白與未修飾蛋白清晰的區(qū)分開，樣品磷酸化修飾的結(jié)果如圖4所示。

圖4 目的蛋白磷酸化修飾峰示圖

表2 目的蛋白磷酸化修飾定量信息

(2)ERK蛋白磷酸化修飾定量結(jié)果顯示，所有峰的S/N均＞10。峰面積信息也可以作為定量研究的依據(jù)，見表2。

(3)目的蛋白磷酸化修飾模擬western泳道圖結(jié)果與蛋白峰圖顯示結(jié)果一致，在總蛋白樣品中以及磷酸化修飾樣品中可見ERK蛋白及其各種磷酸化修飾的條帶，可以進(jìn)行定性觀察，如圖5所示。

圖5 目的蛋白磷酸化修飾模擬western泳道圖

4 討論

運(yùn)用Nanopro 1000超微量蛋白分析儀對(duì)不同數(shù)目的細(xì)胞樣品以及目的蛋白翻譯后修飾進(jìn)行研究，證明該儀器能夠?qū)Φ拓S度蛋白定性及定量，并且適用于蛋白質(zhì)翻譯后修飾研究。該儀器對(duì)信號(hào)通路的研究提供了新的視角[13-14]。隨著蛋白質(zhì)研究的不斷深入，Nanopro 1000超微量蛋白分析儀也應(yīng)用于臨床研究。有文獻(xiàn)報(bào)道，使用Nanopro 1000超微量蛋白分析儀研究20例早期結(jié)直腸癌患者術(shù)后缺血組織樣本中與癌癥相關(guān)生物標(biāo)志物磷酸化修飾的定量結(jié)果，發(fā)現(xiàn)與正常組織相比，ERK1/2非磷酸化增多、AKT磷酸化增多、MEK1/2磷酸化增多[5]。Tikhanovich等[15]報(bào)道，使用Nanopro 1000超微量蛋白分析儀對(duì)foxo3蛋白不同形式的翻譯后修飾進(jìn)行定量，研究丙型肝炎病毒和酒精共同作用誘導(dǎo)產(chǎn)生的foxo3翻譯后修飾這一復(fù)雜模型是如何導(dǎo)致丙肝發(fā)病，有效地為臨床檢測提供科學(xué)依據(jù)。

5 結(jié)語

隨著超微量蛋白分析技術(shù)的發(fā)展，該技術(shù)在科學(xué)研究領(lǐng)域的應(yīng)用更加廣闊，可成為臨床檢測的重要手段。

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Application study of Nanopro 1000 in the detection of ERK protein in trace dendritic cells and its phosphorylation product/

REN Yi-ran, CHENG Xue-lian, LIANG Hao-yue, et al//China Medical Equipment,2017,14(2):131-134.

Objective:To understand the principles of Ultramicro-protein analyzer system and provide a reference for using it by analyzing low abundance ERK in trace dendritic cell and its phosphorylation product. And to provide application experience of this equipment in science and research work.Methods:The qualitative and quantitative results of ERK and its phosphorylation product in different numbers of dendritic cells were analyzed by means of preparation of sample, such as solution, instrument operation and software analysis.Result:Ultramicro protein analyzer system can detect target protein in as low as 2000 cells and obtain quantitative data. The instrument also can efficiently distinguish different phosphorylation modification form of ERK in 20000 cells.Conclusion:This system is very helpful for the study of low abundance extracellular regulation protein and post-translational modification of proteins.

Nanopro 1000 system; Trace cell; Post-translational modification; Quantification; Chemiluminescence

1672-8270(2017)02-0131-04

R197.39

A

10.3969/J.ISSN.1672-8270.2017.02.039

2016-11-04

天津市應(yīng)用基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計(jì)劃(青年項(xiàng)目)(15JCQNJC10300)“G-CSF動(dòng)員造血干祖細(xì)胞的分子機(jī)制研究”

①中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病醫(yī)院血液學(xué)研究所 實(shí)驗(yàn)血液學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 天津 300020

*通訊作者：guodan@ihcams.ac.cn

任怡然,女,(1990- ),碩士研究生。技師。中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病醫(yī)院血液學(xué)研究所 實(shí)驗(yàn)血液學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，研究方向：基因與蛋白相關(guān)儀器的應(yīng)用。