韓威+王笑宇+吳越+王德才

[摘要] 目的 該文采用高效液相色譜技術(shù)，對急性缺血性卒中患者紅細胞膜磷脂含量分析，探討紅細胞膜磷脂水平在急性缺血性卒中發(fā)生、發(fā)展中的作用機制。方法 采用流行病學橫斷面調(diào)查方法，自2015年7—10月篩選病例組人群22例，健康對照組人群24名，分離紅細胞膜，用HPLC，XBP-Silica柱分離，測定兩組人群紅細胞膜磷脂含量，數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0統(tǒng)計學軟件分析。結(jié)果 5種磷脂中脂酰膽堿（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰絲氨酸（PS）3種磷脂病例組含量（0.3796±0.1387）、（0.4498±0.1786）、（0.3301±0.0327）與對照組（0.4897±0.0154）、（0.5523±0.0107）、（0.6351±0.0599）數(shù)值差異有統(tǒng)計學意義（P< 0.05），磷脂酰肌醇（PI）和神經(jīng)鞘磷脂（SM）差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。 結(jié)論 紅細胞膜磷脂水平參與影響了急性缺血性卒中的發(fā)生發(fā)展過程，可能是急性缺血性卒中發(fā)生發(fā)展的一個誘導機制。

[關(guān)鍵詞] 急性缺血性卒中；紅細胞膜；磷脂

[中圖分類號] R4 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-0742（2016）12（a）-0031-04

腦卒中是一種高發(fā)病率、高致殘率、高死亡率的疾病。而缺血性卒中在我國約占卒中總數(shù)的70%[1]。大量研究發(fā)現(xiàn)急性缺血性卒中患者存在紅細胞膜脂質(zhì)成分的改變，但對紅細胞膜磷脂含量的變化，結(jié)論不一。組成細胞膜的磷脂主要包括磷酯酰絲氨酸（PS）、磷脂酰膽堿（PC）、磷脂酰肌醇（PI）、磷脂酰乙醇胺（PE）、神經(jīng)鞘磷脂（SM）等，這些磷脂在血細胞膜上的含量遠遠大于血清中的含量。因此該文采用高效液相色譜（HPLC）技術(shù)高效液相色譜法自2015年7—10月對篩選病例組人群22例，健康對照組人群24名患者血清中 5 種磷脂磷脂含量水平分析，從而探討紅細胞膜磷脂水平與急性缺血性卒中的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑

高效液相色譜（Agilent 1260），超聲波清洗器（ KQ-100DB），超純水儀（Millipore美國），分析天平（AR1140，美國）。磷脂酰絲氨酸標準品（PS 90%） 、磷脂酰膽堿標準品（PC 98%） 、磷脂酰肌醇標準品（PI 98%） 、磷脂酰乙醇胺標準品（PE 98%）、神經(jīng)鞘磷脂標準品（SM 98%） 均購自瑞典Larodan 公司；乙腈、甲醇、磷酸、氯仿、己烷、異丙醇（ 天津市光復精細化工研究所） 。

1.2 調(diào)查對象收集與篩選

該研究對象來自黑龍江省林總醫(yī)院自2015年7—10月住院的急性缺血性卒中患者，年齡在60～75歲之間，共計22例（男12例/女10例），排除冠心病、糖尿病及其他具有精神疾病者等，作為病例組。對照組在哈爾濱第二福利醫(yī)院健康老年人中選取，年齡與病例組相匹配，共計24人（男12/女12）。所有研究對象均由本人或監(jiān)護人簽署知情倫理同意書，自愿參加和退出，自愿接受問卷調(diào)查和實驗室檢查。

1.3 紅細胞膜中磷脂的提取

取受試對象晨起空腹肘靜脈血，經(jīng)低溫離心、洗滌、沉淀等處理，獲得白色的紅細胞膜樣品。然后，取紅細胞膜懸浮液加入0.5 mL的提取液[氯仿-甲醇（體積比2：1）]，冰浴勻漿3 min。加入提取液4 mL，于30℃保溫30 min，以3 000 r/min離心5 min，取下層液過濾除蛋白。濾液加0.9%Nacl 0.4 mL，振搖1 min，以3 000 r/min離心5 min，棄上層液。加0.4 mL氯仿-甲醇-水（體積比8：4：3）振搖、靜置，以3 000 r/min離心5 min，棄上層液，氮氣吹干。殘渣用 2 mL 正己烷-異丙醇（3∶1） 溶解，經(jīng)有機濾膜過濾于樣品瓶，備用。

1.4 色譜條件

流動相為乙腈：甲醇：85%磷酸（體積比為100：10：1.8）。色譜分析柱以XBP-Silica （4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相檢測波長為203 nm，進樣量10 μL，柱溫25℃，流速1.5 μL/min。

1.5 樣品測定

取處理完成的紅細胞膜磷脂提取物，在上訴色譜條件下，取10 μL進樣分析，同時繪制標準曲線，采用外標法定量，相對保留時間定性。標準色譜圖和樣品圖見圖1。

1.6 統(tǒng)計方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，計量資料以均值±標準差（x±s）表示，組間資料比較采用ANOVA檢驗， P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 方法的質(zhì)量控制

2.1.1 線性范圍和檢出限 該文以外標方法進行定量分析，因此對方法的線性范圍和檢出限進行了試驗，以峰面積（x） 對磷脂濃度（y） 做線性回歸，按色譜峰的 3 倍信噪比（S/N） 計算各磷脂組分的檢測限（LOD），10倍（S/N） 信噪比確定定量限（LOQ），結(jié)果見表1。從表1可見，該方法線性關(guān)系良好。

2.1.2 重復性實驗 取高、中、低3種濃度的磷脂混合溶液，各濃度平行測定6次，計算精密度；在1 d內(nèi)重復進樣6次并連續(xù)進樣6 d。結(jié)果見表2，各磷脂的變異系數(shù)均小于1.99%，PI、PC、PS、PE、SM的日內(nèi)與日間變異均小于1.86%，該方法精密度良好。

1.2.3 準確度 取血清樣品 100 μL，加入 5 種磷脂混合標準溶液，分高、中、低 3 個濃度，考察方法準確度。結(jié)果回收率PI為82.06%～97.00%；PE為88.12%～104.36%；PC為90.39%～104.53%；PS為90.46%～99.17%；SM為86.57%～104.55%。顯出良好的準確性。

2.2 CVA組與對照組紅細胞膜磷脂水平

表3列出了病例組組與對照組紅細胞膜中5種磷脂的測定結(jié)果，從中可見磷酯酰絲氨酸（PS）、磷脂酰膽堿（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）的含量差異有統(tǒng)計學意義（PS：P<0.001、PC：P<0.01、PE：P<0.01）。五種磷脂的總含量（PL），相對于對照組，病例組明顯減少（P< 0.001），而紅細胞膜中磷脂酰肌醇（PI）和神經(jīng)鞘磷脂（SM）在病例組與對照組之間差異無統(tǒng)計學意義P>0.05。

為衡量脂質(zhì)過氧化程度，比較細胞膜成分變化，我們將甘油磷脂與神經(jīng)鞘磷脂做比率，結(jié)果如表4所示。PI/SM的比值在CVA組與病例組中差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；PC/SM在CVA組與病例組間差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）；PE/SM在CVA組與對照組間差異有統(tǒng)計學意義（P<0.001）；PS/SM在CVA與病例組之間差異有統(tǒng)計學意義（P <0.001），以上結(jié)果提示紅細胞處于高水平脂質(zhì)過氧化狀態(tài)。

3 討論

紅細胞膜的主體為磷脂排列的雙分子層的結(jié)構(gòu)，其中包含蛋白質(zhì)貫穿在細胞膜中，紅細胞膜的磷脂作為紅細胞的重要組成成分，其包括組成內(nèi)層的磷酯酰絲氨酸（PS）和磷脂酰乙醇胺（PE）和組成外層的磷脂酰膽堿（PC）和神經(jīng)鞘磷脂（SM）[2]。紅細胞膜磷脂中PS包含大量的二十二碳六烯和花生四烯酸[3]。在人類紅細胞膜中PS比PE、PC含有更多的PUFA[4]。磷脂富含大量PUFA易發(fā)生氧化應激，之前有研究報道過當紅細胞與叔丁基過氧化物反應SM相對于PC、PE、PS的組分增加，因此，每個甘油磷脂與SM的比率是一個很好的恒量過氧化程度指標。

PS通過甲基化可生成乙酰膽堿的前體物質(zhì)即磷脂酰膽堿，PS還可以調(diào)節(jié)細胞膜的流動性，并介導細胞膜受體與第二信使間的相互作用；Suzuki等[5]發(fā)現(xiàn)，PS具有促進乙酰膽堿的釋放的作用。PE在體內(nèi)不同的磷脂酶作用下，可水解成甘油、不飽和脂肪酸、膽堿和磷脂，這些成分在體內(nèi)有著非常重要的生物學作用。其中，膽堿在體內(nèi)生物酶的作用下與乙酰輔酶A反應生成乙酰膽堿，乙酰膽堿對于大腦記憶區(qū)膽堿能神經(jīng)元及神經(jīng)突觸的形成有關(guān)鍵性作用，可促進腦發(fā)育，提高記憶能力[6]。并且越來越多的研究表明腦卒中病的進程與炎癥相關(guān)，而脂類介質(zhì)在炎癥消退的過程中發(fā)揮了特殊的起動作用，如不飽和脂肪酸（PUFAs），其作為PE的水解產(chǎn)物可能是腦卒中病的保護因素。G-6-P酶具有較強的磷脂依賴性，其依賴于PE，參與許多糖代謝途徑。糖代謝異?；蛟S成為重要的急性缺血性腦卒中發(fā)病機制。有研究顯示，在急性缺血性腦卒中患者早期腦內(nèi)某些區(qū)域具有異常的葡萄糖代謝率及能量代謝障礙[7]。SM可以在神經(jīng)酶的作用下形成神經(jīng)酰胺，而近年來研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)酰胺的超量集聚或許與某些代謝綜合征有著緊密的聯(lián)系[8]。實驗結(jié)果顯示，病例組與對照組相比，紅細胞膜中PE/SM（×100）[HC=49.7±8.1，CVA=44.91±6.6]、PS/SM（×100）[HC=14.8±7.2，CVA=8.3±7.4]的比值有所降低，而PC/SM和PI/SM在病例組和對照組中之間差異無統(tǒng)計學意義（P> 0.05）。參照鄧華聰?shù)萚9]研究中細胞膜磷脂發(fā)生過氧化時PE/SM（×100）[HC=141.8±22.7，CVA=144.2±31.4]、PS/SM（×100）[HC=75.3±14.1，CVA=63.85±16.9]，該實驗中PE/SM、PS/SM遠遠小于上述數(shù)值，表明紅細胞處于較高水平的脂質(zhì)過氧化反應。ROS的過量產(chǎn)生會引發(fā)機體抗氧化失衡，使細胞膜受到氧化攻擊產(chǎn)生損傷，破壞細胞膜的完整性，最終導致細胞結(jié)構(gòu)和功能的改變。

綜上所述，急性缺血性卒中患者同對照組研究對象相比，磷脂水平明顯降低，甘油酰磷脂與神經(jīng)鞘磷脂的比值PE/SM、PS/SM在病例組與對照組有統(tǒng)計學差異，膜磷脂含量發(fā)生改變提示紅細胞膜磷脂的高水平過氧化反應。表明急性缺血性卒中患者磷脂水平可能在急性缺血性卒中的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，這可能作為腦卒中未來靶向治療研究的一個方向。

[參考文獻]

[1] 韓俊鋒.2009—2014年康健社區(qū)腦卒中危險因素分析[J].上海醫(yī)藥.2016（4）：48-50.

[2] 王少媛，張金蘭，張丹，等.鞘脂在肝臟疾病中的研究進展[J]. 藥學學報，2015，50（12）：1551-1558.

[3] 饒雪娥，林偉齡.磷脂酰絲氨酸的應用研究進展[J].海峽藥學，2015，27（11）：9-11.

[4] Oma S1， Mawatari S， Saito K，et al.Changes in Phospholipid Composition of Erythrocyte Membrane in Alzheimer's Disease[J].Dement Geriatr Cogn Dis Extra，2012，2（1）： 298-303.

[5] 王笑宇，吳越，唐思思，等. 阿爾茨海默病患者血清中5種磷脂的代謝水平[J]. 衛(wèi)生研究，2016，45（4）：677-680.

[6] Arora SS，Gooch JL，Garcia PS.Postoperative cognitive dysfunction，Cerebralvascular accident and anesthesia[J].Int J Neurosci，2014，124（4）：236-242.

[7] 買迪娜·吐爾遜，熱娜古麗·艾則孜，努爾買買提·艾買提，等.葡萄糖代謝異常與腦卒中病發(fā)病機制的研究進展[J].中華老年心腦血管病雜志，2014，16（11）：1224-1226.

[8] 師騰瑞，于衛(wèi)華，海春旭，等.活性氧調(diào)控細胞增殖的分子機制研究進展[J]. 癌變·畸變·突變，2015，27（6）：487-492.

[9] 鄧華聰，邱鴻鑫.糖尿病患者紅細胞膜磷脂成分的改變[J].中華內(nèi)分泌代謝雜志，1994，10（3）：145-147.

（收稿日期：2016-09-09）