舒成霖， 何 燕△， 曾志羽， 何 濤， 李金軼， 黃偉強， 許 鍵， 黃艷群

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 1老年心血管內(nèi)科， 2心電診斷科， 3心血管病研究所，廣西 南寧 530021)

擬交感效應(yīng)對快速起搏離體心臟心房縫隙連接蛋白43重構(gòu)的影響*

舒成霖1， 何 燕1△， 曾志羽1， 何 濤2， 李金軼3， 黃偉強3， 許 鍵1， 黃艷群1

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院1老年心血管內(nèi)科，2心電診斷科，3心血管病研究所，廣西 南寧 530021)

目的： 通過建立離體擬交感心房顫動模型，探討縫隙連接蛋白43(Cx43)水平的變化。方法: 15只雜種犬隨機分為3組(每組5只):對照組(control組)、快速心房起搏組(RAP組)和異丙腎上腺素灌流+快速心房起搏組(ISO+RAP組)。經(jīng)胸骨正中切開術(shù)，快速取出心臟，建立心臟Langendorff離體灌流模型。各組分別檢測心房有效不應(yīng)期(AERP)及房顫誘發(fā)率，免疫組化檢測酪氨酸羥化酶(TH)在細(xì)胞內(nèi)的表達，Western blot 檢測Cx43和磷酸化Cx43的蛋白含量，免疫熒光檢測Cx43在心肌組織的變化，TUNEL法檢測心肌細(xì)胞凋亡，熒光比色法檢測線粒體活性氧簇(ROS)的生成量。結(jié)果: 與control組比較，RAP組的AERP無明顯變化，且僅出現(xiàn)電紊亂， ISO+RAP組的AERP明顯縮短(P<0.05)，并可成功誘發(fā)房顫。與control組比較，RAP組和ISO+RAP組的TH表達量、細(xì)胞凋亡指數(shù)和線粒體ROS生成量均逐漸增多(P<0.05)，Cx43蛋白表達量和磷酸化水平逐漸減少(P<0.05)。免疫熒光顯示，與control組相比，RAP組的Cx43熒光強度降低，且呈明顯側(cè)鏈化，ISO+RAP組則呈點狀散在分布。結(jié)論: 交感神經(jīng)可能通過氧化應(yīng)激效應(yīng)，引起Cx43的重構(gòu)與下調(diào)，從而介導(dǎo)心房顫動的發(fā)生。

交感神經(jīng)； 縫隙連接蛋白 43； 心房顫動； 氧化應(yīng)激； 自噬

縫隙連接蛋白是維持細(xì)胞與細(xì)胞間連接與通信的結(jié)構(gòu)，它可以允許小分子如ATP、cAMP、IP3、葡萄糖等通過。在心臟中，縫隙連接蛋白介導(dǎo)心肌細(xì)胞之間的電偶聯(lián)，形成細(xì)胞通路，使引起同步收縮的電激動有序傳播[1]。其中，縫隙連接蛋白43(connexin 43，Cx43)在心肌中表達最豐富。心房顫動(atrial fibrillation，AF)是臨床上最常見的房性心律失常。自主神經(jīng)張力的改變和神經(jīng)重構(gòu)是房顫發(fā)生和維持的重要因素。研究表明交感神經(jīng)與房顫的發(fā)生密切相關(guān)[2]，但其內(nèi)在機制目前尚不十分明確。已有的臨床資料表明，房顫患者縫隙連接蛋白43表達量與正常對照組相比表達有升有降[3]。本研究旨在運用離體灌流技術(shù)，在脫離機體神經(jīng)體液影響的情況下，構(gòu)建擬交感房顫模型，并在此基礎(chǔ)上探討Cx43的變化情況。

材 料 和 方 法

1 實驗動物及主要試劑

實驗雜種幼犬15只，雌雄不分，體重在2～3 kg。異丙腎上腺素(isoprenaline, ISO)注射液、戊巴比妥鈉粉劑、肝素鈉注射液、改良臺氏液(北京索來寶)；分子探針H2DCF/DA(Sigma)；兔抗Cx43抗體(CST)；鼠抗Cx43單克隆抗體(Santa Cruz)；鼠抗磷酸化Cx43抗體(Chemicon)；兔抗酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase, TH)抗體(北京博奧森)。DF-5A電生理刺激儀、凋亡試劑盒(Roche)。

2 主要方法

2.1 實驗動物分組及模型構(gòu)建 動物雌雄不分，隨機分成3組，每組5只。對照(control)組將實驗犬以3%戊巴比妥鈉腹腔注射后麻醉，固定于手術(shù)臺上，行胸骨正中切開術(shù)，向左心室注射肝素8 000 U，快速將心臟連同肺一并取出，置于預(yù)冷臺氏液中修剪，分離心臟，擠出剩余血液，隨后將主動脈根部連接至心臟離體灌流儀，37 ℃下以改良臺氏液灌注心臟(250 r/min)，待心率恢復(fù)至100次/min左右后，分別于左、右心耳，心尖部放置針狀電極，連接電生理儀，刺激儀，記錄心電圖，持續(xù)灌流約1 h后留取心房組織；快速起搏(rapid atrium pacing，RAP)組：灌注方法同control組，僅在灌流時以頻率800次/min起搏30 s，共30次；ISO+RAP組：以含0.1 μmol/L異丙腎上腺素的改良臺氏液灌流心臟，余同RAP組。

2.2 電生理參數(shù)測量 心臟搏動穩(wěn)定后即行電生理參數(shù)檢測，以S1S2心臟程序期前刺激法檢測心房有效不應(yīng)期(atrial effective refractory period，AERP)，S1S2偶聯(lián)間期從基礎(chǔ)刺激周長300 ms開始，刺激比例為8∶1，10 ms步長遞減，脈寬2 ms，刺激強度為2倍的舒張閾值強度。直至不能奪獲心房的最長S1S2間期為AERP，重復(fù)3次，取平均值。記錄除對照組外房顫的誘發(fā)次數(shù)，誘發(fā)出的房顫定義為持續(xù)時間大于2 s的快速不規(guī)則心房電活動。

2.3 心房肌TH免疫組化染色和分析 取下部分左心房組織，快速置于4%甲醛固定24 h后包埋，常規(guī)石蠟切片，于60 ℃烤箱中烘烤2 h，經(jīng)二甲苯及乙醇脫蠟后于檸檬酸鹽緩沖鹽中高溫高壓修復(fù)3 min，以3% H2O2孵育10 min，PBS漂洗5 min×3次，滴加TH抗體(1∶300)，置于4 ℃孵育過夜。采用二步法行TH免疫組織化學(xué)染色(按試劑盒說明書操作)，光鏡下陽性為棕褐色。

2.4 Western blot檢測Cx43總蛋白和磷酸化蛋白的含量 將凍存左心房組織用液氮研磨，勻漿，加RIPA裂解液，再加入100 mg/L PMSF，提取總蛋白，用BCA法行蛋白濃度測定。按每泳道加總蛋白40 μg，在12%分離膠和5%濃縮膠上電泳后以100 mA×2 h濕轉(zhuǎn)將蛋白條帶轉(zhuǎn)至PVDF膜上。5%脫脂奶粉緩沖液室溫?fù)u動封閉1 h，分別加入小鼠單克隆抗Cx43抗體(1∶1 000)、小鼠抗磷酸化Cx43抗體(1∶1 000)和小鼠抗GAPDH單克隆抗體(1∶10 000)，4 ℃孵育過夜，室溫下加相應(yīng)Ⅱ抗(1∶10 000)孵育2 h，室溫下TBST溶液清洗蛋白膜15 min×3次，用增強化學(xué)發(fā)光法顯色，X光片曝光顯影。凝膠成像系統(tǒng)攝像分析。

2.5 免疫熒光測定Cx43 取左心房肌組織行常規(guī)石蠟縱向切片，脫蠟后于檸檬酸鹽緩沖鹽中高溫高壓修復(fù)3 min，10%血清封閉1 h，倒去血清，滴加Ⅰ抗Cx43(1∶50)于4 ℃孵育過夜；第2天將玻片用PBS漂洗后，以FITC標(biāo)記的熒光Ⅱ抗(1∶100)室溫避光孵育1 h，PBS漂洗后，DAPI染色，緩沖甘油封片。Olympus熒光顯微鏡下觀察切片，將數(shù)字化圖像儲存于計算機，待實驗結(jié)束后進行圖像分析。

2.6 TUNEL法檢測心肌細(xì)胞凋亡 參照凋亡試劑盒說明書進行實驗。光鏡下正常心肌細(xì)胞核呈藍綠色，凋亡細(xì)胞核呈棕褐色。每張切片與凋亡細(xì)胞分布區(qū)域各取3個高倍視野，計算出每100個細(xì)胞的凋亡細(xì)胞數(shù)，并以百分?jǐn)?shù)表示凋亡指數(shù)(apoptotic index，AI)。

2.7 熒光比色法測ROS的生成 各組心房肌組織在取下后1 h內(nèi)于冰上快速剪碎，采用碧云天公司線粒體提取試劑盒分離線粒體。隨后參照Korde等[4]的方法測定線粒體ROS。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析。計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析，各組均數(shù)間的兩兩比較采用Bonferroni校正的t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各組AERP的比較

Control組與RAP組的AERP差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性；與RAP組比較，ISO+RAP組的 AERP明顯縮短(P<0.05)，見圖1。

Figure 1.The comparison of AERP in each group. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsRAP group.

圖1 各組AERP的比較

2 各組房顫誘發(fā)率的比較

Control組與RAP組均無法誘發(fā)出房顫，RAP組僅出現(xiàn)短暫心房電紊亂現(xiàn)象。與RAP組比較， ISO+RAP組則可誘發(fā)出房顫(P<0.05)，各組間房顫的陽性誘發(fā)率比較見圖2。

3 各組TH免疫組化染色和分析

TH陽性為細(xì)胞核特異性著色，呈棕褐色。同control組相比，各組TH陽性逐漸增多，且ISO+RAP組明顯多于RAP組，見圖3。

4 Cx43的免疫熒光染色和Western blot 檢測結(jié)果

免疫熒光染色可見，control組的Cx43蛋白表達清楚，位于心肌閏盤處，主要呈端-端分布，條狀，少數(shù)呈點狀散在分布，心肌細(xì)胞側(cè)邊分布較少。RAP組Cx43熒光相對減弱，主要依心肌細(xì)胞長軸方向呈側(cè)-側(cè)分布，條狀，少數(shù)呈點狀散在分布。ISO+RAP組的Cx43表達明顯減少，呈點狀散在分布，見圖4。

Western blot檢測結(jié)果顯示，與control組相比，RAP組和ISO+RAP組的Cx43總蛋白及磷酸化Cx43蛋白的含量均降低，且呈逐漸下降趨勢，相鄰各組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖4。

5 各組心肌細(xì)胞凋亡的比較

TUNEL染色觀察可見，凋亡陽性心肌細(xì)胞核呈棕褐色，未凋亡細(xì)胞核呈深藍色。與control組相比，各干預(yù)組的AI值均明顯升高(P<0.01)，且由RAP組至ISO+RAP組呈逐漸增高的趨勢(P<0.01)，見圖5。

Figure 2.The positive induction rates of atrial fibrillation in each group. A: the ECG showed that atrial fibrillation was induced successfully (a) or just atrial electrical disorder appeared (b); B: the quantitative analysis of the atrial fibrillation rates. Mean±SD.n=5.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsRAP group.

圖2 各組房顫誘發(fā)率的比較

Figure 3.Detection of tyrosine hydroxylase (TH) by immunohistochemical staining in each group (×400). The positive staining showed as brown. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsRAP group.

圖3 各組TH免疫組化染色結(jié)果

Figure 4.The total protein expression of Cx43 and phosphorated protein level of Cx43 in each group. A: observation of the protein expression of Cx43 in the myocardial tissues under microscope with immunofluorescence staining (×200); B: determination of the total and phosphorylated proteins of Cx43 in the myocardial tissues by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsRAP group.

圖4 各組心肌細(xì)胞Cx43總蛋白及磷酸化Cx43蛋白水平的比較

Figure 5.Observation of apoptosis of the myocardial cells in each group by TUNEL staining (×400). Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsRAP group.

圖5 各組心肌細(xì)胞凋亡的TUNEL染色

6 各組ROS生成量的比較

與control組比較，各組ROS的生成量均明顯增加(P<0.05)，且ISO+RAP組生成量高于RAP組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖6。

Figure 6.The generation of ROS in each group. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsRAP group.

圖6 各組ROS生成量的比較

討 論

縫隙連接蛋白是構(gòu)成縫隙連接的基本結(jié)構(gòu)和功能的蛋白，每6個跨膜的蛋白亞基圍繞中央孔在相鄰細(xì)胞膜上排列形成一個連接子，進而構(gòu)成縫隙連接。Cx43是構(gòu)成哺乳動物心臟縫隙連接通道的主要蛋白。Cx43形成的縫隙連接通道的數(shù)目、大小、特征及互相連接的心肌細(xì)胞的幾何形狀保證了化學(xué)物質(zhì)和電沖動在相鄰心肌間的有效傳遞[5]。大量研究表明，Cx43的重構(gòu)和心律失常的發(fā)生密切相關(guān)[6]。心房顫動是臨床最常見的心律失常，自主神經(jīng)重構(gòu)與其發(fā)生機制密切相關(guān)。目前大多數(shù)房顫研究主要為在體實驗，離體實驗很少。在本研究中，我們成功構(gòu)建了擬交感房顫模型，并進一步探討了其可能的內(nèi)在機制。

我們發(fā)現(xiàn)，control組和RAP組AERP未發(fā)生明顯改變，而ISO+RAP組AERP則明顯縮短，同時，ISO+RAP組可以成功誘發(fā)出房顫。β-腎上腺素能受體的持續(xù)刺激是交感神經(jīng)活躍的標(biāo)志，ISO是人工合成非選擇性β-腎上腺素能受體激動劑，因此ISO可用于模擬交感神經(jīng)興奮狀態(tài)。TH是交感神經(jīng)特異性標(biāo)志物，TH陽性區(qū)域提示交感神經(jīng)分布[7]。研究中，control組、RAP組和ISO+RAP組的TH陽性呈逐漸遞增趨勢。這說明高頻起搏可一定程度興奮交感神經(jīng)，但在實驗所持續(xù)的時長里，其對心電活動影響不大。而交感神經(jīng)高度興奮后，可以明顯縮短AERP，并顯著促進交感神經(jīng)的增生，從而增加房顫的易感性。這也證實了交感神經(jīng)和房顫間的密切關(guān)系。

人體內(nèi)存在維持蛋白質(zhì)內(nèi)在穩(wěn)定性的機制，主要包括泛素化系統(tǒng)和自噬作用。對于低再生能力的細(xì)胞，則更需要這種機制來確保其蛋白質(zhì)的質(zhì)量。當(dāng)出現(xiàn)心功能不全或心臟處于某些應(yīng)激狀態(tài)(如氧化應(yīng)激，缺氧等)時，會激活閏盤處分布的自噬小體，進而引起Cx43的內(nèi)部化、側(cè)鏈化，甚至降解[8]。在我們的研究中，我們也發(fā)現(xiàn)，經(jīng)高頻起搏刺激后，胞膜Cx43的分布出現(xiàn)了明顯的側(cè)鏈化趨勢，且總蛋白含量略有下降。在熒光比色檢測活性氧族的實驗中，我們發(fā)現(xiàn)ISO所激發(fā)的交感神經(jīng)興奮狀態(tài)可加劇氧化應(yīng)激效應(yīng)。因此，在ISO+RAP組Cx43無論分布還是含量都出現(xiàn)了明顯的減少。另外，眾所周知，Cx43在經(jīng)過磷酸化后才能更好代表其功能狀態(tài)[9]，實驗中，我們也發(fā)現(xiàn)ISO+RAP組的磷酸化Cx43也出現(xiàn)明顯下調(diào)，這也更進一步說明了細(xì)胞之間的信號傳導(dǎo)受到了顯著影響。在細(xì)胞凋亡實驗中，我們也發(fā)現(xiàn)，control組，RAP組，ISO+RAP組的凋亡指數(shù)呈逐漸增高的趨勢。有研究者認(rèn)為在應(yīng)激狀態(tài)的早期Cx43的降解是一種保護性的反應(yīng)，這是為了防止細(xì)胞內(nèi)生成的有害物質(zhì)迅速傳播，從而使損傷局限化。但是隨著損傷的加劇和時間的延長，這種保護機制開始發(fā)揮相反的作用，會進一步加劇細(xì)胞的自噬作用，引起更多細(xì)胞凋亡，進而使心功能受損[10-11]。

在既往研究中，Cx43和房顫的關(guān)系一直存在一定爭議。Wetzel等[12]發(fā)現(xiàn)，Cx43的總含量在房顫病人中表達增高。嚴(yán)卉等[13]發(fā)現(xiàn)，房顫患者中的Cx43的表達量增加，但排列紊亂無規(guī)則。而最近的一些研究中，Shin等[14]通過構(gòu)建心肌肥厚模型，借助食道調(diào)搏儀誘發(fā)心房顫動，發(fā)現(xiàn)Cx43表達下降和側(cè)鏈化會增加房顫的易感性，Igarashi等[15]通過快速心房起搏建立房顫模型，發(fā)現(xiàn)房顫組Cx43表達降低，而以腺病毒轉(zhuǎn)染增加Cx43的表達后，可以減少房顫的發(fā)生。Cx43的重構(gòu)包括了Cx43的內(nèi)部化，側(cè)鏈化，乃至降解。而真正能夠發(fā)揮信號傳導(dǎo)作用的是位于閏盤處的縫隙連接蛋白，側(cè)鏈化的Cx43傳遞信號的功能大為減弱[3]。因此，部分研究中Cx43總含量增高，可能是由于發(fā)揮信號傳導(dǎo)功能的縫隙連接蛋白雖然減少，但側(cè)鏈化及內(nèi)部化增多，從而引起總含量增高。

綜上所述，我們認(rèn)為Cx43的重構(gòu)和降解與房顫的易感性密切相關(guān)，而交感神經(jīng)可能通過氧化應(yīng)激效應(yīng)，引起Cx43的重構(gòu)與下調(diào)，從而介導(dǎo)心房顫動的發(fā)生。

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(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Effects of sympathomimetic agent on remodeling of connexin 43 in atrium of isolated heart with rapid atrial pacing

SHU Cheng-lin1, HE Yan1, ZENG Zhi-yu1, HE Tao2, LI Jin-yi3, HUANG Wei-qiang3, XU Jian1, HUANG Yan-qun1

(1DepartmentofGeriatricCardiology,2DepartmentofElectrocardiogram,3DepartmentofCardiology,FirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China.E-mail:hyxjwxy@126.com)

AIM: To investigate the changes of connexin 43 (Cx43) via establishing a model of sympathomimetic atrial fibrillation (AF). METHODS: The mongrels (n=15) were randomly divided into control group, rapid atrial pacing (RAP) group and isoprenaline (ISO) perfusion+RAP group (ISO+RAP group). All mongrels’ hearts were taken out rapidly by median sternotomy to establish the cardiac model with Langendorff perfusioninvitro. The atrial effective refractory period (AERP) and AF inducability were tested. The expression and distribution of tyrosine hydroxylase (TH) were analyzed by immunohistochemistry. Total protein level of Cx43 and phosphorylation of Cx43 were determined by Western blot. The distribution of Cx43 were also observed by immunofluorescence staining. The cell apoptosis was analyzed by TUNEL staining. The generation of reactive oxygen species (ROS) in the mitochondria was measured by fluorescence spectrophotometry. RESULTS: No significant change of AERP was found between control group and RAP group, while that in ISO+RAP group was significantly decreased (P<0.05) and induced AF. Compared with control group, the expression of TH, apoptotic index and the generation of ROS increased gradually (P<0.05), while the content of Cx43 decreased gradually both in the total protein and the phosphorylation levels in RAP group and ISO+RAP group (P<0.05). The fluorescence intensity of Cx43 was also attenuated and Cx43 were lateralized apparently in RAP group, while Cx43 were characterized as punctate distribution in ISO+RAP group. CONCLUSION: Sympathetic nerves may activate autophagosome at intercalated discs and trigger cell apoptosis, resulting in remodeling and downregulation of Cx43 via oxidative stress, thus having effects on mediating and maintaining AF.

Sympathetic nerves; Connexin 43; Atrial fibrillation; Oxidative stress; Autophagy

1000- 4718(2017)02- 0215- 06

2016- 07- 28

2016- 11- 07

國家自然科學(xué)基金資助項目(No. 81260039)；廣西自然科學(xué)基金資助項目(No. 2013GXNSFAA278005)；第一批廣西醫(yī)學(xué)高層次骨干人才培養(yǎng)“139”計劃經(jīng)費

R541.7； R363

A

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