劉祿，楊娜，夏勤，夏娟，劉智，李林豐，張薇珊，羅啟翅，崔麗娟

(遂寧市中心醫(yī)院病理科1、檢驗(yàn)科2，四川 遂寧 629000)

骨髓穿刺活檢組織快速處理的新方法

劉祿1，楊娜2，夏勤1，夏娟1，劉智1，李林豐1，張薇珊1，羅啟翅1，崔麗娟1

(遂寧市中心醫(yī)院病理科1、檢驗(yàn)科2，四川 遂寧 629000)

目的介紹本科室探索的一種骨髓穿刺組織的快速脫鈣處理方法。方法通過(guò)查閱參考文獻(xiàn)、細(xì)致研究病理科常用試劑理化特性結(jié)合骨髓穿刺組織特點(diǎn)，試驗(yàn)出一種骨髓穿刺組織快速脫鈣方法。結(jié)果采用本方法處理骨髓穿刺組織簡(jiǎn)便快捷，僅需2～4 h；骨髓組織處理質(zhì)量滿意，各造血系統(tǒng)細(xì)胞染色鮮明、透亮，示細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)對(duì)比度清晰；骨小梁脫鈣完全，結(jié)構(gòu)清楚，呈鮮艷紅色，免疫組織化學(xué)染色高質(zhì)量陽(yáng)性顯色，低背景著色，無(wú)非特異性顯色的特點(diǎn)。結(jié)論該方法是較為簡(jiǎn)便實(shí)用的骨髓組織快速處理方法，提高工作效率，值得在病理科工作中推廣采用。

骨髓；穿刺組織；快速處理；新方法

病理科診斷工作中，骨髓穿刺活檢是其中重要一項(xiàng)。對(duì)骨髓組織的脫鈣處理是病理技術(shù)的核心環(huán)節(jié)，骨髓組織的高效快速脫鈣處理是病理診斷的先決條件。本文在查閱文獻(xiàn)基礎(chǔ)上，結(jié)合本科室的長(zhǎng)期探索，現(xiàn)介紹一種骨髓組織的快速脫鈣方法。

1 材料與方法

1.1 儀器及試劑 中性甲醛溶液(濃度37.5%～40.0%)，冰乙酸溶液(濃度99.7%)，氨水(濃度25.0%～28.0%)，濃鹽酸(濃度37.5%)，無(wú)水乙醇(濃度99.7%)，以上試劑均為分析純級(jí)(AR級(jí))，購(gòu)自成都科隆化工試劑廠(成都，科隆)；去離子水由科室自制；組織脫水機(jī)：LEICAASP300S，組織包埋機(jī)：LEICA EG1150H，全自動(dòng)HE染色機(jī)：LEICA AUTO STAINER XL均購(gòu)自德國(guó)徠卡公司(德國(guó)，徠卡)。

1.2 方法

1.2.1 骨髓處理液配置 本方法中對(duì)骨髓穿刺組織處理由三種處理液組成：1)骨髓固定及預(yù)脫鈣液(AAF液)；2)骨髓快速脫鈣液(15%鹽酸)；3)骨髓脫鈣后平衡液(1%氨水)。具體配置為：1)AAF液100 mL (中性甲醛10 mL，無(wú)水乙醇80 mL，冰乙酸5 mL，去離子水5 mL)；2)15%鹽酸100 mL(濃鹽酸15 mL，去離子水85 mL)；3)1%氨水100 mL(氨水1 mL，去離子水99 mL)。以上處理液配置完成后密封保存置室溫過(guò)夜后即可使用。

1.2.2 骨髓處理流程 臨床骨髓穿刺組織標(biāo)準(zhǔn)大小為長(zhǎng)約2 cm，直徑0.4 cm，使用柔軟透水性的顯微鏡擦鏡紙包裹骨髓穿刺組織后，進(jìn)行以下處理：(1)骨髓固定及預(yù)脫鈣：置AAF液30 min～2 h，根據(jù)骨髓組織硬度調(diào)整處理時(shí)間，標(biāo)準(zhǔn)大小的骨髓組織處理時(shí)間為1.5 h，散碎或較小骨髓組織處理時(shí)間為30 min～1 h，骨組織成分較多的骨髓組織處理時(shí)間可延長(zhǎng)至2 h，流水沖洗1min，去除殘留的AAF液后，轉(zhuǎn)入無(wú)水乙醇1 h，該步驟利用無(wú)水乙醇的中性脫水特點(diǎn)將AAF液處理后的骨髓組織進(jìn)一步脫水固定并且盡量保護(hù)骨髓中的造血系統(tǒng)細(xì)胞。(2)骨髓快速脫鈣：將經(jīng)過(guò)固定和預(yù)脫鈣處理后的骨髓組織轉(zhuǎn)入15%鹽酸10～40 min，期間需每10 min使用探針刺入骨髓組織，可輕松刺入即為脫鈣完全，標(biāo)準(zhǔn)大小的骨髓組織處理時(shí)間為30 min，散碎或較小組織時(shí)間多為10～15 min，并且需持續(xù)觀察，以免過(guò)度脫鈣而導(dǎo)致組織溶解為細(xì)胞液，骨組織成都較多骨髓組織處理時(shí)間可延長(zhǎng)至40 min，流水沖洗1 min，去除殘留的鹽酸溶液，該步驟將骨髓穿刺組織快速脫鈣完成。(3)骨髓脫鈣后平衡：將快速脫鈣后的骨髓組織轉(zhuǎn)入1%氨水10 min，1%氨水為弱堿性可持續(xù)提供OH-離子中和殘留的鹽酸H+離子，流水沖洗1 min。至此，骨髓組織處理完成，再經(jīng)脫水、浸蠟、包埋、制片、HE染色，或進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。

2 結(jié) 果

本科室采用本方法處理骨髓組織440例，處理期間觀察骨髓組織變?yōu)檩^透亮，探針可輕松刺入骨髓組織為脫鈣完成。在我科多數(shù)標(biāo)本可在3 h完成脫鈣處理，再經(jīng)脫水、浸蠟、包埋、制片、HE染色后，骨髓組織中各造血系統(tǒng)細(xì)胞染色鮮明、透亮，骨小梁脫鈣完全，結(jié)構(gòu)清楚，呈鮮艷紅色(圖1)，細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)對(duì)比度清晰(圖2)，免疫組織化學(xué)染色MPO(圖3)，免疫組織化學(xué)染色CD79α(圖4)。

圖1 骨髓組織中各造血系統(tǒng)(HE 10×4)

圖2 骨髓組織中造血細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)對(duì)比(HE 10×20)

圖3 骨髓組織免疫組化染（抗體標(biāo)記：MPO；HE 10×10）

圖4 骨髓組織免疫組化染(抗體標(biāo)記：CD79α；HE 10×20)

3 討 論

骨髓組織中骨小梁的無(wú)機(jī)鹽主要為磷酸鈣及碳酸鈣，質(zhì)地堅(jiān)硬，直接制片非常困難，且切片質(zhì)量較差。

目前，病理科骨髓組織制片有兩種方法：其一是塑料包埋直接切片法[1]，該方法采用合成塑料直接包埋骨髓后進(jìn)行切片、HE染色，雖省去脫鈣步驟，但存在以下缺點(diǎn)：包埋劑使用塑料為商品化產(chǎn)品價(jià)格較昂貴，含有毒性且制片時(shí)間較長(zhǎng)(5～7 d)[2-3]。包埋劑配制比例、塑料聚合時(shí)間，切片使用刀口、切片機(jī)性能，病理技術(shù)人員的技術(shù)要求，撈片、烘干等技術(shù)環(huán)節(jié)均有較高要求[4]。由于以上原因，本科室采用傳統(tǒng)的酸溶脫鈣法[5]進(jìn)行骨髓組織處理。

本方法首先采用AAF液對(duì)骨髓組織處理，AAF液中甲醛為組織固定劑，具有較強(qiáng)的穿透力，通過(guò)網(wǎng)格狀交聯(lián)蛋白質(zhì)分子而達(dá)到固定組織的作用，對(duì)組織收縮作用小且均勻，并能減少酸對(duì)組織的侵蝕[6]，可先將骨髓組織中的造血細(xì)胞，纖維結(jié)締成分進(jìn)行有效固定，保護(hù)組織及細(xì)胞形態(tài)。乙醇為良好的脫水劑，可起到脫水效果并兼具固定作用，骨髓組織中含有豐富的脂肪成分，乙醇可溶解該成分便于制片[7]。冰乙酸為弱酸，能夠溫和地持續(xù)提供H+，可以溶解骨髓中的鈣質(zhì)，在骨髓組織固定的過(guò)程中該成分起到脫鈣效果，從而減少脫鈣所用時(shí)間[7]。

本方法對(duì)骨髓組織脫鈣主要步驟為采用鹽酸進(jìn)行處理，鹽酸與硫酸和硝酸同為無(wú)機(jī)強(qiáng)酸，均能夠提供強(qiáng)H+來(lái)溶解骨小梁中鈣鹽。但后兩者缺陷[8]為：硫酸的酸根可與鈣離子形成難溶的硫酸鈣沉淀而使骨髓重新變硬。硝酸在溶解鈣鹽的同時(shí)可產(chǎn)生含氮化合物使組織蛋白質(zhì)變性形成黃蛋白反應(yīng)，且甲醛可被硝酸氧化變性而失去固定效果，同時(shí)降低硝酸濃度[9]。本方法中采用鹽酸濃度為15%(體積分?jǐn)?shù)：37.5%濃鹽酸15份+去離子水85份)，有文獻(xiàn)報(bào)道無(wú)機(jī)酸對(duì)骨髓組織細(xì)胞及免疫組織化學(xué)的影響關(guān)鍵在于酸與骨髓的作用時(shí)間，即時(shí)間越長(zhǎng)，組織損傷越大[10]。本科室在參考文獻(xiàn)經(jīng)驗(yàn)報(bào)道[11-12]及不斷試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，最終確定為15%鹽酸(體積分?jǐn)?shù))作用2 h內(nèi)效果最佳。

本方法最后采用1%氨水(體積分?jǐn)?shù))來(lái)浸泡脫鈣后骨髓組織，目的在于利用氨水的弱堿性可溫和地持續(xù)提供OH-來(lái)中和殘存的H+，且氨水極易洗脫而無(wú)殘留。有文獻(xiàn)報(bào)道，采用混合酸脫鈣及EDTA雙重脫鈣固定后進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色[13]。該方法中采用兩組脫鈣液：脫鈣液A(甲酸、甲醛、冰乙酸、濃鹽酸、氧化鋁、氯化鈉)作用3 h，沖洗1 h，脫鈣液B(EDTA，鹽酸)作用2 h來(lái)完成脫鈣程序，可獲得較好的免疫組化染色效果。本文方法與上述方法相比具有以下優(yōu)勢(shì)：(1)脫鈣液試劑種類少，本文方法脫鈣液僅兩種，以冰乙酸為預(yù)脫鈣，以15%鹽酸為主進(jìn)行快速脫鈣。上述方法中脫鈣液配制試劑種類達(dá)8種，且配置方法繁瑣；(2)脫鈣程序簡(jiǎn)便，時(shí)間短，本文方法脫鈣步驟僅為10～40 min即可完成，采用1%氨水處理脫鈣后骨髓組織，采用弱堿OH-離子迅速去除殘留H+。上述方法兩組脫鈣液需作用5 h，中間需沖洗1 h，總時(shí)間達(dá)6 h，時(shí)間多于本文方法。本文方法處理后的骨髓組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色能夠保證高質(zhì)量陽(yáng)性顯色，低背景著色，無(wú)非特異性顯色的特點(diǎn)。

本方法將組織固定和脫鈣兩個(gè)步驟有效的結(jié)合，所用時(shí)間為2～4 h，相較于劉增輝等[14]報(bào)道方法具有步驟簡(jiǎn)便，方法快速，所用試劑種類少，配制方便等優(yōu)點(diǎn)。

綜上所述，該方法是較為簡(jiǎn)便實(shí)用的骨髓組織快速處理方法，在病理科技術(shù)工作中需要細(xì)致用心地做好每個(gè)環(huán)節(jié)，認(rèn)真鉆研，不斷探索嘗試才能不斷提高效率，制作更高質(zhì)量的病理切片。

[1]中華醫(yī)學(xué)會(huì).臨床技術(shù)操作規(guī)范-病理學(xué)分冊(cè)[M].北京:人民軍醫(yī)出版社,2012:183-187.

[2]曹金伶,張淑英,陳杰,等.介紹一種骨髓活檢標(biāo)本塑料包埋劑的快速制片方法[J].診斷病理學(xué)雜志,2000,7(4):301-302.

[3]傅春燕,陳晨,周慶,等.介紹一種骨髓雜志脫鈣新方法[J].臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志,2003,19(6):664.

[4]李宏,陳曉慧.骨髓活檢應(yīng)用塑料包埋制片技術(shù)的體會(huì)[J].診斷病理學(xué)雜志,2001,8(2):115.

[5]羅燦嶠,莫木瓊,聶釗銘,等.四種脫鈣液對(duì)骨和骨髓組織及結(jié)構(gòu)影響的比較[J].中國(guó)組織工程研究,2015,19(37):5928-5932.

[6]繆勇建.介紹一種骨髓穿刺活檢的理想脫鈣劑劑其HE染色法[J].廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2008,25(2):311.

[7]甘啟煥,楊清緒,朱淑玲,等.骨髓活檢標(biāo)本脫鈣劑除酸方法的改良[J].診斷病理學(xué)雜志,2011,18(2):151.

[8]黃蓉飛,江亮,龍小藝,等.改良混合脫鈣液在骨髓活檢組織中的應(yīng)用[J].成都醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2014,9(6):719-721.

[9]甘啟煥,楊清緒,沈琴,等.提高骨髓石蠟切片質(zhì)量的幾點(diǎn)體會(huì)[J].臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志,2011,27(1):107-108.

[10]趙寶忠,張毅,劉志蘭.病理組織脫鈣液傳統(tǒng)組方的比較分析[J].臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志,2014,30(6):699-700.

[11]杜鵑,柳劍英,蘇靜.兩種組織脫鈣法對(duì)免疫組織化學(xué)染色影響比較[J].北京大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2011,43(2):290-294.

[12]朱小蘭,張威,駱新蘭,等.216例骨髓脫鈣時(shí)間的探討[J].臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志,2003,19(6):663-664.

[13]夏朝霞.改良骨髓脫鈣液對(duì)免疫組化染色結(jié)果的影響[J].現(xiàn)代實(shí)用醫(yī)學(xué),2014,26(8):1002-1003.

[14]劉增輝,李薇,趙津輝,等.骨髓活檢標(biāo)本石蠟包埋制片方法[J].中華病理學(xué)雜志,2003,32(5):475-476.

R446.8

B

1003—6350（2017）01—0157—03

2016-08-01)

四川省遂寧市市級(jí)科研項(xiàng)目（編號(hào)：2015s02）；四川省遂寧市中心醫(yī)院科研課題（編號(hào)：2015y02）

楊娜。E-mail：liulubb@126.com

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.01.053