何永盛+林霖+賴心田+王坤+吳佳輝+陳國培

摘要：現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)對羽絨服裝產(chǎn)品中亞硫酸鹽還原梭狀芽孢桿菌的檢測存在檢測周期長、結(jié)果缺乏確證手段等不足之處，需要建立更為快速準(zhǔn)確的檢測方法進(jìn)行補(bǔ)充和完善。本研究建立了可用于亞硫酸鹽還原梭狀芽孢桿菌鑒定的實(shí)時熒光PCR檢測方法，并對該方法的特異性和檢出限進(jìn)行了分析驗(yàn)證，結(jié)果顯示建立的方法具有良好的特異性，檢出限為20 CFU/mL。在50批次樣品檢測中，本研究建立的方法與國標(biāo)檢測方法具有較好的一致性，可以應(yīng)用于羽絨服裝樣品的日常檢測。

關(guān)鍵詞：羽絨；亞硫酸鹽還原梭狀芽孢桿菌；實(shí)時熒光PCR

中圖分類號：TS107 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Research on Fluorescence PCR Method for Detecting Sulfite-reducing Clostridia in Down Products

Abstract： Sulfite-reducing clostridia is an important detection index for down products. Due to long testing period and insufficient accuracy， the existing standard test method should be further complemented and improved. Hence， it is necessary to develop a quick and accurate detection method. In this study， a fluorescence PCR method for detecting sulfite-reducing clostridia was established， and the sensitivity and detection limit of the method were analyzed and verified by subsequent experiments. The experiment results showed that the established method can distinguish sulfite-reducing clostridia from other bacteria effectively， and its detection limit reached 20 CFU/mL. The testing of fifty lots of down products verified that the established method is consistent with national standard test method and it can be applied to routine testing of down products.

Key words： down product； sulfite-reducing clostridia； fluorescence real-time PCR

我國是羽絨及其制品的生產(chǎn)、出口和消費(fèi)大國，近年來羽絨的安全衛(wèi)生問題越來越受到人們的關(guān)注。微生物衛(wèi)生指標(biāo)不合格是制約我國羽絨服裝產(chǎn)品出口的一個重要因素。目前，我國和歐盟的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)都對羽絨產(chǎn)品的微生物限量提出了明確的要求。作為羽絨服裝產(chǎn)品檢測中的重要微生物指標(biāo)之一，亞硫酸鹽還原梭狀芽孢桿菌對外界環(huán)境有極強(qiáng)的耐受能力，高溫滅菌等一般的滅菌方法難以將其殺死，因此在檢測當(dāng)中往往成為導(dǎo)致羽絨服裝產(chǎn)品不合格的主要污染菌。我國羽絨服裝中針對該菌的檢測多采用國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 14272 — 2011《羽絨服裝》中規(guī)定的方法，主要通過測定平板上的黑點(diǎn)狀菌落數(shù)目來判定該菌是否超標(biāo)。這種檢測方法雖然操作簡單，但卻也存在檢測周期過長以及檢測結(jié)果缺乏確證手段等不足之處，因此有必要建立更為快速準(zhǔn)確的檢測方法對其進(jìn)行補(bǔ)充和完善。

實(shí)時熒光PCR技術(shù)操作簡便、靈敏度高、特異性強(qiáng)，已廣泛應(yīng)用于多種病原微生物的快速檢測當(dāng)中，然而將其應(yīng)用于亞硫酸鹽還原梭狀芽孢桿菌檢測的研究在國內(nèi)外仍未見報道。本研究擬利用實(shí)時熒光PCR技術(shù)建立可用于鑒定亞硫酸鹽還原梭狀芽孢桿菌的檢測方法，并將其應(yīng)用于羽絨產(chǎn)品的實(shí)際檢測當(dāng)中。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

羽絨服裝樣品均由客戶提供。丁酸梭菌（CICC 10390）、巴氏梭菌（CICC 10391）、索氏梭菌（CICC 22950）、雙酶梭菌（CICC 22952）、拜氏梭菌（CICC 22954）、產(chǎn)氣莢膜梭菌（CICC 22949）購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

蛋白胨水、亞硫酸鐵多粘菌素B瓊脂、強(qiáng)化梭菌培養(yǎng)基購自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；2×premix ExTaq酶購自寶生物工程（大連）有限公司；實(shí)驗(yàn)中所用引物及探針（表 1）由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 引物和探針的設(shè)計(jì)

通過測序以及在數(shù)據(jù)庫中查找的方式獲得17種亞硫酸鹽還原梭狀芽孢桿菌的16SrRNA序列，通過序列比對設(shè)計(jì)出特異性的引物和探針。各菌種的名稱及其序列來源如表 2 所示，其中丁酸梭菌等 6 個菌種的序列通過自行測序獲得，所用引物為文獻(xiàn)報道的菌種16SrRNA測序引物（表 1），其他菌種序列來源于NCBI數(shù)據(jù)庫。

1.2.2 菌株基因組DNA的制備

以水煮法制備標(biāo)準(zhǔn)菌株的基因組DNA。對 6 株亞硫酸鹽還原梭狀芽孢桿菌進(jìn)行增菌培養(yǎng)，取 1 mL菌液，12 000 r/min離心 5 min，棄上清；加入100 μL去離子水重懸菌體，沸水浴加熱 5 min；12 000 r/min離心 5 min，轉(zhuǎn)移上清液至新的離心管，-20 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?

1.2.3 熒光PCR檢測體系的建立及結(jié)果判定

反應(yīng)體系為20 μL，其中 2×premix ExTaq為10 μL，引物（Clostridium-Forward和Clostridium-Reverse）各0.2 μmol/L，探針（Clostridium-Probe1和ClostridiumProbe2）各0.1 μmol/L，標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA為 2 μL。

反應(yīng)程序：95 ℃時 1 min；95 ℃時10 s，55 ℃時20 s，72 ℃時34 s，40個循環(huán)。

結(jié)果判定：Ct值≤35時，可判定結(jié)果為陽性；Ct值≥40時，可判定結(jié)果為陰性；35

1.2.4 方法特異性檢驗(yàn)

選取丁酸梭菌等 6 種亞硫酸鹽還原梭狀芽孢桿菌及27種其他細(xì)菌，用水煮法提取基因組DNA，使用特異性的引物和探針進(jìn)行熒光PCR反應(yīng)，以驗(yàn)證方法的特異性。

1.2.5 方法檢出限測試

通過前期實(shí)驗(yàn)測試發(fā)現(xiàn)雙酶梭菌是羽絨服裝產(chǎn)品中經(jīng)常被檢出的亞硫酸鹽還原梭狀芽孢桿菌，因此選取該菌作為方法檢測出限測試的代表菌株。對雙酶梭菌進(jìn)行增菌培養(yǎng)，離心收集菌體，用生理鹽水重懸至 1 個MCF（麥?zhǔn)蠁挝唬?，并以此為母液進(jìn)行梯度稀釋，最低稀釋度為10-8 MCF。以水煮法提取每個稀釋度菌液的DNA，用建立的方法進(jìn)行熒光PCR檢測，每個稀釋度設(shè)置 2 個平行，同時取10-4、10-5、10-6 MCF 3 個稀釋度菌液涂布平板，按GB 4789.2 — 2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測定》規(guī)定方法進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

1.2.6 實(shí)際樣品檢測

選取50批次羽絨服裝樣品檢驗(yàn)方法的實(shí)際適用性。取出 3 g樣品至無菌袋中，加入300 mL蛋白胨水，20 ℃恒溫振蕩培養(yǎng) 3 h；轉(zhuǎn)移10 mL樣液至試管中，75 ℃加熱10 min；吸取 1 mL加熱后的樣液至10 mL強(qiáng)化梭菌培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)過夜，次日以水煮法制備測試所需的DNA，用設(shè)計(jì)的特異性引物和探針進(jìn)行熒光PCR反應(yīng)，同時把各批次樣品按GB/T 14272 — 2011規(guī)定的方法進(jìn)行檢測，對比 2 種方法的檢測結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 方法特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

以丁酸梭菌等 6 種亞硫酸鹽還原梭狀芽孢桿菌以及27種其他細(xì)菌檢驗(yàn)方法的特異性，結(jié)果表明設(shè)計(jì)的引物和探針具有良好的特異性，對 6 種亞硫酸鹽還原梭狀芽孢桿菌都能擴(kuò)增出特異性的曲線，而對其他27種細(xì)菌種則沒有非特異擴(kuò)增，檢測結(jié)果如表 3 所示。

2.2 方法檢出限實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖 1）

選取10-4、10-5、10-6 MCF 3 個稀釋度菌液涂布平板，按GB 4789.2 — 2010規(guī)定的方法進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。經(jīng)計(jì)算，濁度為 1 MCF的雙酶梭菌菌液對應(yīng)的菌落數(shù)為2×107 CFU/mL。取每個稀釋度菌液 1 mL，以水煮法提取DNA，使用亞硫酸鹽還原梭狀芽孢桿菌特異性引物和探針進(jìn)行熒光PCR反應(yīng)，擴(kuò)增結(jié)果顯示方法的最低檢測限為20 CFU/mL。

2.3 實(shí)際樣品檢測結(jié)果

利用建立的熒光PCR檢測方法以及GB/T 14272 —2011中規(guī)定的方法對50批次羽絨服裝樣品進(jìn)行檢測（表4）。結(jié)果顯示，本研究建立的方法檢出有 9 批次樣品的亞硫酸鹽還原梭狀芽孢桿菌含量≥100 CFU/g，而GB/T 14272 — 2011規(guī)定的方法則檢出 8 批次樣品的亞硫酸鹽還原梭狀芽孢桿菌含量超標(biāo)，2 種方法的檢測結(jié)果具有較高的一致性。

3 討論

在針對單一病源微生物進(jìn)行檢測時，研究人員往往會選擇其特有的毒力基因或抗原基因來設(shè)計(jì)引物和探針，然而亞硫酸鹽還原梭狀芽孢桿菌是一類形態(tài)各異、營養(yǎng)類型多樣的微生物，尋找它們共有的抗原基因或毒力基因存在較大的難度。由于16SrRNA基因序列長短適中，其結(jié)構(gòu)中既有保守區(qū)又有變異區(qū)，是較好的生物標(biāo)志物。因此本研究選擇以此作為靶基因，對17種亞硫酸鹽還原梭狀芽孢桿菌的16SrRNA序列進(jìn)行比對，尋找可用于設(shè)計(jì)特異性引物和探針的基因位點(diǎn)，建立了可以用于該類細(xì)菌鑒定的實(shí)時熒光PCR檢測方法。

在50批次羽絨服裝檢測當(dāng)中，本研究建立的方法與GB/T 14272 — 2011中規(guī)定的方法在檢測結(jié)果上具有較好的一致性，僅 1 個批次樣品檢測結(jié)果存在差異。這可能是由于本研究采用的方法經(jīng)過增菌培養(yǎng)，而且熒光PCR檢測方法又具有極高的靈敏度，從而在一定程度上提高了該類細(xì)菌的檢出率。GB/T 14272 — 2011采用的檢測方法僅微物生培養(yǎng)就需要耗費(fèi)48 h，而本研究建立的熒光PCR檢測方法可以有效縮短檢測周期，更能適應(yīng)大批量樣品在檢測時效性方面的需求。另外，微生物檢測的最終確證往往需要進(jìn)行一系列的生化實(shí)驗(yàn)，而國家標(biāo)準(zhǔn)中采用的檢測方法只是簡單地通過菌落的形態(tài)和顏色來進(jìn)行判別，缺乏進(jìn)一步確證的方法，因此本研究建立的方法也可以作為輔助國標(biāo)檢測方法進(jìn)行結(jié)果確證的一個有效手段。

參考文獻(xiàn)（略）