陳玉琴，楊亦彬

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，貴州遵義563003)

·綜述·

腎臟組織工程研究進(jìn)展

陳玉琴，楊亦彬

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，貴州遵義563003)

慢性腎臟病(CKD)已成為日益嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題，其持續(xù)進(jìn)展的共同結(jié)局是終末期腎臟病(ESRD)。透析和腎移植是目前ESRD主要替代治療手段，但存在種種不足或受限。新興的組織工程技術(shù)在修復(fù)、改善和重建人體病損組織或器官已取得可喜的進(jìn)展，其相關(guān)技術(shù)手段也為腎臟組織工程的研究提供了可能。

腎臟；組織工程；種子細(xì)胞；支架；3D生物打印

組織工程旨在應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)、生物材料和工程學(xué)的原理，研發(fā)用于修復(fù)、改善和重建人體病損組織或器官的生物活性替代物。細(xì)胞來源、支架材料以及生物活性物質(zhì)是組織工程策略3個(gè)主要的組件[1]。腎臟是機(jī)體主要的排泄器官，通過腎小球?yàn)V過、腎小管上皮細(xì)胞和周圍的微血管以及間質(zhì)支持系統(tǒng)互補(bǔ)，來調(diào)節(jié)清除廢物和重吸收。而如何選擇合適的支架材料來模擬體內(nèi)正常的生長環(huán)境，對(duì)誘導(dǎo)種子細(xì)胞形成腎臟組織是至關(guān)重要的。近年來，新興技術(shù)如去細(xì)胞和生物打印技術(shù)革新了組織工程領(lǐng)域，是目前最有前景的兩個(gè)器官生物工程方法，使創(chuàng)造復(fù)雜的三維器官(如腎臟)成為可能[2-3]。

1 種子細(xì)胞的研究

種子細(xì)胞是組織工程的核心內(nèi)容之一，能為支架材料提供生命源泉，其主要來源于自體、同種異體或異種，具有增殖和分化為特定細(xì)胞的能力以及不引起免疫排斥反應(yīng)等特點(diǎn)。胚胎干細(xì)胞(ESCs)來源于胚胎囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)[4]，是最早期的未分化細(xì)胞，具有無限增殖、自我更新和多向分化的潛能，但涉及倫理及移植排斥反應(yīng)是臨床應(yīng)用最主要的障礙。而由多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子重編程普通體細(xì)胞獲得人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(IPSCs)，繞開了ESCs面臨的技術(shù)難題和倫理障礙，在再生醫(yī)學(xué)及疾病模型等研究領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景。腎臟是由中胚層通過輸尿管芽的形成和毗鄰的中胚層派生的后腎間質(zhì)分化形成[5]。IPSCs可定向分化成腎臟足細(xì)胞，并誘導(dǎo)后腎間質(zhì)標(biāo)記物的表達(dá)，如Wilms腫瘤基因(Wilms tumor 1，WT1)、Pax2基因(paired box gene 2，Pax2)，WT1和Pax2為腎小管上皮細(xì)胞胚胎分化、發(fā)育的關(guān)鍵基因[6]。Kim等[7]應(yīng)用視黃酸、激活素-A和骨形態(tài)發(fā)生蛋白質(zhì)7與ESCs共培養(yǎng)，其ESCs最終可表達(dá)中胚層標(biāo)記，進(jìn)一步培養(yǎng)后形成腎小管上皮樣結(jié)構(gòu)。在體外，這種干細(xì)胞來源的組件顯示腎再生的可能性。

間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)由于免疫原性小，不易被宿主免疫系統(tǒng)識(shí)別，異體甚至異種移植都具有較好的治療效果，被認(rèn)為是很有潛力、值得深入研究的組織工程種子細(xì)胞。MSC用于腎臟疾病的治療才剛剛起步，眾多研究表明MSC可能成為難治性腎臟疾病的最佳種子細(xì)胞。Kale等[8]認(rèn)為腎組織損傷后，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有能向腎臟內(nèi)遷移，并定植于腎臟的特性。許多腎臟病理學(xué)模型研究也發(fā)現(xiàn)MSC可以歸巢到受損的腎臟，促進(jìn)組織修復(fù)。

除干細(xì)胞外，在組織工程模型的發(fā)展中，自體或異體的腎細(xì)胞是最直接的來源，迄今已建立了許多動(dòng)物的腎細(xì)胞系，包括狗、豬、兔和老鼠。最近，人近曲小管上皮細(xì)胞系HK-2細(xì)胞通過不同的細(xì)胞永生化技術(shù)得到了發(fā)展并大量應(yīng)用于組織工程[9]。

2 支架的研究

生物材料在組織工程中起著替代細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的作用，且必須滿足幾個(gè)關(guān)鍵特征：(1)生物相容性；(2)擁有適當(dāng)?shù)臋C(jī)械強(qiáng)度；(3)顯示生物活性來調(diào)節(jié)3D細(xì)胞微環(huán)境；(4)具有足夠的間隙供營養(yǎng)和代謝廢物擴(kuò)散。ECM是由細(xì)胞分泌到胞外的大分子物質(zhì)，構(gòu)成復(fù)雜的網(wǎng)架結(jié)構(gòu)，因其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)而成為應(yīng)用最廣的支架材料。ECM支架呈三維空間結(jié)構(gòu)，提供天然和高度保守的基質(zhì)供細(xì)胞生存和增殖，還可通過調(diào)控信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路影響細(xì)胞分化和遷移。同時(shí)，ECM支架能促進(jìn)移植物新生血管生成，其降解過程中可釋放血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factorβ，TGFβ)等，在支架降解后繼續(xù)促進(jìn)新生組織分化和生長[10]。

2.1 絲支架慢性腎臟疾病發(fā)生發(fā)展是漸進(jìn)的，某些遺傳性腎病(如多囊腎病)其腎臟病變出現(xiàn)時(shí)間跨度較長，故持續(xù)監(jiān)測病理生理變化，對(duì)闡明疾病進(jìn)展和防治是非常必要的。較長時(shí)間體外培養(yǎng)的組織結(jié)構(gòu)，其可持續(xù)性是組織工程領(lǐng)域長期存在的問題。傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)方法包括動(dòng)物模型和細(xì)胞二維培養(yǎng)，存有一定的局限性，而種子細(xì)胞在三維條件下培養(yǎng)更接近體內(nèi)真實(shí)情況[11]。靜態(tài)系統(tǒng)三維結(jié)構(gòu)培養(yǎng)的細(xì)胞3周后開始崩潰，細(xì)胞存活率隨時(shí)間的推移而降低[12]，故選擇良好的生物材料作支架，對(duì)維持長期的組織培養(yǎng)是必不可少的。絲素蛋白(silk fibroin，SF)主要是從家蠶中提取[13]，作為支架具有以下特性：良好的生物相容性，緩慢的生物降解，有強(qiáng)大的力學(xué)性能，可保持長時(shí)間的框架和開放的多孔結(jié)構(gòu)，而且不需要化學(xué)交聯(lián)。同時(shí)，絲素也可以制備成水凝膠、復(fù)合材料、纖維、微球和薄膜等。絲素需數(shù)月至數(shù)年才會(huì)降解而不會(huì)有過早的結(jié)構(gòu)坍塌以及在緩慢重塑中支持細(xì)胞間的相互作用。Subramanian等[12]通過基于絲素的多孔支架、基質(zhì)膠原和灌注反應(yīng)堆系統(tǒng)生成3D腎組織模型，成功模擬了腎小管功能，且在灌注條件下至少存活6周。這些多孔的絲支架可能有利于模擬需要較長時(shí)間研究的慢性腎臟疾病模型。

2.2 水凝膠水凝膠是一類具有化學(xué)或物理交聯(lián)結(jié)構(gòu)、可吸收并保持大量水分而不溶于水的三維支架材料。水凝膠質(zhì)地柔軟，富有彈性，與活體軟組織質(zhì)感相近。此外，水凝膠的三維空間網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和天然ECM相似，可通過調(diào)節(jié)孔隙率、孔徑大小、增大內(nèi)表面積等途徑，促進(jìn)細(xì)胞粘附、植入與增殖。天然和合成聚合物通過各種化學(xué)交聯(lián)的共價(jià)鍵、物理交聯(lián)的非共價(jià)相互作用或通過兩者的組合交聯(lián)形成水凝膠矩陣，可增強(qiáng)水的吸附作用，能保持一定的形狀，利于細(xì)胞增殖所需的氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)的傳遞和運(yùn)輸[14]。生物聚合物水凝膠由于其被改型而仍能呈遞與體內(nèi)相似的細(xì)胞信號(hào)而作為腎臟組織工程的首選[9]。Manivannan等[15]通過使用聚二甲硅氧烷模具構(gòu)建膠原蛋白渠道，種子細(xì)胞嵌入在這些凝膠系統(tǒng)并且隨機(jī)間隔與其一致的結(jié)構(gòu)形式，這個(gè)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了控制小管形成并且允許示蹤細(xì)胞的遷移。

2.3 器官脫細(xì)胞器官脫細(xì)胞后形成的生物支架已成功應(yīng)用于組織工程和再生醫(yī)學(xué)[16]，而脫細(xì)胞腎臟是一個(gè)相對(duì)較新的技術(shù)。脫細(xì)胞的過程通常會(huì)產(chǎn)生一個(gè)具有ECM分子的三維生物支架[17]，ECM可以影響細(xì)胞粘附、增殖、分化、形態(tài)發(fā)生和表型表達(dá)等一系列生物學(xué)過程，這些因素都有利于腎臟再生。腎臟脫細(xì)胞支架可以由嚙齒動(dòng)物、豬、恒河猴以及人類的腎臟產(chǎn)生[18]，脫細(xì)胞后，腎支架已被證實(shí)能保存腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)以及血管網(wǎng)絡(luò)[19]。利用脫細(xì)胞的腎組織工程支架，多能人胚胎干細(xì)胞(hESC)被播種在整個(gè)或局部腎臟ECM，通過差異化分析hESC表型來了解細(xì)胞遷移，發(fā)現(xiàn)腎譜系標(biāo)記隨著時(shí)間的推移逐步調(diào)節(jié)hESC基因表達(dá)。恒河猴脫細(xì)胞腎可提供天然的ECM且有足夠的空間和組織影響hESC的遷移和分化[20]。然而，獲得一個(gè)合適的人類供體腎存有一定困難，尋找理想的替代異種腎仍是一個(gè)挑戰(zhàn)。有研究證明大鼠、豬、猴子的腎是有潛力的，卻具有極強(qiáng)的免疫原性以及各種人畜共患病的風(fēng)險(xiǎn)。羊腎人畜共患病風(fēng)險(xiǎn)低，且器官結(jié)構(gòu)和大小類似于人類，可能是相對(duì)理想的器官來源。Vishwakarma等[21]開發(fā)了3D山羊腎支架，通過脫細(xì)胞洗滌劑灌注，抗凝劑預(yù)處理后，發(fā)現(xiàn)脫細(xì)胞羊腎支架具有完整的3D自然架構(gòu)和脈管系統(tǒng)，這為腎臟再生提供較好模型。

選擇最佳來源種子細(xì)胞在脫細(xì)胞腎支架中增殖是一個(gè)仍未解決的問題。目前認(rèn)為，由多能性干細(xì)胞(PSC)來源的腎祖細(xì)胞比其他更成熟的細(xì)胞用于生物工程腎更合適。原位移植腎支架在技術(shù)上是可行的，為了更好地執(zhí)行移植腎支架的功能，還需要進(jìn)一步研究這些PSC來源細(xì)胞的類型及分化和成熟過程。此外，血栓形成也是腎支架植入的一個(gè)主要障礙。有研究報(bào)道將脫細(xì)胞豬腎支架植入受體豬兩周以后，發(fā)現(xiàn)廣泛的血栓形成，因此為了維持植入脫細(xì)胞腎支架的時(shí)間，其支架的血管供給是必須考慮的問題[22]。

目前，脫細(xì)胞基質(zhì)的研究涉及各種器官和組織。新近有學(xué)者將腎臟脫細(xì)胞基質(zhì)制成凝膠，發(fā)現(xiàn)脫細(xì)胞基質(zhì)經(jīng)處理后可形成白色半透明的凝膠，呈網(wǎng)狀、多孔結(jié)構(gòu)，適合細(xì)胞長入，并利用腎小管上皮細(xì)胞初步驗(yàn)證了其生物相容性[23]。這為腎臟組織工程支架的選擇提供了新的思路。

3 生物反應(yīng)器

生物反應(yīng)器提供的動(dòng)態(tài)培養(yǎng)可使支架內(nèi)的氧及營養(yǎng)傳播更充分[24]，代謝產(chǎn)物更容易排出，以及使種子細(xì)胞超過被動(dòng)擴(kuò)散的深度。此外，生物反應(yīng)器還能提供很多培養(yǎng)組織所必需的物理信號(hào)。

在體外構(gòu)建腎臟模型除了細(xì)胞和支架的選擇外，更重要的是如何能更好的模擬體內(nèi)的環(huán)境?其中體內(nèi)流體流動(dòng)的模擬是至關(guān)重要的。液體過濾是腎臟的重要功能，主要依賴腎小球和腎小管區(qū)流體流動(dòng)所形成的剪切應(yīng)力，其中以灌注為基礎(chǔ)的流體流動(dòng)更適合在體外模擬體內(nèi)腎功能，并通過使用生物反應(yīng)器系統(tǒng)完成，微流體系統(tǒng)便是其中很好的例子。通過多層微流控裝置來培養(yǎng)及分析腎小管上皮細(xì)胞，在最佳的流體條件下，通過增強(qiáng)細(xì)胞極化，驗(yàn)證了細(xì)胞骨架的重組[25]。此外，對(duì)流體流動(dòng)的控制可能會(huì)得到不同的生物工程模型，從而能更好的模擬不同的疾病狀態(tài)。

4 3D生物打印

面臨國際上器官日益短缺的現(xiàn)狀，3D生物打印[26]可能是解決這一難題最有潛力的新興技術(shù)。3D生物打印制作技術(shù)用于精確分配細(xì)胞負(fù)載(cell-laden)生物材料來制造復(fù)雜的功能性3D活組織或器官[27]。目前研究仍處于初級(jí)階段，涉及到的主要技術(shù)挑戰(zhàn)包括高分辨率細(xì)胞沉積、細(xì)胞分布控制以及三維組織的血管化、神經(jīng)支配等。3D生物打印主要包括3大方式：噴墨、激光輔助和擠壓生物打印，3種技術(shù)各有特定的優(yōu)勢(shì)、弱點(diǎn)和局限性，但都是基于單層的印刷法，通常很難印刷復(fù)雜的空心結(jié)構(gòu)，因此，每一層都必須互相連接和機(jī)械支持打印[3]。目前，結(jié)合人類多能干細(xì)胞技術(shù)的最新進(jìn)展，3D生物打印主要涉及到細(xì)胞、肌肉、骨和軟骨。微脈管系統(tǒng)打印的成功應(yīng)用預(yù)示著在生產(chǎn)功能齊全的血管和神經(jīng)支配的復(fù)雜組織方面(如腎臟、肝臟等)，3D生物打印有可能是唯一的解決方案[28]。

5 展望

為了更好的概括腎臟的結(jié)構(gòu)和功能，模擬不同的疾病狀態(tài)，關(guān)鍵在于組織工程化腎臟如何維持種子細(xì)胞的生長；維護(hù)表型和功能的穩(wěn)定以及單個(gè)組件的開發(fā)并結(jié)合為一個(gè)整體系統(tǒng)，這些都是腎臟組織工程可控、可靠及可持續(xù)發(fā)展的必要條件。未來的研究需要發(fā)展更強(qiáng)大的混合動(dòng)力系統(tǒng)使三維組織結(jié)構(gòu)和復(fù)雜的細(xì)胞相互作用以及與流體流動(dòng)更好的結(jié)合[9]。脫細(xì)胞和3D生物打印技術(shù)在腎臟方面的應(yīng)用雖然尚處于初級(jí)階段，但具有廣闊的應(yīng)用前景。相信隨著有關(guān)學(xué)科的發(fā)展,組織工程方法替代腎臟功能的研究必將會(huì)給腎臟病患者帶來新的希望，有望突破器官移植的范疇，步入器官制造的新時(shí)代。

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R692

A

1003—6350（2017）18—3013—03

2017-02-15)

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.18.026

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楊亦彬。E-mail:yyb1011@sina.com