黃建盛，陳 剛，張健東，湯保貴，王忠良，周 暉

（廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，湛江 524088）

響應(yīng)曲面法分析低鹽條件下溫度與pH對(duì)斜帶石斑魚幼魚能量代謝的聯(lián)合效應(yīng)

黃建盛，陳 剛，張健東，湯保貴，王忠良，周 暉

（廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，湛江 524088）

采用二因素五水平的中心復(fù)合設(shè)計(jì)和響應(yīng)曲面分析方法，以溫度（21～33℃）和pH（6.5～8.5）為因子，以耗氧率和排氨率為響應(yīng)指標(biāo)，探討了在低鹽條件下溫度和pH對(duì)斜帶石斑魚（Epinephelus coioides）幼魚能量代謝的聯(lián)合影響。結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)條件下，隨著溫度的上升，耗氧率（MO2）和排氨率（MTAN）呈上升的變化；隨著pH的上升，MO2和MTAN呈先上升后下降的變化。溫度一次效應(yīng)對(duì)幼魚的MO2影響極顯著（P＜0.01），二次效應(yīng)對(duì)幼魚的MO2影響顯著（P＜0.05）；pH一次效應(yīng)對(duì)幼魚MO2影響顯著（P＜0.05），二次效應(yīng)影響極顯著（P＜0.01）；溫度與pH互作效應(yīng)對(duì)MO2影響顯著（P＜0.05）。溫度一次效應(yīng)對(duì)幼魚的MTAN影響極顯著（P＜0.01），二次效應(yīng)對(duì)幼魚的MTAN無(wú)顯著影響（P＞0.05）；pH一次效應(yīng)和二次效應(yīng)對(duì)幼魚MTAN影響顯著（P＜0.05）；溫度與pH互作效應(yīng)對(duì)MTAN無(wú)顯著影響（P＞0.05）。所考察因子與幼魚MO2、MTAN間二次多項(xiàng)回歸過程的決定系數(shù)分別為0.981 1、0.954 6（P＜0.01），可用于分析與預(yù)測(cè)。通過對(duì)所建立的回歸方程同時(shí)優(yōu)化，得到溫度與pH的最佳組合為：溫度31.2℃和pH 7.6。在此組合條件下，幼魚MO2、MTAN最大值分別為188.44 mgO2·（kg·hr）－1；7.01 mgTAN·（kg·hr）－1，可靠度為0.902。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，低鹽條件下斜帶石斑魚養(yǎng)殖可在本實(shí)驗(yàn)中得到的最優(yōu)因子組合下進(jìn)行，以提高生產(chǎn)效益。

斜帶石斑魚；耗氧率；排氨率；低鹽水體；響應(yīng)面法

魚類攝取食物后，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)經(jīng)過一系列復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng)為機(jī)體提供能量，這一過程受到內(nèi)在因素和外在因素的共同影響。水溫和水體pH是魚類生物能量學(xué)的重要影響因子，水溫主要通過改變魚體體溫，從而對(duì)魚體組織細(xì)胞內(nèi)的各種酶活力產(chǎn)生影響，進(jìn)一步影響魚體新陳代謝的水平；水體pH也是主要通過改變代謝酶活力而影響能量代謝［1］。關(guān)于溫度、pH對(duì)魚類能量代謝的研究已有一些報(bào)道，如，鮸（Miichthys miiuy）幼魚的耗氧率隨溫度升高而增大并呈指數(shù)相關(guān)，pH對(duì)鮸幼魚耗氧率無(wú)顯著影響［2］；條石鯛（Oplegnathus fasciatus）幼魚耗氧率、排氨率隨溫度的升高而增大［3］。卵形鯧鲹（Trachinotus ovatus）幼魚隨著溫度的升高，耗氧率和排氨率均是先增大后減少；隨著pH的升高，耗氧率無(wú)顯著性變化，排氨率呈先增大后減少的趨勢(shì)［4］。上述這些研究結(jié)果揭示了溫度和pH對(duì)魚類能量代謝的變化規(guī)律。然而，上述的研究主要集中在單因素的溫度和pH幾個(gè)孤立的水平上對(duì)能量代謝的影響，沒有涉及環(huán)境因子之間的互作效應(yīng)，同時(shí)，上述這些研究只分析了溫度或pH對(duì)能量代謝的一次效應(yīng)，并未建立模型和考察溫度或水體pH的二次效應(yīng)，使得研究結(jié)果缺乏可靠的預(yù)測(cè)性。

目前，斜帶石斑魚（Epinephelus coioides）作為廣東、海南、福建等地區(qū)的海水網(wǎng)箱養(yǎng)殖的主要品種之一正在蓬勃發(fā)展著，并成為沿海部分地區(qū)水產(chǎn)養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)增長(zhǎng)的支柱產(chǎn)業(yè)之一。然而，近年來(lái)為了避免沿海地區(qū)的惡劣環(huán)境因素對(duì)其生長(zhǎng)造成的風(fēng)險(xiǎn)，逐漸發(fā)展池塘低鹽度養(yǎng)殖并取得成功。目前，關(guān)于水溫和水體pH對(duì)低鹽條件下斜帶石斑魚幼魚能量代謝的聯(lián)合效應(yīng)尚未見有報(bào)道。本文在已有研究基礎(chǔ)上，應(yīng)用中心復(fù)合試驗(yàn)設(shè)計(jì)（central composite design，CCD）分析方法考察溫度與水體pH對(duì)斜帶石斑魚幼魚在低鹽環(huán)境下耗氧率和排氨率的聯(lián)合影響，并對(duì)各因子的二次效應(yīng)及其交互作用進(jìn)行分析。并結(jié)合響應(yīng)曲面法（response surface methodology，RSM）分析耗氧率、排氨率隨溫度和pH的變化規(guī)律，建立相應(yīng)模型，旨在為斜帶石斑魚低鹽養(yǎng)殖生理生態(tài)及養(yǎng)殖過程中水質(zhì)管理提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)魚和低鹽適應(yīng)

實(shí)驗(yàn)于2013年6月10日～8月10日于廣東海洋大學(xué)魚類實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，共60 d。實(shí)驗(yàn)魚為廣東海洋大學(xué)魚類實(shí)驗(yàn)室在廣東省湛江市東海島生物研究基地繁育的幼魚，選取健康、活力好的幼魚600 ind充氧運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，幼魚平均體質(zhì)量23.67 g，平均體長(zhǎng)10.3 cm。在實(shí)驗(yàn)室水槽中暫養(yǎng)，水槽共40個(gè)，規(guī)格為70 cm×50 cm×60 cm，每個(gè)水槽15 ind魚，暫養(yǎng)期間，持續(xù)充氣，自然光照，每天8∶00時(shí)和16∶00時(shí)各飽食投喂1次，溶解氧保持在6 mg·L－1以上，水溫為（27.5 ±0.3）℃，pH 7.8，氨氮＜0.01 mg·L－1，自然海水的鹽度為28～31，每天換水1次。暫養(yǎng)2周后，待幼魚攝食正常后每個(gè)水槽中開始加入經(jīng)曝氣后的自來(lái)水，以每天2～4個(gè)鹽度單位逐漸降低水體鹽度至12左右，并保持在此鹽度下穩(wěn)定適應(yīng)1周。鹽度測(cè)定使用手持式鹽度計(jì)（HSS－100，上海精密儀器儀表有限公司）進(jìn)行測(cè)定。每天換水一次，并盡量保持水體環(huán)境因子一致，換水量根據(jù)水質(zhì)情況而定。

實(shí)驗(yàn)所用的飼料為東丸石斑魚專用C6配合飼料（廣東越群海洋生物研究開發(fā)有限公司），近似營(yíng)養(yǎng)成分：水分9.01%，粗蛋白52.94%，粗脂肪12.21%，粗灰分14.51%，粗纖維3.0%以下，鈣2.0%以下，磷1.8%以下。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)魚馴化

實(shí)驗(yàn)魚經(jīng)過低鹽適應(yīng)后，先開始溫度馴化，采用漸變方式進(jìn)行，每天溫度升降控制在2℃范圍之內(nèi)，用電子恒溫棒和冰袋控溫，馴化至相應(yīng)溫度后開始進(jìn)行相應(yīng)的pH馴化。水體pH也采用漸變方式調(diào)節(jié)，用鹽酸（0.2 mol·L－1）和氫氧化鈉（0.2 mol·L－1）調(diào)節(jié)，每天變幅不超過0.5，pH測(cè)定采用pH計(jì)（PHS－3C，上海精密儀器儀表有限公司）進(jìn)行測(cè)定。馴化至相應(yīng)pH后，穩(wěn)定適應(yīng)1周后開始實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

正式實(shí)驗(yàn)前先進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，通過單因子實(shí)驗(yàn)確定低鹽條件下斜帶石斑魚可以正常攝食和生長(zhǎng)的水體溫度和pH范圍。實(shí)驗(yàn)采用中心復(fù)合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，因子為溫度（21～33℃）和pH（6.5～8.5）。該實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因子點(diǎn)數(shù)4，軸點(diǎn)數(shù)4，中心點(diǎn)數(shù)5，星號(hào)臂α＝1.41，共計(jì)13次實(shí)驗(yàn)組合，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組合重復(fù)3次。能量代謝為耗氧率及排氨率為響應(yīng)指標(biāo)，具體的溫度和pH組合見表1。

1.2.3 響應(yīng)指標(biāo)測(cè)定

耗氧率測(cè)定所用測(cè)定裝置是間歇性流水式呼吸儀（AQUARE SP，Qubit Systems Inc.，Canada，下文簡(jiǎn)稱呼吸儀）（圖1）。此套系統(tǒng)測(cè)定過程包括測(cè)定、水體交換及等待3個(gè)階段，在測(cè)定階段，呼吸室完全封閉，測(cè)定時(shí)間可根據(jù)時(shí)間需要調(diào)節(jié)，通常最長(zhǎng)以水中溶氧量下降不大于呼吸前溶氧的10%為基礎(chǔ)。測(cè)定階段結(jié)束后是水體交換階段啟動(dòng)，以更新呼吸室內(nèi)的水保持溶解氧飽和度，接著是短暫的滯后等待階段。如此往復(fù)，實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)時(shí)間實(shí)時(shí)測(cè)定。溶解氧探頭（OxyGuard Probes，德國(guó)）安裝在呼吸室里面，通過數(shù)據(jù)采集器連接到計(jì)算機(jī)，在計(jì)算機(jī)軟件（RESP-EDU）中可直接讀出耗氧率的數(shù)據(jù)。

將馴化至實(shí)驗(yàn)設(shè)置的溫度－pH組合條件后，暫養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)魚禁食3 d（以確保胃排空）。禁食后隨機(jī)取實(shí)驗(yàn)魚稱量濕重后，輕輕地轉(zhuǎn)入相應(yīng)條件呼吸室內(nèi)，待魚穩(wěn)定適應(yīng)后進(jìn)行呼吸測(cè)定和水樣采集（用于測(cè)定氨氮）。從取魚稱重到轉(zhuǎn)入呼吸室過程時(shí)間在5 min內(nèi)，而且盡量避免實(shí)驗(yàn)魚反應(yīng)過激。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組合梯度測(cè)定6 ind魚，有4套呼吸裝置，其中3套呼吸裝置放置1 ind魚，剩下的1套呼吸裝置不放置魚，留作空白對(duì)照組。耗氧率數(shù)據(jù)直接由呼吸儀在線測(cè)定讀取，至少讀取5個(gè)數(shù)據(jù)取平均值作為該尾魚耗氧率。呼吸儀持續(xù)測(cè)定每尾魚耗氧率，每次需要時(shí)間13～19 min，包括水體交換時(shí)間6～9 min，測(cè)定時(shí)間6～9 min，等待時(shí)間1 min。

圖1 間歇性流水呼吸系統(tǒng)原理結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Map of intermittent flow respirometry

排氨率測(cè)定用于測(cè)定排氨率的水樣采集時(shí)間與耗氧率測(cè)定時(shí)間相對(duì)應(yīng)。在呼吸室進(jìn)水時(shí)間點(diǎn)（測(cè)起始氨氮含量）和出水時(shí)間點(diǎn)（測(cè)終末氨氮含量）迅速取10 mL的水樣用于氨氮測(cè)定。氨氮測(cè)定用Test Kits氨氮測(cè)試盒（默克公司，原理：水楊酸分光光度法）采用分光光度計(jì)（6600，UVVIS，德國(guó)）在340 nm光波下測(cè)定。一般而言，氨態(tài)氮是氮排泄的主要物質(zhì)，故不考慮其它形式的氮化合物。排氨率的計(jì)算公式如下：

式中，V是呼吸室的有效體積（L）；△ATAN是在測(cè)定期間氨氮質(zhì)量濃度的變化量（mg·L－1）；△T是測(cè)定時(shí)間（h）；W是幼魚濕重（kg）。

氧氮比計(jì)算根據(jù)測(cè)定的耗氧率、排氨率的數(shù)據(jù)計(jì)算氧氮比。計(jì)算公式如下：

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)測(cè)定結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean± SD）表示，通過最小二乘法擬合因子與響應(yīng)值之間的二次多項(xiàng)回歸方程為：

Y＝b0＋b1T＋b2pH＋b3T×pH＋b4T2＋b5pH2式中，Y是響應(yīng)變量（在此響應(yīng)為耗氧率或排氨率）；b0為回歸常數(shù)；b1為溫度的一次效應(yīng)；b2為pH的一次效應(yīng)；b3為溫度與pH間的互作效應(yīng)；b4為溫度的二次效應(yīng)；b5為pH的二次效應(yīng)。

采用Design-Expert（v8.0）軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)溫度、pH與響應(yīng)值進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸擬合并繪制響應(yīng)曲面圖和等高線圖。并對(duì)回歸模型方差分析和系數(shù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，當(dāng)P＜0.05時(shí)認(rèn)為差異顯著，P＜0.01時(shí)認(rèn)為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 耗氧率

溫度與pH不同組合對(duì)低鹽水體下斜帶石斑魚幼魚耗氧率的測(cè)定結(jié)果見表1，并對(duì)所測(cè)定的結(jié)果采用最小二乘法進(jìn)行回歸擬合，得到幼魚耗氧率與溫度、pH之間實(shí)際的二次多項(xiàng)回歸模型為：

MO2＝－1 644.19＋31.31T＋341.46pH－1.84T×pH－0.20T2－19.15pH2

式中，R2＝0.981 1，校正系數(shù)R2＝0.967 6，說明回歸模型能解釋98.11%響應(yīng)值的變化，僅有總變異的1.89%不能用此模型解釋，精密度（adeq precisior）是指有效信號(hào)與噪聲的比值，大于4.0視為合理，耗氧率模型精密度達(dá)到27.284，因此說明回歸模型擬合程度良好。

對(duì)幼魚耗氧率回歸模型方差分析進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果見表2。表2中的數(shù)據(jù)顯示，回歸模型F＝72.77，P＝0.000 1＜0.01，表明回歸模型極顯著；失擬項(xiàng)F＝0.36，P＝0.784 2＞0.05，說明所建立的模型有效。因此，可以用上述回歸模型來(lái)分析和預(yù)測(cè)溫度和pH對(duì)幼魚的耗氧率的結(jié)果。

幼魚耗氧率回歸模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果見表3。表3中數(shù)據(jù)顯示，溫度一次效應(yīng)對(duì)幼魚的耗氧率有極顯著影響（P＜0.01），二次效應(yīng)對(duì)幼魚的耗氧率有顯著影響（P＜0.05）；pH一次效應(yīng)對(duì)幼魚耗氧率有顯著影響（P＜0.05），二次效應(yīng)有極顯著影響（P＜0.01）；溫度與pH互作效應(yīng)對(duì)耗氧率有顯著影響（P＜0.05）。

溫度與pH和幼魚的耗氧率之間的響應(yīng)曲面及其等高線圖見圖2所示。通過圖2能直觀地評(píng)價(jià)溫度與pH對(duì)幼魚耗氧率的相互作用，等高線的性狀可反映出兩因子交互效應(yīng)的強(qiáng)弱，橢圓形表示兩因子交互效應(yīng)顯著，而圓形則表示兩因子交互效應(yīng)不顯著。在本實(shí)驗(yàn)條件下，幼魚耗氧率在溫度為21～33℃范圍內(nèi)隨著溫度的上升而上升；在pH為6.5～7.5范圍內(nèi)隨著pH的上升而上升，pH高于7.5則開始下降；圖2-A中等高線為橢圓形反映溫度與pH對(duì)幼魚的耗氧率有顯著的互作效應(yīng)（P＜0.05）。

表1 溫度與pH的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)組合及結(jié)果Tab.1 Experimental design of temperature（T）and pH and results

表2 溫度與pH對(duì)斜帶石斑魚幼魚耗氧率的回歸模型方差分析Tab.2 Variance analysis for the effects of temperature（T）and pH on oxygen consumption rate of juvenile E.coioides under low-salinity culture

表3 溫度與pH對(duì)斜帶石斑魚幼魚耗氧率的模型回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)Tab.3 Test of significance for regression coefficient of temperature（T）and pH on oxygen consumption rate of juvenile E.coioides under low-salinity culture

2.2 排氨率

溫度與pH不同組合對(duì)低鹽環(huán)境下斜帶石斑魚幼魚排氨率的測(cè)定結(jié)果見表1，并對(duì)所測(cè)定的結(jié)果采用最小二乘法進(jìn)行回歸擬合，得到幼魚排氨率與溫度、pH之間實(shí)際的二次多項(xiàng)回歸模型為：

MTAN＝－89.46＋1.70T＋17.39pH－0.08T ×pH－0.01T2－0.97pH2

式中，R2＝0.954 6，校正系數(shù)R2＝0.905 6，說明回歸模型能解釋95.46%響應(yīng)值的變化，僅有總變異的4.54%不能用此模型解釋，精密度（adeq precisior）是指有效信號(hào)與噪聲的比值，大于4.0視為合理，排氨率模型精密度達(dá)到15.852，因此說明排氨率回歸模型擬合程度良好。

對(duì)幼魚排氨率回歸模型方差分析進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果見表4。表4中的數(shù)據(jù)顯示，回歸模型F＝24.33，P＝0.000 3＜0.01，表明回歸模型極顯著；失擬項(xiàng)F＝1.41，P＝0.363 6＞0.05，說明所建立的模型有效。因此，可以用上述回歸模型來(lái)分析和預(yù)測(cè)溫度和pH對(duì)幼魚的排氨率的結(jié)果。

幼魚排氨率回歸模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果見表5。表5中數(shù)據(jù)顯示，溫度一次效應(yīng)對(duì)幼魚的排氨率有極顯著影響（P＜0.01），二次效應(yīng)對(duì)幼魚的排氨率無(wú)顯著影響（P＞0.05）；pH一次效應(yīng)和二次效應(yīng)對(duì)幼魚排氨率有顯著影響（P＜0.05）；溫度與pH互作效應(yīng)對(duì)排氨率無(wú)顯著影響（P＞0.05）。

溫度與pH和幼魚的排氨率之間的響應(yīng)曲面及其等高線見圖3所示。通過圖3能直觀地評(píng)價(jià)溫度與pH對(duì)幼魚排氨率的相互作用。在本實(shí)驗(yàn)條件下，幼魚排氨率在溫度為21～33℃范圍內(nèi)隨著溫度的上升而上升；在pH為6.5～7.5范圍內(nèi)隨著pH的上升而上升，pH高于7.5則開始下降；圖3-A中等高線為橢圓形反映溫度與pH對(duì)幼魚的排氨率無(wú)顯著的互作效應(yīng)（P＞0.05）。

圖2 溫度與pH及其交互作用對(duì)低鹽條件下斜帶石斑魚幼魚耗氧率影響的等高線（A）和響應(yīng)面（B）Fig.2 Response of contour plot（A）and its surface plot（B）of the effects of temperature（T）and pH and their mutual interactions on oxygen consumption rate of juvenile E.coioides under low－salinity culture

表4 溫度與pH對(duì)斜帶石斑魚幼魚排氨率的回歸模型方差分析Tab.4 Variance analysis for the effect of temperature（T）and pH on ammonia excretion rate of juvenile E.coioides under low－salinity culture

表5 溫度與pH對(duì)斜帶石斑魚幼魚排氨率的模型回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)Tab.5 Test of significance for regression coefficient of temperature（T）and pH on ammonia excretion rate of juvenile E.coioides under low－salinity culture

圖3 溫度與pH及其交互作用對(duì)低鹽條件下斜帶石斑魚幼魚排氨率影響的等高線（A）和響應(yīng)面（B）Fig.3 Response of contour p lot（A）and its surface p lot（B）of the effects of temperature（T）and pH and their mutual interactions on ammonia excretion rate of juvenile E.coioides under low－salinity culture

表6 溫度與pH對(duì)低鹽條件下斜帶石斑魚幼魚耗氧率和排氨率影響的優(yōu)化置信區(qū)間Tab.6 Optimization of confidence interval of the effects of temperature and pH on ammonia excretion rate of juvenile E.coioides under low－salinity culture

2.3 氧氮比

斜帶石斑魚幼魚氧氮比的計(jì)算結(jié)果見表1。幼魚在溫度21～33℃范圍和pH 6.5～8.5范圍，不同組合條件下其氧氮比值范圍為22.93～40.22。

2.4 響應(yīng)值優(yōu)化

參考MONTGOMERY的方法［5］，對(duì)幼魚的耗氧率、排氨率的最適溫度和pH進(jìn)行同時(shí)優(yōu)化（表6），結(jié)果顯示，溫度和pH的最優(yōu)組合為31.2℃和7.6，此時(shí)幼魚耗氧率、排氨率最大值為188.44 mgO2·（kg·hr）－1、7.01 mgTAN·（kg·hr）－1，可靠度為0.902。

3 討論

溫度與pH作為魚類生長(zhǎng)發(fā)育的重要環(huán)境因子，直接影響魚類能量代謝［2－4，6－11］。研究認(rèn)為，溫度和pH主要通過影響魚體組織細(xì)胞內(nèi)代謝酶活力而影響能量代謝［3］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用中心復(fù)合設(shè)計(jì)是一種有效的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與統(tǒng)計(jì)分析的技術(shù)，所得的回歸方程精度高，具有可預(yù)測(cè)性。在本實(shí)驗(yàn)條件下，溫度與pH對(duì)低鹽環(huán)境下的斜帶石斑魚幼魚的耗氧率、排氨率均有顯著的影響，二次回歸模型決定系數(shù)分別為0.981 1、0.945 6和0.988 0，方程擬合較好，可以進(jìn)行分析與預(yù)測(cè)。

溫度對(duì)魚類代謝酶活性起控制作用［12］。本實(shí)驗(yàn)中，pH為6.5～8.5范圍，溫度為21～33℃范圍，幼魚的耗氧率、排氨率均隨著溫度的上升而上升。這說明在該溫度范圍，隨著溫度的上升，斜帶石斑魚幼魚維持生命代謝的各種組織器官活性增強(qiáng)，代謝酶活性增大，因此表現(xiàn)為耗氧率升高、產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物氨氮增多的現(xiàn)象。這也符合魚類能量代謝隨溫度變化的一般規(guī)律。與鮸［2］、條石鯛［3］、黃鱸（Percaf luviatilis）［6］、大口黑鱸（Micropterus salmoides）［13］等研究結(jié)果相類似。

水體pH對(duì)魚類的耗氧率的影響，目前存在兩種不同觀點(diǎn)。第一種觀點(diǎn)認(rèn)為，耗氧率隨水體pH升高而升高，當(dāng)pH超過適宜范圍，耗氧率則隨之下降。在紅鮑（Haliotis rubra）［14］、雜交鱘（Huso huso♀×Acipenser baerii♂）［15］、胖頭鱥（Pimephales promelas）［16］的研究結(jié)果支持第一種觀點(diǎn)。第二種觀點(diǎn)認(rèn)為，水體pH在一定范圍內(nèi)變化，對(duì)耗氧率無(wú)顯著性影響。如，對(duì)日本黃姑魚（Nibea japonica）［8］、鮸［2］的研究結(jié)果支持第二種觀點(diǎn)。這反映了魚類隨著生活環(huán)境、生態(tài)習(xí)性及發(fā)育階段不同對(duì)pH的調(diào)節(jié)能力存在著差異。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，pH對(duì)低鹽環(huán)境下的斜帶石斑魚幼魚的耗氧率有顯著影響，隨pH的升高而上升，pH超過7.5則開始下降，說明適宜pH范圍內(nèi)，維持生命代謝的組織器官的代謝酶活性增強(qiáng)，基礎(chǔ)代謝旺盛，表現(xiàn)為耗氧率的升高，而pH超過7.5可能會(huì)引起水中一些化學(xué)物質(zhì)含量的變化，阻礙魚類的呼吸，表現(xiàn)為耗氧率下降，但下降的幅度較小，是否會(huì)引起代謝紊亂還有待進(jìn)一步研究證實(shí)。雖然魚類具備一定的酸堿平衡調(diào)節(jié)能力，但是從能量利用的角度來(lái)看，對(duì)于魚類長(zhǎng)期處于酸堿平衡的調(diào)節(jié)耗能狀態(tài)，勢(shì)必導(dǎo)致其它生理功能的降低。上述研究結(jié)果及本實(shí)驗(yàn)結(jié)果都是利用鹽酸驅(qū)動(dòng)的水體酸化進(jìn)行的，這與CO2驅(qū)動(dòng)的海水酸化的結(jié)果會(huì)存在差異，這是因?yàn)镃O2驅(qū)動(dòng)的海水酸化不僅增加氫離子的含量，而且增加了碳酸氫根離子的濃度，降低了碳酸根離子的濃度，改變了海水的化學(xué)性質(zhì)［17］。另有研究將真鯛（Pagrus major）的受精卵及仔魚分別在由鹽酸和CO2驅(qū)動(dòng)相同pH值的海水中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與鹽酸組死亡率為1%～4%，而CO2組表現(xiàn)為更高的死亡率，為60%～100%，說明不是海水pH值降低而是CO2產(chǎn)生了碳效應(yīng)導(dǎo)致了真鯛仔魚的大量死亡［18］。關(guān)于CO2驅(qū)動(dòng)和鹽度驅(qū)動(dòng)的水體pH下降對(duì)斜帶石斑魚幼魚能量代謝的影響差異，需進(jìn)一步探究。

以往的研究表明，環(huán)境因子對(duì)魚類的生長(zhǎng)發(fā)育有重要的影響。但環(huán)境因子之間的互作效應(yīng)更應(yīng)受到關(guān)注。在因子互作效應(yīng)存在的情況下，往往比因子主效應(yīng)更重要［5］。在尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）［10］、大菱鲆（Scophthalmus maximus）［19］、犬齒牙鲆（Paralichthys dentatus）［20］、花狼魚（Anarhichas minor）［21］等研究中證實(shí)環(huán)境因子對(duì)魚類生長(zhǎng)有明顯的互作效應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)中，斜帶石斑魚幼魚耗氧率、排氨率回歸模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果顯示（表3、表5），溫度和pH的互作效應(yīng)對(duì)幼魚耗氧率顯著影響（P＜0.05），這說明溫度與水體pH對(duì)幼魚的耗氧率是緊密關(guān)聯(lián)的?？赡茉蚴菧囟扰c水體pH對(duì)酶活力的影響存在關(guān)聯(lián)。pH影響酶活力主要有兩個(gè)途徑，一是改變酶的構(gòu)象；二是改變酶與底物的結(jié)合，而溫度影響酶活力主要是通過改變酶與底物的結(jié)合，溫度與pH以相同的途徑影響酶活力。另外，溫度會(huì)改變水中的二氧化碳含量，從而影響水體的pH，因此溫度與pH存在著明顯的互作效應(yīng)。而溫度和pH的互作效應(yīng)對(duì)幼魚排氨率卻無(wú)顯著影響（P＞0.05），可以推測(cè)溫度和pH對(duì)氨氮排泄的影響是獨(dú)立進(jìn)行的，其確切的機(jī)理還待深入研究。

響應(yīng)曲面法最大的優(yōu)點(diǎn)在于把因素和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的關(guān)系函數(shù)化，可以研究因子與響應(yīng)值之間、因子與因子之間的相互關(guān)系，并進(jìn)行優(yōu)化，找到最佳因子組合［22］。然而，國(guó)內(nèi)外學(xué)者關(guān)于環(huán)境因子對(duì)魚類能量代謝影響的研究，大部分只針對(duì)某個(gè)環(huán)境因子的幾個(gè)孤立水平點(diǎn)進(jìn)行分析，具有很大局限性。而傳統(tǒng)正交試驗(yàn)方法雖能尋找最佳因子水平組合，但不能建立因子與響應(yīng)值間明確的函數(shù)關(guān)系，從而無(wú)法找到因子最佳組合和最優(yōu)響應(yīng)值。本實(shí)驗(yàn)中，采用響應(yīng)曲面法建立可靠的回歸模型，可對(duì)響應(yīng)進(jìn)行連續(xù)的預(yù)測(cè)。方差分析結(jié)果（表2、表4）顯示，回歸模型均極顯著（P＜0.01），回歸方程決定系數(shù)高，模型失擬項(xiàng)檢驗(yàn)結(jié)果不顯著（P＞0.05），說明建立的模型有意義，可用于分析與預(yù)測(cè)。并獲得模型優(yōu)化后得出最優(yōu)的因子組合為溫度31.2℃、pH 7.6，在此組合下，幼魚耗氧率、排氨率的最大值為188.44 mgO2·（kg·hr）－1、7.01 mgTAN·（kg·hr）－1。一般而言，魚類耗氧率、排氨率表現(xiàn)較高的現(xiàn)象，反映了魚類的新陳代謝旺盛，生存環(huán)境適宜，有利于魚類生長(zhǎng)。說明低鹽條件下的斜帶石斑魚幼魚在溫度31.2℃、pH 7.6左右時(shí)，生長(zhǎng)性能較好。

應(yīng)用響應(yīng)面法分析水生動(dòng)物能量代謝的聯(lián)合效應(yīng)，該方法具有實(shí)驗(yàn)次數(shù)少、靈活、方便、全面考察各因素及因素間的交互作用等優(yōu)點(diǎn)，在實(shí)際應(yīng)用中大大節(jié)約了實(shí)驗(yàn)時(shí)間及費(fèi)用，可提前達(dá)到預(yù)期的實(shí)驗(yàn)?zāi)康模瑸槲覀兲峁┝艘环N新的數(shù)學(xué)分析方法。在斜帶石斑魚低鹽養(yǎng)殖生理生態(tài)及養(yǎng)殖的水質(zhì)管理過程中，還涉及其它因子的影響，如氨氮、亞硝酸鹽、養(yǎng)殖密度、光照強(qiáng)度等。因此，還有待進(jìn)一步深入研究這些因子的影響及因子間是否存在互作效應(yīng)，以便更好地指導(dǎo)生產(chǎn)實(shí)踐。

［1］ 強(qiáng) 俊，王 輝，李瑞偉，等.酸堿脅迫對(duì)不同體質(zhì)量尼羅羅非魚幼魚能量代謝的影響［J］.應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2011，22（9）：2438－2446.QIANG J，WANG H，LI R W，et al.Effects of acid and alkaline stress on energy metabolism of Oreochromis niloticus juveniles with different body mass［J］.Chinese Journal of Applied Ecology，2011，22（9）：2438－2446.

［2］ 閆茂倉(cāng)，單樂州，邵鑫斌，等.溫度及體重對(duì)鮸魚幼魚耗氧率和排氨率的影響［J］.熱帶海洋學(xué)報(bào)，2007，26（1）：44－49.YAN M C，SHAN L Z，SHAO X B，et al.Influences of temperature and weight on respiration and excretion of Miichthymiiuy juvenile［J］.Journal of Tropical Ocean Nography，2007，26（1）：44－49.

［3］ 閆茂倉(cāng)，單樂州，謝起浪，等.溫度，鹽度及體重對(duì)條石鯛幼魚耗氧率和排氨率的影響［J］.海洋科學(xué)進(jìn)展，2009，26（4）：486－496.YAN M C，SHAN L Z，XIE Q L，et al.Influence of temperature，salinity and body weight on oxygen consumption and ammonia excretion of Oplegnathus fasciatus juvenile［J］.Advances in Marine Science，2009，26（4）：486－496.

［4］ 王 剛，李加兒，區(qū)又君，等.環(huán)境因子對(duì)卵形鯧鲹幼魚耗氧率和排氨率的影響［J］.動(dòng)物學(xué)雜志，2012，46（6）：80－87. WANG G，LI J E，OU Y J，et al.Influence of environmental factors on oxygen consumption and ammonia excretion of juvenile Trachinotus ovatus［J］.Chinese Journal of Zoology，2012，46（6）：80－87.

［5］ MONTGOMERY D C.Design and analysis of experiments［M］.New York：John Wiley and Sons，2008.

［6］ ZAKE S′Z，DEMSKA-ZAKE S′K，KATA K.Rates of oxygen consumption and ammonia excretion of juvenile Eurasian perch Perca fluviatilis L.［J］.Aquaculture International，2003，11（3）：277－288.

［7］ 曾令清，張耀光，付世健，等.雙向急性變溫對(duì)南方鲇幼魚靜止耗氧率和臨界游泳速度的影響［J］.水生生物學(xué)報(bào)，2011，35（2）：276－282.ZENG LQ，ZHANG Y G，F(xiàn)U S J，et al.Effects of acute temperature change on resting oxygen consumption rate and critical swimming speed in juvenile southern catfish（Silurus meridionalis CHEN）［J］.Acta Hydrobiologica Sinica，2011，35（2）：276－282.

［8］ 柴學(xué)軍，胡則輝，徐君卓，等.鹽度和pH對(duì)日本黃姑魚幼魚耗氧率和排氨率的影響［J］.浙江海洋學(xué)院學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2009，28（2）：146－150.CHAIX J，HU Z H，XU J Z，et al.Effect of salinity and pH on oxygen consumption rate and ammonia excretion rate in juvenile Nibea japonica［J］.Journal of Zhejiang Ocean University（Natural Science），2009，28（2）：146－150.

［9］ 唐道軍，徐善良，馬 斌.溫度對(duì)黑鱾幼魚耗氧率和排氨率的影響［J］.動(dòng)物學(xué)雜志，2013，48（2）：256－260.TANG D J，XU S L，MA B.Influence of temperature on oxygen consumption and ammonia excretion of juvenile Girella melanichthys［J］.Chinese Journal of Zoology，2013，48（2）：256－260.

［10］ 王 輝，強(qiáng) 俊，王海貞，等.溫度與鹽度對(duì)吉富品系尼羅羅非魚幼魚能量代謝的聯(lián)合效應(yīng)［J］.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)，2012，19（1）：51－61.WANG H，QIANG J，WANG，H Z，et al.Combined effect of temperature and salinity on energy metabolismof GIFT Nile tilapia（Oreochromis niloticus）juveniles［J］.Journal of Fishery Sciences of China，2012，19（1）：51－61.

［11］ 閆茂倉(cāng)，單樂州，邵鑫斌，等.鹽度和pH值對(duì)鮸魚幼魚耗氧率和氨氮排泄率的影響［J］.臺(tái)灣海峽，2007，26（1）：85－91.YAN M C，SHAN L Z，SHAO X B，et al.Influence of salinity and pH on the rates of oxygen consumption and ammonia excretion of juvenile Miichthy mijuy［J］.Journal of Oceanography in Taiwan Strait，2007，26（1）：85－91.

［12］ LIKONGWE JS，STECKO T D，STAUFFER JR，et al.Combined effects of water temperature and salinity on growth and feed utilization of juvenile Nile tilapia Oreochromis niloticus（Linneaus）［J］.Aquaculture，1996，146（1）：37－46.

［13］ 徐如衛(wèi)，江錦坡，肖建忠.大口黑鱸仔、稚魚窒息點(diǎn)與耗氧率的初步測(cè)定［J］.浙江水產(chǎn)學(xué)院學(xué)報(bào)，1994，13（2）：110－115.XU R W，JIANG J B，XIAO J Z.A preliminary measurement on suffocation point and oxygen consumption rate of Micropterus salmoides［J］.Journal of Zhejiang College of Fisheries，1994，13（2）：110－115.

［14］ HARRIS JO，MAGUIRE G B，EDWARDSS J，et al.Effect of pH on growth rate，oxygen consumption rate，and histopathology of gill and kidney tissue for juvenile greenlip abalone，Haliotis laevigata donovan and blacklip abalone，Haliotis rubra leach［J］.Journal of Shellfish Research，1999，18（2）：611－619.

［15］ 吳常文，朱愛意，趙向炯.海水養(yǎng)殖雜交鱘耗氧量、耗氧率和窒息點(diǎn)的研究［J］.浙江海洋學(xué)院學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2005，24（2）：100－104.WU CW，ZHU A Y，ZHAO X J.Study on oxygen uptake，oxygen uptake rate and asphyxiation point of mari-culture hybrid sturgeon［J］.Journal of Zhejiang Ocean University（Natural Science），2005，24（2）：100－104.

［16］ IGRAM R，WARESII W D.Oxygen consumption in the fathead minnow（Pimephales promelas rafinesque）—II effects of pH，osmotic pressure，and light level［J］.Comparative Biochemistry and Physiology Part A：Physiology，1979，62（4）：895－897.

［17］ 劉洪軍，張振東，官曙光，等.海洋酸化效應(yīng)對(duì)海水魚類的綜合影響評(píng)述［J］.生態(tài)學(xué)報(bào)，2012，32（10）：3233－3239.LIU H J，ZHANG ZD，GUAN SG，et al.A review of comprehensive effect of ocean acidification on marine fishes［J］.Acta Ecologica Sinica，2012，32（10）：3233－3239.

［18］ KIKKAWA T，KITA J，ISHIMATSU A.Comparison of the lethal effect of CO2and acidification on red sea bream（Pagrus major）during the early developmental stages［J］.Marine Pollution Bulletin，2004，48（1）：108－110.

［19］ IMSLAND A K，F(xiàn)OSS A，GUNNARSSON S，et al.The interaction of temperature and salinity on growth and food conversion in juvenile turbot（Scophthalmus maximus）［J］.Aquaculture，2001，198（3）：353－367.

［20］ MALLOY K D，TARGETT T E.Feeding，growth and survival of juvenile summer flounder Paralichthys dentatus：Experimental analysis of the effects of temperature and salinity［J］.Marine Ecology Progress Series，1991，72（3）：213－223.

［21］ MAGNUSSEN A B，IMSLAND A K，F(xiàn)OSS A.Interactive effects of different temperatures and salinities on growth，feed conversion efficiency，and blood physiology in juvenile spotted wolffish，Anarhichas minor Olafsen［J］.Journal of World Aquacult Society，2008，39（6）：804－811.

［22］ 國(guó) 蓉，李劍君，國(guó) 亮，等.采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化甘草飲片中甘草酸的超聲提取工藝［J］.西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2006，34（9）：187－192.GUO R，LI J J，GUO L，et al.Optimization of the ultrasonic extraction technique of glycyrrhizic acid by using response surface methodology［J］.Joural of Northwest Sci－ech University of Agriculture and Forestry（Natural Science），2006，34（9）：187－192.

Combined effects of temperature and pH on energy metabolism of Epinephelus coioides juveniles cultured in low salinity using response surface methodology

HUANG Jian-sheng，CHEN Gang，ZHANG Jian-dong，TANG Bao-gui，WANG Zhong-liang，ZHOU Hui
（Fisheries College，Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524088，China）

Orange-spotted grouper，which inhabit subtropical and tropical areas，have become a very popular cultured species of marine teleost currently in China.Metabolic rate is the most fundamental biological rate as it represents the rate of energy uptake，transformation and allocation.Oxygen consumption is a widely studied indicator of metabolic rate，and measurements of oxygen consumption rate are often used to examine energy utilization and stress in aquatic animals.We evaluated the combined effects of temperature and pH on the energy metabolism of Epinephelus coioides juveniles cultured in low salinity.Two-factor central composite experimental design and response surface methodology were used to test the effects of temperature（21－33℃）and pH（6.5－8.5）on the oxygen consumption rate（MO2）and ammonia excretion rate（MTAN）under laboratory conditions.Results showed that MO2and MTANincreased with the increasing temperature，and increased at the beginning then decreased with the increasing pH.The linear effects of temperature on MO2were highly statistically significant（P＜0.01），the quadratic effects of temperature were significant（P＜0.05）；the linear effects of pH on MO2were significant（P＜0.05），the quadratic effects of pH were highly statistically significant（P＜0.01）.Interaction effects of temperature and pH on MO2were significant（P＜0.05）.The linear effects of temperature on MTANwere highly statistically significant（P＜0.01），but the quadratic effects of temperature were not significant（P＞0.05）；the linear and quadratic effects of pH on MTANwere significant（P＜0.05）；interaction effects of temperature and pH on MTANwere significant（P＜0.05）.The optimal temperature-pH combination was obtained through statistical optimization approach，and it was 31.2℃／7.6，at which the maximal MO2，MTANreached 188.44 mgO2·（kg·hr）－1，7.01 mgTAN·（kg·hr）－1respectively，with the desirability of 0.902.The data obtained suggested that producing profit can be improved by rearing at an optimal combination of temperature and pH of juvenile E.coioides under low-salinity culture.

Epinephelus coioides；oxygen consumption rate；ammonia excretion rate；low salinity water；response surface methodology

S 917

：A

1004－2490（2017）01－0041－10

2016－02－01

廣東省教育廳育苗工程（自然科學(xué)）項(xiàng)目（No.2013LYM－0038）；廣東省海洋漁業(yè)科技推廣專項(xiàng)項(xiàng)目［No.A2010－08D04，A2010004－016（c）］；廣東省海洋經(jīng)濟(jì)創(chuàng)新發(fā)展區(qū)域示范專項(xiàng)“石斑魚等名貴海水魚工廠化循環(huán)水高效養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)化”（No.GD2012－A02－003）

黃建盛（1981－），男，廣東湛江人，漢族，博士，研究方向：水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物養(yǎng)殖生理生態(tài)學(xué)。E-mail：fishaqu＠126.com

陳 剛，教授。Tel：0759－2382462，E-mail：cheng＠gdou.edu.cn