譯者：呂茂杰 校者：楊保收

仔豬生產(chǎn)

乳汁免疫和豬流行性腹瀉病毒病疫苗：歷史和現(xiàn)狀(譯文)

原文出處：Langel Stephanie N,Paim Francine Chimelo,Lager Kelly M,Vlasova Anastasia N,Saif Linda J. Lactogenic Immunity and Vaccines for Porcine Epidemic Diarrhea Virus (PEDV):Historical And Current Concepts[J].Virus Research,2016,226(11):93-107.

譯者：呂茂杰 校者：楊保收

由于腸道病毒感染導(dǎo)致仔豬在發(fā)病率、死亡率和生產(chǎn)能力喪失方面的影響，每年給養(yǎng)豬者帶來數(shù)百萬美元的損失。2013—2014年間，豬流行性腹瀉病毒（PEDV）病的暴發(fā)給美國養(yǎng)豬業(yè)帶來了9億～18億美元的經(jīng)濟(jì)損失。被動乳汁免疫被認(rèn)為是保護(hù)新生哺乳仔豬免受PED等腸道疾病危害的最有希望和有效的方法。通過乳汁免疫被動保護(hù)哺乳仔豬的效果依賴于病原特異性IgA漿細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)至乳腺的數(shù)量和乳汁中分泌型IgA的積累程度，這種免疫途徑被定義為“腸-乳腺-sIgA軸”。由于胎盤的不可穿透性，新生仔豬處于無免疫球蛋白的狀態(tài)，對很多的傳染性病原體極易感。它們僅依靠來源于母源的初乳和乳汁抗體獲得被動保護(hù)。先前開發(fā)的關(guān)于豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）病的活疫苗和滅活疫苗，提供了對母源性免疫和仔豬被動保護(hù)機(jī)制的理解。在這篇文章中，綜述了豬傳染性胃腸炎病毒誘導(dǎo)乳汁免疫的研究進(jìn)展，并指出對當(dāng)前養(yǎng)豬業(yè)正努力控制的豬流行性腹瀉病毒感染和相關(guān)疫苗的研究方向。同時研究和鑒別出影響乳汁免疫和“腸-乳腺-sIgA軸”的各種因素，有助于改善妊娠母豬預(yù)防豬流行性腹瀉病毒感染以及改進(jìn)其它腸道病原用疫苗方案，從而達(dá)到提升整個豬群的免疫力、豬群健康和企業(yè)生產(chǎn)力的目的。

豬流行性腹瀉病毒；豬傳染性胃腸炎病毒；乳汁免疫；母源抗體；“腸-乳腺-sIgA軸”；豬

1 前言

20世紀(jì)70年代，豬流行性腹瀉病毒（PEDV）作為一個新的α冠狀病毒，首次出現(xiàn)在歐洲肥育豬群中。隨后廣泛流行，哺乳仔豬最為嚴(yán)重。然而，從2014年至今，PEDV在歐洲多個國家暴發(fā)（Boniotti et al.,2016;Dastjerdi et al.,2015;Grasland et al.,2015; Stadler et al.,2015;Theuns et al.,2015）。在20世紀(jì)80年代，由于PEDV在亞洲豬群的暴發(fā)，疫病普遍存在，最后成為地方流行性疫?。⊿ong and Park, 2012）。隨后，開發(fā)出相應(yīng)的弱毒疫苗和滅活疫苗，并得到廣泛應(yīng)用。然而，從2011年之后，由PEDV強(qiáng)毒株引起遍及整個亞洲的嚴(yán)重的豬流行性腹瀉病。在亞洲，來源于歐洲和其它經(jīng)典PEDV毒株的疫苗無法控制新毒株的致病性（Song and Park,2012）。2013年，PEDV作為一個新的、引起豬群嚴(yán)重腹瀉疫病的病原在美國出現(xiàn)。PEDV很快遍及整個美國，感染所有日齡豬只，給養(yǎng)豬場造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失（Stevenson et al.,2013）。隨后，該病傳播至加拿大和墨西哥（Jung and Saif,2015;Ojkic et al.,2015）。從遺傳學(xué)角度分析，美國PEDV毒株與來自于中國的高致病性毒株極其相似（China AH2012 and CH/ ZMZDY/11），但是美國PEDV的起源仍然不清楚（Huang et al.,2013;Marthaler et al.,2013;Vlasova et al.,2014）。PEDV的發(fā)生與病程和在20世紀(jì)60至80年代引起哺乳仔豬嚴(yán)重流行性腹瀉的TGEV相似（Saif et al.,2012）[Saif L J,Proceedings of the 2015 American Association of Swine Veterinarians(AASV) Annual Meeting,page 403-406]。雖然，弱毒豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）疫苗的開發(fā)，提供給仔豬一定的保護(hù)效應(yīng)，在1983—1984年TGEV噬呼吸系統(tǒng)型變異株—豬呼吸道冠狀病毒（PRCV）的出現(xiàn)極大地影響了TGEV的流行性和嚴(yán)重性（Pensaert et al.,1986; Saif et al.,2012）。PRCV在美國、歐洲和亞洲的廣泛流行，普遍地減弱了TGEV的致病性，TGEV在西歐地區(qū)明顯減少并消除了其發(fā)病率。由于PEDV的高毒力和新生哺乳仔豬不成熟的免疫系統(tǒng)，被動的乳汁免疫對哺乳仔豬的保護(hù)是最關(guān)鍵的。其被動免疫作用發(fā)生類似于TGEV的乳汁免疫，其中“腸-乳腺-sIgA軸”在針對PEDV的乳汁免疫中扮演關(guān)鍵角色（Bohl et al.,1972）。弄清楚“腸-乳腺-sIgA軸”循環(huán)對于保障PEDV暴發(fā)期間的豬群健康至關(guān)重要，便于設(shè)計開發(fā)預(yù)防性疫苗。在這篇綜述中，我們主要關(guān)注引起哺乳仔豬致命的PEDV病原的乳汁免疫和疫苗的設(shè)計。了解TGEV的乳汁免疫的誘導(dǎo)機(jī)理，將給PEDV疫苗的開發(fā)提供歷史性的見解。

2 乳汁被動免疫和“腸-乳腺-sIgA軸”

PEDV和TGEV主要感染部位為小腸，通過血清病毒核酸的檢測表明病毒感染幼齡仔豬存在短暫的病毒血癥（Jung et al.,2014）。對新生仔豬的感染尤為嚴(yán)重。對兩種病的免疫策略必須通過誘導(dǎo)黏膜免疫來達(dá)到阻止豬小腸上皮細(xì)胞靶向病毒的感染。對于新生和哺乳期仔豬來說，黏膜免疫的保護(hù)水平是必要的。對新生仔豬感染豬流行性腹瀉病毒的預(yù)防存在兩種主要問題：1）在陽性母豬群，母源抗體干擾口服活疫苗誘導(dǎo)的免疫保護(hù)；2）對于仔豬，需要3周的時間產(chǎn)生抗體。因此，在懷孕母豬黏膜部位誘導(dǎo)產(chǎn)生的免疫應(yīng)答，通過初乳和乳汁被動轉(zhuǎn)移給仔豬，提供給仔豬腸道感染的直接保護(hù)作用至關(guān)重要。先前對于TGEV被動免疫的研究表明，感染TGEV康復(fù)的母豬能夠提供給其后代豬群針對TGEV感染的保護(hù)。這種保護(hù)與乳汁中高水平的抗體息息相關(guān)，而不是血清中抗體（Bohl et al.,1972;Bohl and Saif, 1975;Saif et al.,1972）。然而，對于乳汁免疫和誘導(dǎo)乳汁抗體保護(hù)水平的機(jī)制還不清楚，這也阻礙了有效TGEV母源抗體疫苗的開發(fā)。同時，腸道病原的乳汁免疫誘導(dǎo)作用機(jī)制相關(guān)問題的不清楚，也影響了PEDV疫苗的效果。早期對TGEV疫苗的研究發(fā)現(xiàn)了幾種關(guān)鍵的免疫學(xué)想象（Saif,1999;Saif et al.,2012）（Saif L J,Proceedings of the 2015 AASV Annual Meeting,page 403-406）。由于母豬胎盤的不可通透性，仔豬天生無免疫球蛋白，僅依靠初乳和乳汁抗體來獲得被動免疫保護(hù)（Saif and Jackwood,1990）。這也使得仔豬對過多的病原感染表現(xiàn)出高的易感性。對于母豬，在初乳中IgG為優(yōu)勢抗體，主要從血清中滲出（Klobasa et al.,1987），新生仔豬通過哺乳獲得初乳抗體（主要為IgG）。這些免疫球蛋白僅能在仔豬出生后的24～48 h時間內(nèi)通過小腸上皮轉(zhuǎn)運(yùn)，在接下來的2～3 d，初乳過渡至乳汁階段，起主導(dǎo)作用的sIgA通過泌乳持續(xù)存在于乳汁中。因此，從母豬初乳中獲得的IgG抗體提供給仔豬的血清抗體反映了母豬血清抗體的特異性，用于預(yù)防仔豬的系統(tǒng)性感染；IgA抗體在乳汁中占優(yōu)，提供給仔豬針對腸道病毒感染的被動免疫保護(hù)作用。揭示乳腺中分泌sIgA抗體至乳汁的IgA免疫細(xì)胞的來源，對于誘導(dǎo)被動乳汁sIgA抗體保護(hù)的腸道相關(guān)疫苗的設(shè)計尤為重要。除了乳汁，在黏膜表面和大多數(shù)黏膜分泌物中，sIgA是主導(dǎo)的免疫球蛋白（Macpherson et al., 2008;Mantis et al.,2011）。sIgA對蛋白酶的抵抗力保障了其在胃腸道的高穩(wěn)定性。對于TGEV免疫的研究，提供了對懷孕豬乳汁免疫策略的基本理解。1972年，Bohl等在豬中發(fā)現(xiàn)的“腸-乳腺-sIgA軸”（IgA免疫效應(yīng)細(xì)胞從腸道向乳腺穿梭）是關(guān)于黏膜免疫系統(tǒng)概念的最早定義（Bohl et al.,1972;Saif, 1999;Saif and Bohl,1983;Saif et al.,1972;Weisz-Carrington et al.,1978）。研究結(jié)果揭示了自然感染或者口服接種TGEV母豬和感染后康復(fù)母豬，乳汁中含有持續(xù)高水平的sIgA抗體，保護(hù)仔豬免受TGEV的感染。然而，使用滅活疫苗免疫母豬在血清和初乳中主要是IgG抗體，在乳汁中迅速下降，提供給仔豬很少的乳汁免疫。這種發(fā)現(xiàn)也使得誘導(dǎo)黏膜被動免疫的母源的免疫策略適用于多個物種和腸道病原，包括PEDV。

2.1 豬群中淋巴細(xì)胞黏膜歸巢的基本要素

淋巴細(xì)胞在血液和淋巴組織之間不斷循環(huán)至全身各系統(tǒng)，發(fā)揮對入侵病原的免疫監(jiān)視和保持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的作用（Butcher and Picker,1996;Gowans, 1959）。淋巴細(xì)胞通過毛細(xì)血管后微靜脈血管在二級淋巴器官中遷移，從而出入二級淋巴器官。T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞經(jīng)高內(nèi)皮小靜脈血管滲出，經(jīng)過多步加工，包括滾動、黏附、遷移和定位至各自的淋巴結(jié)（Kunkel et al.,2003;Springer,1995）。淋巴細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞差異化表達(dá)表面配體和受體，趨化因子和細(xì)胞因子可辨別來自黏膜歸巢位點的外周淋巴細(xì)胞。系統(tǒng)性的淋巴細(xì)胞歸巢和黏膜部位的淋巴細(xì)胞歸巢的不同有助于對黏膜免疫反應(yīng)和針對系統(tǒng)性病原或黏膜性病原疫苗設(shè)計的理解。比如，淋巴細(xì)胞配體α4β1，L-選擇素（L-selectin）和細(xì)胞因子受體（CCR）7分別與血管細(xì)胞黏附因子1（VCAM-1），外周淋巴結(jié)黏附素（PNAd）和細(xì)胞因子配體（CCL）21相互作用來控制淋巴細(xì)胞的外周遷移（Miyasaka and Tanaka,2004）。然而，淋巴細(xì)胞穿梭定位至黏膜組織，尤其是小腸，大多是通過α4β7與黏膜黏附細(xì)胞黏附分子1（MAdCAM-1）相互作用來調(diào)控的（Briskin et al.,1997;Marui et al.,1993）。由高毛細(xì)血管后微靜脈和其它組織分泌的細(xì)胞因子在黏膜淋巴細(xì)胞遷移和限定歸巢部位（比如：淋巴細(xì)胞穿梭的組織特異性）中扮演重要的角色（Miyasaka and Tanaka,2004）。趨化因子通過結(jié)合細(xì)胞表面的G蛋白偶聯(lián)受體，抑制腺苷酸環(huán)化酶，活化細(xì)胞內(nèi)鈣離子來調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞的直接遷移（Dixit and Simon, 2012）。受體活化后，趨化因子結(jié)合到淋巴器官或其它組織的膜鏈和細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)的葡糖氨基聚糖類來產(chǎn)生趨化因子成分（Proudfoot et al.,2003）。在小腸，內(nèi)皮細(xì)胞分泌的CCL25和CCL28，分別結(jié)合淋巴細(xì)胞分泌的CCR9和CCR10（Stenstad et al.,2006; Wang et al.,2000;Wurbel et al.,2007）。

據(jù)估計，超過80%IgA抗體分泌細(xì)胞（ASC）位于腸相關(guān)淋巴組織中（Suzuki et al.,2007；Macpherson and Slack,2007）。因此，在豬體中，黏膜B細(xì)胞有效遷移的特殊穿梭信號的啟動，對腸道疾病的預(yù)防和清除是必需的。例如，在對腸道病原輪狀病毒的小腸感染過程的研究中，病毒僅存在很短的時間窗口（首次感染4～9 d，二次感染3～7 d），此時可在血液中檢測到腸來源的淋巴細(xì)胞和IgA抗體分泌細(xì)胞的運(yùn)輸。這些細(xì)胞在血液中短暫的運(yùn)輸表明其在腸道受到的刺激，并且歸巢至小腸和其它黏膜部位（Brown et al.,2000;Ward et al.,1996b;Yuan et al.,1996）。這些研究結(jié)果表明在豬體中識別運(yùn)輸信號啟動窗口期和淋巴細(xì)胞受刺激后由腸道進(jìn)入循環(huán)，運(yùn)輸至其它黏膜部位的時間窗口期的重要性，比如乳腺。此外，就像在小鼠腸道中出現(xiàn)的α4β7+記憶性B細(xì)胞與輪狀病毒的清除相關(guān)聯(lián)，歸巢標(biāo)記物α4β7可能對于PEDV的清除也是有用的（Williams et al.,1998）。

Bourges和同事分析了豬體內(nèi)不同黏膜部位黏附分子和細(xì)胞因子差異化表達(dá)情況（Bourges et al., 2007）。相比α4β7，α4β1在黏膜固有層、上皮內(nèi)CD3T和IgA B淋巴細(xì)胞中的表達(dá)高于在鼻黏膜和外周血淋巴細(xì)胞。然而，在小腸上皮內(nèi)CD3T和IgA B淋巴細(xì)胞中α4β7的表達(dá)高于α4β1。在鼻和小腸黏膜表達(dá)不同通過測量血管黏附素來確定。PNAd在鼻黏膜固有層的血管表達(dá)，而在小腸血管未檢測到。相反，MAdCAM-1在小腸中檢測到表達(dá)，而在鼻黏膜固有層不表達(dá)。相比小鼠和人類，在豬體內(nèi)，這些結(jié)果提示黏膜歸巢特性存在組織特異性（Butcher and Picker,1996）。此外，黏膜細(xì)胞因子及其相關(guān)受體的表達(dá)也表現(xiàn)出組織特異性。CCL25在呼吸道組織中展現(xiàn)低水平的mRNA表達(dá)，而在小腸中表現(xiàn)高水平的表達(dá)。在小腸、大腸和氣管存在CCL28的高水平表達(dá)。當(dāng)豬體小腸和呼吸道組織中CCR9的表達(dá)普遍存在時，高水平表達(dá)的CCR10定位到小腸和大腸、腸系膜淋巴結(jié)和乳腺。評估健康豬體和感染豬體中黏附分子和細(xì)胞因子的角色對于理解發(fā)病機(jī)制和宿主免疫反應(yīng)是不可或缺的，有助于開發(fā)更有效的疫苗。了解淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)及其相關(guān)信號有助于進(jìn)一步理解腸道病原（如PEDV）的免疫反應(yīng)。通過優(yōu)化疫苗效果，使其靶向豬體小腸淋巴細(xì)胞對黏膜轉(zhuǎn)運(yùn)最大效應(yīng)期，將會增強(qiáng)乳汁免疫，從而減少新生哺乳仔豬的發(fā)病率和死亡率。

2.2 在母豬中IgA漿細(xì)胞從小腸到乳腺的歸巢

有關(guān)于通過對懷孕動物的免疫提供給哺乳仔豬被動保護(hù)，從而免受細(xì)菌和病毒感染的研究（Bohl et al.,1972;Bohl and Saif,1975;Bohl et al.,1974;Kortbeek-Jacobs et al.,1984;Lanza et al.,1995;Moon and Bunn,1993;Saif et al.,1972;Saif and Fernandez, 1996;Saif et al.,1984;Wilson et al.,1972）。乳汁免疫即通過消化初乳和乳汁來獲得免疫球蛋白（IgG、IgM、sIgA）的連續(xù)供應(yīng)過程，在初乳中IgG為優(yōu)勢型，乳汁中IgA為優(yōu)勢型（Klobasa et al.,1987）。在腸道分泌物中最大量的抗體為sIgA，其通過借助上皮細(xì)胞底外側(cè)表面的多聚免疫球蛋白受體將小腸漿細(xì)胞產(chǎn)生的二聚體IgA遷移至腸腔來產(chǎn)生（圖1）。一旦進(jìn)入腸腔，sIgA即可提供免疫保護(hù)，促成小腸的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定（Macpherson et al.,2008;Mantis et al., 2011）?！澳c-乳腺-sIgA軸”通過小腸的自然感染或口服免疫來啟動后，漿母細(xì)胞以泌乳的方式運(yùn)輸至乳腺提供特異性免疫。小腸中IgA漿母細(xì)胞和T細(xì)胞的遷移主要是通過表面整聯(lián)蛋白α4β7與MAd－CAM-1，CCR9與CCL25，CCR10與CCL28的相互作用來介導(dǎo)。然而，在小鼠中，歸巢標(biāo)記一致的顯示為CCR10和CCL28的相互作用，通過二者的相互作用來調(diào)控IgA漿母細(xì)胞的遷移；當(dāng)CCL28被阻斷，乳汁中IgA抗體水平減少，從而導(dǎo)致了乳鼠攝入性IgA抗體的缺乏（Wilson and Butcher,2004）。此外，在CCR10缺陷的鼠模型中，IgA抗體分泌細(xì)胞在乳腺的積累功能喪失（Morteau et al.,2008）。這些研究在豬體內(nèi)未被復(fù)制，但存在相關(guān)的證據(jù)。在小鼠和豬泌乳前，CCL28在乳腺中最大量的表達(dá)（Berri et al.,2008;Lazarus et al.,2003）。在母豬的整個妊娠過程中，乳腺中CCL28蛋白量和積累的IgA B細(xì)胞的數(shù)量同時增加（Bourges et al.,2008;Meurens et al.,2006）。另外，CCL28蛋白在母豬乳汁中被檢測到，進(jìn)一步證實在母豬乳汁免疫中該細(xì)胞因子的重要角色（Berri et al.,2008）。

在母豬的妊娠末期和哺乳早期，乳腺血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)MAdCAM-1增加（Bourges et al.,2008）。在豬和小鼠中，當(dāng)α4β7與MAdCAM-1結(jié)合提示募集IgA漿母細(xì)胞到乳腺，同時也存在相反的結(jié)論（Postigo et al.,1993;Tanneau et al.,1999）。在小鼠，α4β7結(jié)合MAdCAM-1的功能阻斷，乳汁IgA的蓄積未減少（Low et al.,2010）。而且，在豬體中，遷移進(jìn)入乳腺的IgA漿母細(xì)胞僅有小部分IgA B細(xì)胞在乳腺中表達(dá)α4β7(Bourges et al.,2008）。這些結(jié)果表明盡管α4β7/MAdCAM-1相互作用在“腸-乳腺-sIgA軸”中起重要作用，但同時也存在其它的作用機(jī)制。然而，在小鼠中，整聯(lián)蛋白α4β1和各自的地址素VCAM-1（addressin VCAM-1）與淋巴細(xì)胞到乳腺的遷移相關(guān)。在豬體中，泌乳期乳腺中檢測到表達(dá)α4β1的IgA B細(xì)胞，數(shù)量上高于表達(dá)α4β7的IgA B細(xì)胞。此外，血管細(xì)胞黏附素（VCAM-1）在乳腺的表達(dá)先于分娩和泌乳期間（Bourges et al.,2008）。當(dāng)小鼠用抗VCAM-1血清處理，IgA抗體分泌細(xì)胞在泌乳乳腺的蓄積被抑制（Low et al.,2010）。這些數(shù)據(jù)表明抗體分泌細(xì)胞在小鼠體內(nèi)的運(yùn)輸依賴于α4β1/VCAM-1的相互作用。小鼠和豬之間的不同報道要考慮淋巴細(xì)胞結(jié)構(gòu)的物種差異（Rothkotter,2009）。需要進(jìn)一步豬體內(nèi)的研究來確證從小鼠研究中獲得的結(jié)果。

分析乳腺組織和分泌物中B細(xì)胞、T細(xì)胞和趨化因子來監(jiān)視免疫細(xì)胞到乳腺的運(yùn)輸特征。在整個懷孕期，乳腺中B/T免疫細(xì)胞組成和積累呈現(xiàn)動態(tài)過程，與CCR10和CCL28 mRNA的表達(dá)水平呈現(xiàn)平行關(guān)系。比如，在妊娠早期（妊娠期前3個月），乳腺中IgA B細(xì)胞和T細(xì)胞數(shù)量較少，同時CCR10/CCL28表達(dá)幾乎沒有；在妊娠中期，乳腺中T細(xì)胞數(shù)量增加，而IgA B細(xì)胞數(shù)量與妊娠前期相同；妊娠晚期，乳腺中T細(xì)胞的蓄積達(dá)到峰值，而IgA B細(xì)胞數(shù)量和CCR10/CCL28表達(dá)適度的增加。在動物分娩時間，IgA B細(xì)胞數(shù)量達(dá)到峰值，在泌乳期，CCR10/CCL28表達(dá)持續(xù)增長（Bourges et al.,2008;Chabaudie et al., 1993;Meurens et al.,2006）。這些結(jié)果表明B細(xì)胞運(yùn)輸對于乳腺免疫的重要性，隨后抗體分泌至初乳和乳汁中。了解懷孕后期免疫細(xì)胞遷移至乳腺的動力學(xué)特征，對于乳汁免疫的調(diào)節(jié)是必不可少的。通過自然感染或口服接種來啟動未感染母豬的“腸-乳腺-sIgA軸”，需要優(yōu)化病原特異性B細(xì)胞、T細(xì)胞和其它影響因素，包括胎次、妊娠階段、乳素和乳腺發(fā)育的激素、暴露劑量（本部分內(nèi)容僅提出概念，未全翻譯）。

圖1 關(guān)于“腸-乳腺-sIgA軸”和轉(zhuǎn)運(yùn)分子的示意（Chattha et al.,2015）

3 母豬乳汁免疫相關(guān)的物質(zhì)

3.1 IgA抗體

鑒定感染或免疫相關(guān)物質(zhì)便于評估個體動物或群體的易感性，便于理解感染/接種疫苗、宿主免疫反應(yīng)、臨床癥狀和免疫保護(hù)之間的關(guān)系。關(guān)于乳汁免疫，母豬通過母源抗體來提供給新生仔豬免疫保護(hù)是最好的例證（Saif,1999;Zinkernagel,2001）。已有記錄表明由于胎盤的不可透過性母豬生出無免疫球蛋白后代（Kim et al.,1966）。通過乳汁免疫提供給仔豬免疫防御需要的母源抗體持續(xù)到仔豬可以產(chǎn)生足夠數(shù)量的內(nèi)源性抗體階段。先前在豬傳染性胃腸炎病毒和輪狀病毒的研究中鑒定了免疫相關(guān)物質(zhì)。其中，新生仔豬對TGEV保護(hù)率的增加與初乳和乳汁中高滴度的sIgA抗體相關(guān)（Bohl et al.,1972; Bohl and Saif,1975;Saif et al.,1972）。此外，在人輪狀病毒誘導(dǎo)疾病模型中，首次鑒定出血液和小腸中IgA抗體分泌細(xì)胞穿梭，IgA抗體分泌細(xì)胞作為一種免疫保護(hù)標(biāo)記，活化腸道免疫。在這項研究中，血液中輪狀病毒特異性的IgA抗體分泌細(xì)胞，而不是IgG抗體分泌細(xì)胞，與小腸IgA抗體分泌細(xì)胞相關(guān)，可抵抗同型病毒的攻擊（Yuan et al.,1996）。這種關(guān)系在新生兒病人中被證實，循環(huán)的輪狀病毒特異性IgA抗體分泌細(xì)胞與小腸固有層IgA抗體分泌細(xì)胞相關(guān)（Brown et al.,2000）。從腸到其它黏膜組織細(xì)胞穿梭的特定時間范圍，通過評價SPF豬只經(jīng)過輪狀病毒攻擊后，小腸（腸系膜淋巴結(jié)和回腸固有層）、循環(huán)（血液）和系統(tǒng)（脾臟）單核細(xì)胞的淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)來確定。輪狀病毒接種或攻擊早期，血液中輪狀病毒特異性淋巴增殖反應(yīng)與小腸中淋巴增殖反應(yīng)相關(guān)。而且，大量的淋巴增殖反應(yīng)與輪狀病毒特異性分泌抗體細(xì)胞相關(guān)，這也支持淋巴細(xì)胞增殖量化協(xié)助刺激B細(xì)胞產(chǎn)生抗體的Th細(xì)胞穿梭的假說（Ward et al.,1996a;Yuan et al.,1996）。

這些研究表明了在PEDV感染的后備母豬和經(jīng)產(chǎn)母豬的血液中免疫細(xì)胞和抗體分泌細(xì)胞從腸到乳腺穿梭窗口期的重要性。小腸黏膜免疫相關(guān)的免疫因子，像sIgA，是重要的免疫相關(guān)物。關(guān)于PEDV，近期的研究表明接受被動乳汁免疫的仔豬，保育豬的排毒量明顯減少。檢測的仔豬糞便中病毒RNA的載量與乳汁IgA抗體水平之間呈線性關(guān)系。仔豬獲得高滴度的IgA抗體，其糞便中檢出明顯低的PEDV RNA載量。IgA抗體在乳汁免疫和新生仔豬的PEDV被動保護(hù)中起到重要作用（Poonsuk et al., Proceedings of the 2015 AASV Annual Meeting,page 47）。近期的研究表明系統(tǒng)性的抗體提供抗PEDV的保護(hù)（Poonsuk et al.,2016）。在這項研究中，2～5日齡新生仔豬分別腹膜內(nèi)注射不同濃度的抗PEDV血清抗體，24 h后接種PEDV病毒，由于循環(huán)系統(tǒng)中PEDV抗體的存在，攻毒仔豬很快恢復(fù)至正常體溫，表現(xiàn)出較PEDV抗體陰性仔豬攻毒后更小的死亡率。然而，通過腹膜內(nèi)的抗血清抗體的注射，仔豬的生長率、PEDV糞便排毒和體液免疫反應(yīng)未提高。系統(tǒng)性抗體在PEDV的清除中起到重要的作用，對新生仔豬保護(hù)作用最大的是乳汁中母源sIgA。

近來進(jìn)行的一項免疫效果評價試驗，在生產(chǎn)單元將即將死亡新生仔豬的小腸返飼給母豬，同時使用商品化疫苗做平行口服免疫，進(jìn)一步支持上述假設(shè)。在第1個生產(chǎn)單元A，無PEDV感染的后備母豬和母豬在產(chǎn)前6周和3周分別肌肉注射Harrisvaccines公司PEDV疫苗（iPED）；該疫苗基于α病毒表達(dá)載體技術(shù)通過使用重組馬動脈腦炎病毒（VEE）TC-83株復(fù)制子表達(dá)PEDV S糖蛋白來制備。包裹PEDV S RNA的重組VEE病毒顆粒通過感染的Vero細(xì)胞收獲，VEE表達(dá)S基因的復(fù)制子RNA用于疫苗中（Kim et al.,2016）。在生產(chǎn)單元A中，免疫后備母豬和母豬產(chǎn)生低水平或可忽略的血清PEDV IgG抗體和乳汁PEDV中和抗體滴度。第2個生產(chǎn)單元B，后備母豬和經(jīng)產(chǎn)母豬在PEDV暴發(fā)初期于產(chǎn)前4個月進(jìn)行返飼免疫，這些免疫動物乳汁中產(chǎn)生高滴度的PEDV中和抗體，但在血清中未檢測到PEDV IgG抗體。第3個生產(chǎn)單元C，生產(chǎn)母豬在農(nóng)場PEDV暴發(fā)初期，給予連續(xù)3 d的返飼免疫，之后分別在血清和乳汁中檢測到PEDV中和抗體和IgG抗體。這些結(jié)果表明乳汁PEDV中和抗體滴度的成功產(chǎn)生，依賴于生產(chǎn)母豬的經(jīng)口暴露或口服免疫，血清IgG抗體滴度可能與PEDV的免疫不相關(guān)（Bohl et al.,1972; Saif and Bohl,1979;Saif et al.,1972）。Scherba和同事在兩次PEDV暴發(fā)期間，針對第4個生產(chǎn)單元D，平行進(jìn)行了產(chǎn)前9周和2周的PEDV免疫和產(chǎn)前8周和2周的返飼免疫，生產(chǎn)單元D生產(chǎn)后經(jīng)歷第3次的PEDV暴發(fā)。在生產(chǎn)單元D中的后備母豬和生產(chǎn)母豬血清PEDV IgG抗體水平超過4周后即減弱，與乳汁中PEDV中和抗體水平不一致，這也表明了針對PEDV的血清IgG抗體和乳汁PEDV中和抗體滴度之間缺乏相關(guān)性（Scherba et al.,2016）。同時設(shè)置的對照單元，3頭后備母豬既不免疫也不感染，單獨隔離飼養(yǎng)，與上述分組在相同時間點進(jìn)行采樣。這項研究中，缺少對血清和乳汁中PEDV IgA抗體水平的分析，缺乏對隨后PEDV暴發(fā)的仔豬死亡率和保護(hù)率的報道，因這項研究在生產(chǎn)豬群進(jìn)行，仔豬攻毒研究不可能開展。有必要注明：因為生產(chǎn)單元B-D經(jīng)歷過PEDV暴發(fā)，外加返飼免疫，使得每個生產(chǎn)單元的動物攝入不同劑量PEDV，其中病毒量依賴于生產(chǎn)單元管理實踐和環(huán)境病毒載量；作者闡述生產(chǎn)單元A是無PEDV感染，無血清學(xué)數(shù)據(jù)來證實。

3.2 中和抗體、PEDV疫苗和仔豬被動保護(hù)

病毒感染后產(chǎn)生中和抗體，抗體多變區(qū)的抗原結(jié)合位點必須結(jié)合與病毒中和相關(guān)的抗原表位?？贵w中和的機(jī)制包括病毒感染周期各部分的抑制作用，包括細(xì)胞表面結(jié)合、融合、穿入、胞吞作用、病毒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制（Klasse and Sattentau,2002）。對于一些獲批的疫苗產(chǎn)品，中和抗體與疫苗效力質(zhì)量相關(guān)（Zinkernagel,2001）。PEDV為α病毒，包括至少7個ORF，編碼4個主要的結(jié)構(gòu)蛋白，S（Spike）蛋白，E（envelope）蛋白，M（membrane）蛋白，N（nucleocapsid）蛋白和由ORF3基因編碼的輔助蛋白（Huang et al., 2013）。S蛋白形成棘突，位于N蛋白外圍，包含兩個結(jié)構(gòu)域S1和S2。S1結(jié)構(gòu)域與宿主細(xì)胞受體結(jié)合相關(guān)，S2蛋白介導(dǎo)病毒的膜融合和穿入細(xì)胞（Bosch et al., 2003;Sturman et al.,1985;Wicht et al.,2014）。對于TGEV而言，S1結(jié)構(gòu)域是病毒中和抗體的有效誘導(dǎo)部位，對仔豬的保護(hù)至關(guān)重要。對于PEDV S1蛋白的研究表明S1D（aa636-789）結(jié)構(gòu)域與PEDV抗血清反應(yīng)，引起小鼠產(chǎn)生PEDV中和抗體（Sun et al., 2007）。此外，使用S1蛋白的特異性卵黃抗體IgY口服免疫新生仔豬可獲得對PEDV攻擊的保護(hù)（Kweon et al.,2000）。然而，由于缺少使用非特異性抗體IgY免疫后攻毒對照，非免疫IgY是否也介導(dǎo)被動免疫保護(hù)并不清楚。S1蛋白誘導(dǎo)中和抗體的能力，在不同的冠狀病毒之間是保守的，包括β冠狀病毒屬SARS-CoV(severe acute respiratory syndrome coronavirus)和MERS-CoV(Middle East respiratory syndrome coronavirus)(Sui et al.,2004;Yu et al.,2015)。S1蛋白刺激中和抗體產(chǎn)生的能力使其可作為PEDV腸道免疫啟動后的加強(qiáng)疫苗使用（Park et al.,1998）。sIgA通過結(jié)合PEDV S蛋白胞外結(jié)構(gòu)域（受體結(jié)合亞單位S1和膜融合亞單位S2）來抑制病毒細(xì)胞穿入和感染。因此，在新生仔豬腸腔中足量sIgA對于預(yù)防PEDV感染和致死非常重要。DR13株疫苗經(jīng)口服途徑較肌注途徑免疫母豬提供給仔豬更多被動保護(hù)效果（仔豬死亡分別為13%和60%）（Song et al., 2007）。該研究結(jié)果表明了“腸-乳腺-sIgA軸”循環(huán)。經(jīng)口服途徑較肌注途徑免疫分娩階段懷孕母豬，其血清中表現(xiàn)出增加的PEDV IgA抗體水平。兩種免疫途徑免疫母豬的血清中和抗體滴度無差異?？诜緩矫庖叩哪肛i較肌注途徑免疫的母豬表現(xiàn)出初乳中增加的PEDV中和抗體滴度。初乳中增加的PEDV中和抗體滴度與血清中增加的IgA抗體相關(guān)，口服途徑免疫母豬后所產(chǎn)3日齡仔豬血清中展現(xiàn)增加的中和抗體滴度。這些結(jié)果表明針對于DR13株疫苗來說，通過口服途徑誘導(dǎo)的母豬初乳或乳汁中和抗體滴度可更好的反映仔豬保護(hù)效果。比起系統(tǒng)性的抗體水平，與保護(hù)性免疫相關(guān)的初乳/乳汁抗體是更合理決定疫苗效果的診斷工具。

3.3 抗體分泌細(xì)胞

先前描述到，腸源的IgA ASC在血清中短暫運(yùn)輸，可能是與腸感染免疫相關(guān)。選2組仔豬分別用PEDV強(qiáng)毒株和弱毒株免疫，僅強(qiáng)毒株免疫仔豬在血液、小腸和脾臟中誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性ASC。經(jīng)PEDV攻毒后，使用強(qiáng)毒株免疫仔豬較弱毒株免疫仔豬在腸道中產(chǎn)生增加的IgG抗體和IgA ASC。在腸淋巴組織和血液中抗體分泌細(xì)胞（ASC）和保護(hù)之間存在強(qiáng)的正相關(guān)性（de Arriba et al.,2002）。在臨床中，懷孕母豬PEDV感染后1個月腸道中檢測到IgA和IgG PEDV特異性ASC。在PEDV暴露6個月后，母豬腸道中ASC數(shù)量減少但仍可檢測到（Ouyang et al.,2015）。然而，近期研究未在血液中檢測到PEDV特異性ASC穿梭。此外，在不同農(nóng)場飼養(yǎng)的已被PEDV感染動物，可能在初次感染和屠宰的時間段再次受不同劑量的PEDV感染。在可控的環(huán)境條件下，需要進(jìn)一步檢測感染動物和PEDV攻毒仔豬的乳汁免疫和死亡率。還需要進(jìn)一步血液分析來證實血清PEDV特異性ASC與乳汁保護(hù)的相關(guān)性。

4 預(yù)防流行性PEDV和TGEV的疫苗免疫策略

通過母源免疫策略誘導(dǎo)乳汁免疫來抑制TGEV感染的策略（Saif,1999;Saif et al.,2012）（Saif L J, Proceedings of the 2015 AASV Annual Meeting,page 403-406）。可應(yīng)用于新出現(xiàn)的PEDV感染?？偨Y(jié)前期研究成果，僅使用弱毒口服TGEV疫苗經(jīng)過多倍劑量接種懷孕母豬（通常在產(chǎn)前5～6周和2～3周進(jìn)行2次接種）誘導(dǎo)乳汁中產(chǎn)生sIgA抗體和變化的被動保護(hù)率。然而，弱毒株免疫母豬較強(qiáng)毒株免疫母豬產(chǎn)生較低的乳汁sIgA抗體水平和仔豬保護(hù)率。導(dǎo)致差異原因包括疫苗中較低的病毒量和胃腸道穩(wěn)態(tài)的喪失，以及病毒致弱后在母豬腸道復(fù)制能力。在免疫母豬所產(chǎn)仔豬TGEV攻毒保護(hù)研究中，如果疫苗在母豬腸道中誘導(dǎo)主動免疫失敗，母豬發(fā)病，表現(xiàn)腹瀉或食欲減退和停止乳汁產(chǎn)生，哺乳仔豬表現(xiàn)高死亡率（Saif et al.,2012）（Saif L J,Proceedings of the 2015 AASV Annual Meeting,page 403-406）。因此，誘導(dǎo)有效黏膜免疫的TGEV或PEDV母源疫苗對于保護(hù)母豬腸道是至關(guān)重要的。先前提到，使用滅活TGEV疫苗經(jīng)非口途徑免疫不能誘導(dǎo)黏膜免疫，在血清和初乳中主要是系統(tǒng)性的IgG抗體占主導(dǎo)地位，其在乳汁中很快下降，提供給仔豬微不足道（很小）的乳汁免疫。例外的是，如果血清中誘導(dǎo)產(chǎn)生的高水平IgG抗體滲入初乳中，其在乳汁中高水平維持可保護(hù)新生仔豬度過第1周。通過肌注滅活或活的PEDV疫苗是否能夠刺激母豬產(chǎn)生針對PEDV的足夠免疫保護(hù)，Paudel等（2014）在母豬中評價了4組疫苗組合的免疫效果，包括非免疫對照組，滅活疫苗免疫組（兩次免疫，K/K），活疫苗免疫組（兩次免疫，L/L）和活疫苗、滅活疫苗免疫組（活疫苗首免，滅活疫苗加強(qiáng)免疫，L/K）。所有免疫采用肌注途徑，分別在產(chǎn)前4周和2周進(jìn)行。母豬經(jīng)ELISA抗體檢測和RT-PCR檢測為PEDV陰性（糞便檢測）。研究表明：K/K組母豬血清、初乳和仔豬血清中有更高的IgG和IgA抗體滴度和中和活性，L/L組水平最低。由于活疫苗的肌肉注射途徑，病毒不太可能到達(dá)腸道，從而在大多數(shù)母豬的小腸上皮細(xì)胞復(fù)制。這項研究結(jié)果可提供關(guān)于疫苗免疫原性的資料，但是不能反映經(jīng)口途徑感染PEDV后的免疫反應(yīng)。此外，還需要進(jìn)行仔豬PEDV攻毒保護(hù)試驗來確證K/K免疫組提供給仔豬充足的乳汁免疫和對發(fā)病仔豬的有效保護(hù)（Paudel et al.,2014）。

4.1 關(guān)于母源疫苗設(shè)計和返飼途徑中IgA免疫細(xì)胞從腸到乳腺靶向歸巢的實際情況

IgA免疫細(xì)胞從腸至乳腺歸巢的時間和機(jī)制，與疫苗免疫方法，豬群免疫狀態(tài)的相關(guān)性，尚存在許多未解問題。關(guān)于使妊娠母豬產(chǎn)生足夠乳汁免疫的最佳疫苗免疫時間或間隔的研究很少。也沒有關(guān)于經(jīng)產(chǎn)母豬和后備母豬的疫苗免疫反應(yīng)比較的詳細(xì)研究。對于經(jīng)產(chǎn)母豬和后備母豬來說，妊娠期間“腸-乳腺-sIgA軸”何時啟動是一個重要問題，青春前期后備母豬是否能通過暴露于病毒后誘導(dǎo)。在第一項研究中，使用US PEDV分離毒株進(jìn)行試驗，使用自然感染PEDV SINDEL弱毒株豬群的4頭母豬（平均胎次5.4），農(nóng)場中母豬自然感染臨床分離的活病毒株。7個月后，這些母豬轉(zhuǎn)入隔離設(shè)施，在妊娠109 d，試驗條件下再次接觸更強(qiáng)的PEDV分離毒株。產(chǎn)后3日齡仔豬，給予口服接種強(qiáng)毒，記錄攻毒后4 d內(nèi)仔豬的存活情況。在PEDV陽性豬群組，攻毒后所有仔豬全部存活，無感染豬群組攻毒后死亡率為33%（Goede et al.,2015）。這個研究表明：豬場經(jīng)產(chǎn)母豬能夠產(chǎn)生乳汁免疫，但是攻毒仔豬保護(hù)效果不完全，在4窩豬中變化不定，這也提示有許多影響因素。新近報道，研究者對接觸病毒后母豬進(jìn)行了至少5個月PEDV血清抗體滴度檢測。有必要對性成熟或妊娠前后備母豬感染PEDV后所產(chǎn)仔豬進(jìn)行攻毒保護(hù)試驗，以便確定后備母豬和經(jīng)產(chǎn)母豬乳汁免疫的誘導(dǎo)效果和仔豬被動免疫的相關(guān)性（Schelkopf et al.,Proceedings of the 2016 AASV Annual Meeting,page 309）。另一個重要問題，在后備母豬/經(jīng)產(chǎn)母豬腸道中病毒復(fù)制的劑量和區(qū)域如何影響乳汁中IgA抗體誘導(dǎo)，是否乳汁IgA抗體對預(yù)防仔豬PEDV感染足夠。如同在TGEV疫苗研究中闡述，在設(shè)計母源疫苗和返飼方式時，應(yīng)該考慮到經(jīng)產(chǎn)母豬腸道PEDV復(fù)制，或者使用PEDV弱毒疫苗，要考慮誘導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生抗原的穩(wěn)定性和免疫原性。

4.2 豬群PEDV狀態(tài)

根據(jù)PEDV感染，抗體水平和臨床癥狀，可將豬群分成3種狀態(tài)。PEDV陰性豬群為無PEDV感染；PEDV活動豬群為RT-qPCR檢測到病毒并表現(xiàn)臨床發(fā)病豬群；PEDV穩(wěn)定豬群為之前感染過PEDV，之后不表現(xiàn)臨床疾病，基于RT-qPCR檢測的PEDV糞便檢測為陰性，部分或全部母豬PEDV抗體陽性。在美國PEDV感染的第4年初，PEDV活動豬群可能是在流行早期之前感染豬群。其臨床疾病沒有首次感染豬群廣泛，表明PEDV首次感染豬群中經(jīng)產(chǎn)母豬的母源免疫缺乏（Goede and Morrison,2016）（Proceedingsofthe2016 AASV Annual Meeting:Hough, S,page 358-359,Thomas,P,page 360-362）。從2013—2014年年底之后，在美國新發(fā)PEDV病例明顯減少，但仍出現(xiàn)PEDV陰性豬群首次感染的偶發(fā)病例，如同在2013年首次報道一樣，豬場經(jīng)歷明顯的經(jīng)濟(jì)損失（https://www.aphis.usda.gov/aphis/ourfocus/animal health/animal-disease-information/swine disease-information/ct_ped_info）。對豬群不同狀態(tài)的描述可為針對PEDV的控制策略提供一定依據(jù)。然而，由于美國大多數(shù)豬采用多點式生產(chǎn)方式飼養(yǎng)，這些豬來源于包括超過1 000頭共舍的經(jīng)產(chǎn)母豬場。此外，在一些飼養(yǎng)點，大的母豬舍分布密集。相反，更多傳統(tǒng)的生產(chǎn)-肥育飼養(yǎng)場，在其所有飼養(yǎng)點上包含相對少量的母豬數(shù)量。在豬群飼養(yǎng)管理方面的多樣性導(dǎo)致了多個豬病的混合感染流行，對于PEDV來說，這種情況尤其受影響。

4.3 返飼方法

起初，通過將整個豬群暴露于污染材料或返飼（如感染仔豬糞便和腸組織）的方式來激發(fā)PEDV的主動免疫，從而達(dá)到控制PED的目的（https://www. aasv.org/）。使母豬產(chǎn)生針對PEDV的免疫保護(hù)，且通過初乳或乳汁轉(zhuǎn)移給仔豬，使仔豬在最易感染階段，獲得有效保護(hù)。從臨床發(fā)病率明顯下降角度來看，返飼策略似乎起到很好作用，但并不是100%有效（Goede and Morrison,2016）。返飼實踐中，減少或消除臨床疾病過程產(chǎn)生的明顯不足是控制感染后母豬免疫的持續(xù)時間和質(zhì)量問題。此外，將大量豬群暴露于病毒所帶來的問題，返飼用生物材料的質(zhì)量問題，返飼人員實際操作存在的問題。涉及多種返飼的改進(jìn)策略，在確保所有母豬至少1次暴露給感染病毒的目標(biāo)下，在超過2周時間內(nèi)，使所有經(jīng)產(chǎn)母豬返飼2～3次（https://www.aasv.org/pedv/Conceptsforherdexposure 121713.pdf）。這種方式明顯改善了一些豬場條件，但仍有低水平臨床病例報告，這也說明一些繁殖豬群通過返飼方式來獲得免疫并不可行?；蛘撸M管母豬用感染野毒的方式獲得免疫，但仔豬仍然受侵襲，原因為：1）母豬免疫的持續(xù)期或等級不夠；2）臨近生產(chǎn)階段，返飼使用的病毒致病性太強(qiáng)導(dǎo)致經(jīng)產(chǎn)母豬在產(chǎn)房大量病毒所致。這些結(jié)果突出顯示了對母豬乳汁免疫影響因素和哺乳仔豬被動免疫保護(hù)相關(guān)因素了解缺乏。返飼失敗也可能與弱毒疫苗有相似的問題：1）病毒含量太低；2）材料的不當(dāng)儲存；3）豬體已有的免疫阻斷了腸道中病毒復(fù)制；4）妊娠階段返飼時間的選擇影響了乳汁免疫效果（Ackerman M,Proceedings of the 2015 AASV Annual Meeting,page 421）。

4.4 豬群大小影響PEDV感染的持續(xù)性

隨著US PEDV流行進(jìn)行第4年，發(fā)表了很多的臨床病例報告（Goede and Morrison,2016）（Proceedings of the 2016 AASV Annual Meeting:Hough,S,page 358-359,Thomas,P,page 360-362）。有研究表明在疫病暴發(fā)的急性期，返飼策略幫助許多的農(nóng)場減少了損失，其對將來疾病的發(fā)生起到了預(yù)防作用（比如，PEDV穩(wěn)定豬群）。然而，也有一些農(nóng)場返飼實踐中存在控制疾病的困難期（PEDV活躍豬群）。小豬群的陰性狀態(tài)可能歸咎于較少污染的運(yùn)輸工具、工人衣服和輸入豬群。較小豬場比起大型豬場，工人易于監(jiān)督管理，地理位置上更容易分隔開，大豬場相對更集中。

現(xiàn)階段，在美國無PEDV感染豬群反映了其嚴(yán)格堅持的生物安全實踐；PEDV穩(wěn)定豬群表明感染豬群如何消除PEDV和維持無病毒感染；PEDV活躍豬群通常是單個疫點大群發(fā)病，從農(nóng)場中消除病毒很困難。這種地方流行性PEDV感染可能反映出經(jīng)產(chǎn)母豬群缺乏的免疫，而不是存在一種特定的可再感染母豬的環(huán)境穩(wěn)定病毒。所有PEDV分離株理化特性相似，對消毒劑、脫水劑等有相同易感性。因此，農(nóng)場之間的差異與農(nóng)場特定的活動和返飼方法相關(guān)，而不是由于新病毒株的出現(xiàn)。PEDV穩(wěn)定場典型特點是較小，比大豬場更可能徹底凈化。此外，對感染性PEDV病毒在糞漿（http://www.pork.org/wpcontent/uploads/2014/05/goyal-13-215-main.pdf）和儲糞池（Tun et al.,2016）中長期檢測的試驗數(shù)據(jù)表明其可能作為再感染的潛在貯存庫，在大農(nóng)場和小農(nóng)場對糞便的處理方式的不同決定了PEDV穩(wěn)定群和活躍群之間的差異。“全進(jìn)全出”的管理實踐活動中，由于連續(xù)的母豬分娩，新生仔豬持續(xù)出生也一定程度影響PEDV在豬群中的傳播和持續(xù)性。豬群還易通過污染的飼料感染。有研究報告和試驗表明在許多無感染農(nóng)場可能是通過污染飼料發(fā)生了PEDV感染（Bowman et al.,2015;Deet et al.,2014;Dee et al.,2016;Kochhar,2014），也有關(guān)于PEDV流行起源于中國的假設(shè)報道（Huang et al.,2013）。

5 在血清陽性豬群中通過首次/加強(qiáng)母源免疫的策略來增強(qiáng)仔豬保護(hù)（針對于地方流行的TGEV和PEDV）

腸道病毒疫苗研究包括TGEV和輪狀病毒，兒童脊髓灰質(zhì)炎病毒（Jafari et al.,2014;John et al., 2014）中，提出自然感染或口服免疫的方式進(jìn)行首次免疫，而后選用非口途徑的亞單位或滅活疫苗進(jìn)行加強(qiáng)免疫，能夠增強(qiáng)或保持黏膜或乳汁免疫效果。經(jīng)口首免/非口途徑加強(qiáng)免疫的策略可解釋為何這些非口服疫苗在TGEV或輪狀病毒感染或使用口服弱毒疫苗的母豬中是有效的（Saif,1999;Saif et al., 2012）。例如，非口途徑免疫TGEV S蛋白亞單位疫苗（包含病毒中和表位），單獨接種血清陰性的懷孕母豬無法誘導(dǎo)乳汁IgA抗體的產(chǎn)生和對仔豬的被動保護(hù)（Shoup et al.,1997）。然而，當(dāng)作為口服首免母豬的加強(qiáng)免疫用疫苗時，S蛋白單位疫苗或滅活的TGEV疫苗增強(qiáng)了乳汁sIgA抗體滴度和被動保護(hù)效果（Park et al.,1998）。單獨使用滅活輪狀病毒顆粒疫苗不能誘導(dǎo)腸道sIgA抗體和對仔豬的有效保護(hù)，而在使用活疫苗首免后的加強(qiáng)免疫后，產(chǎn)生比口服弱毒輪狀病毒活疫苗加強(qiáng)的免疫效果（Azevedo et al.,2013）。乳汁免疫和仔豬免疫保護(hù)均可通過使用口服首免活疫苗、非口途徑滅活疫苗加強(qiáng)免疫的方式來增強(qiáng)。腸黏膜病毒復(fù)制刺激影響經(jīng)由“腸-乳腺-sIgA軸”的乳汁免疫。這種模式系統(tǒng)也適用于PEDV，也需要類似的母源免疫策略“腸-乳腺-sIgA軸”啟動和仔豬保護(hù)效果。近期研究人員分別給無PEDV感染的懷孕母豬和感染過PEDV的懷孕母豬在產(chǎn)前5周和2周進(jìn)行肌注滅活疫苗，進(jìn)而比較兩種母豬的免疫效果。陰性對照母豬使用RT-PCR檢測為陰性，無血清學(xué)數(shù)據(jù)。使用1日齡PEDV感染仔豬的糞便，稀釋至PCR Ct19，對所有5日齡仔豬進(jìn)行口服攻擊。研究表明，相比無感染母豬，先前接觸過PEDV的母豬血清和乳汁中PEDV IgA抗體水平明顯增加，在兩組母豬中使用滅活疫苗接種均未產(chǎn)生增強(qiáng)的免疫效果；滅活疫苗刺激產(chǎn)生的血清IgG抗體滴度明顯增加，無論是無感染母豬還是感染過病毒母豬其血清或乳汁IgA抗體滴度沒有明顯增加。仔豬死亡率與初乳和乳汁中PEDV IgA抗體滴度相關(guān)，先前接觸過病毒的母豬，在初乳和乳汁中檢測到IgA抗體，其豬窩中仔豬沒有發(fā)生死亡；而來自于無感染豬群母豬所產(chǎn)仔豬表現(xiàn)高的死亡率。這也提議在管理試驗時間和條件下，無論是無感染母豬還是感染過病原母豬，滅活疫苗作為初次免疫或加強(qiáng)免疫對于誘導(dǎo)乳汁免疫無效（Schwartz et al.,Proceedingsofthe2016AASVAnnualMeeting,page363-366）。

6 PEDV疫苗：過去和現(xiàn)在

在20世紀(jì)80至90年代的歐洲，由于PEDV暴發(fā)明顯減少，對于PEDV疫苗的研究主要集中在PEDV強(qiáng)毒株暴發(fā)引起巨大經(jīng)濟(jì)影響的亞洲國家。1999年以后，中國主要使用PEDV和TGEV二聯(lián)滅活疫苗（Ma et al.,1995）。2003—2006年，豬群使用PEDV弱毒疫苗。這些疫苗中，尤其是TGEV/PEDV二聯(lián)滅活疫苗被廣泛用來控制PEDV感染。隨著2010年出現(xiàn)了毒力更強(qiáng)的PEDV毒株，也迫切需要更有效的疫苗來控制新疫病的暴發(fā)。在2010年暴發(fā)PEDV期間，疫苗誘導(dǎo)仔豬免疫保護(hù)的缺乏可能是高毒力新毒株與經(jīng)典PEDV毒株的基因遺傳分析差異所致，經(jīng)典毒株和高毒力的新毒株之間誘導(dǎo)交叉中和抗體（Lin et al.,2015;Song et al.,2015）。為獲得更有效的疫苗，2014年12月TGEV、PEDV、RoV三聯(lián)活疫苗獲批上市（Song et al.,2015）。據(jù)報道在試驗豬場該產(chǎn)品表現(xiàn)出增強(qiáng)的保護(hù)率，但是關(guān)于效力和免疫機(jī)制相關(guān)的研究資料未公開。韓國從2004年開始使用PEDV弱毒疫苗進(jìn)行口服免疫，PEDV DR13株在Vero細(xì)胞上連續(xù)傳代至100代，整個致弱過程中通過限制性片段長度多態(tài)性分析（RFLP）確定了毒株中9個核苷酸的改變和ORF3基因序列的變異（Song and Park,2012）。在日本，1997年之后，一直使用細(xì)胞培養(yǎng)適應(yīng)的商品化弱毒疫苗（P-5V）。這些疫苗是有效的，但是并不是所有免疫母豬均獲得了穩(wěn)固的乳汁免疫（Song et al.,2015）。一些關(guān)于影響乳汁免疫效果低的因素包括疫苗中使用的優(yōu)勢抗原、抗原穩(wěn)定性、抗原劑量、免疫途徑，以及先前討論的一些其它參數(shù)。自2013年P(guān)EDV暴發(fā)以來，美國批準(zhǔn)了兩個PEDV疫苗產(chǎn)品，第一個疫苗由Harrisvaccines開發(fā)，其基于α病毒表達(dá)載體技術(shù)（Vander Veen et al., 2012）。2013年第一代疫苗（iPED）在限制使用條件下獲準(zhǔn)上市，2014年1月第二代疫苗（iPED+）獲準(zhǔn)上市。iPED+疫苗較iPED疫苗而言，結(jié)合了更長S基因片段，該產(chǎn)品標(biāo)注給經(jīng)產(chǎn)母豬或后備母豬分娩前肌注1頭份。第二個疫苗Zoetis公司開發(fā)了滅活疫苗（Florham Park,New Jersey,Study Report No.B826RUS-13-258,Zoetis Inc.），該產(chǎn)品給經(jīng)產(chǎn)母豬或后備母豬分娩前肌注2頭份。雖然這兩個疫苗在美國使用，但也缺乏田間效力和免疫相關(guān)的公開數(shù)據(jù)。需要在試驗場和現(xiàn)地豬場進(jìn)行更多研究來確定這些疫苗的效果，以鑒定哺乳仔豬免疫保護(hù)關(guān)系。

7 結(jié)論

充足的乳汁免疫對于哺乳仔豬被動獲得對PEDV感染的保護(hù)是必需的。雖從TGEV的母源預(yù)防效果中獲得許多了解，豬呼吸道冠狀病毒（PRCV）的出現(xiàn)誘導(dǎo)了針對TGEV的交叉保護(hù)，使得沒有更進(jìn)一步對“腸-乳腺-sIgA軸”和乳汁免疫機(jī)制相關(guān)變量進(jìn)行詳細(xì)研究。目前研究表明，初乳和乳汁IgA和PEDV中和抗體滴度可能與PEDV保護(hù)性免疫相關(guān)。研究表明，在乳汁分泌物中，充足的IgA和PEDV中和抗體滴度可能依賴于母豬腸道中病毒的劑量和病毒復(fù)制區(qū)域。關(guān)于“腸-乳腺-sIgA軸”誘導(dǎo)和維持的機(jī)制仍有很多未知之處。在現(xiàn)地豬場，很多因素導(dǎo)致了疫苗免疫失敗，尤其是經(jīng)過返飼操作?，F(xiàn)地觀察結(jié)果和在亞洲國家的疫苗免疫接種試驗中觀察到缺乏的乳汁免疫問題，進(jìn)一步突出我們對影響乳汁免疫誘導(dǎo)因素了解的欠缺，這些因素包括接種劑量，毒株免疫原性，疫苗病毒抗原，經(jīng)產(chǎn)母豬/后備母豬日齡和疫苗接種時妊娠階段動物性成熟程度等。我們開發(fā)疫苗的策略必須是靶向應(yīng)答最強(qiáng)的懷孕或泌乳母豬，鑒定影響乳汁免疫的因素有利于改善妊娠豬群PEDV疫苗和其它腸道病原疫苗的免疫計劃，有利于改善整個豬群的免疫力和豬場生產(chǎn)效力。

（編輯：郭玉翠）

S828

A

1002-1957(2017)01-0033-08

2016-12-02收稿，2016-12-20修回

呂茂杰（1982-），男，山西靜樂人，博士，主要從事獸用疫苗的研究和開發(fā)工作.E-mail：lvmaojie650@sina.com

校者簡介：楊保收（1962-），男，教授，博士，研究方向為獸醫(yī)生物技術(shù)與疫苗開發(fā).E-mail：bsyang@ringpu.com