余磊磊+周京龍+高中南

摘要：建立白芨的再生體系和優(yōu)化抗性篩選的最佳條件，為野生白芨高效遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立奠定基礎(chǔ)。以野生白芨種子為外植體，研究野生白芨種子在萌發(fā)、愈傷組織誘導(dǎo)、叢生芽分化和增殖以及不定根誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基，并利用梯度篩選出其對(duì)卡那霉素（Kan）和氨芐青霉素（Amp） 的抗性。種子萌發(fā)最佳培養(yǎng)基為1/2MS+0.8 mg/L NAA+0.2 mg/L 6-BA+100 g/L 馬鈴薯；不定芽分化最佳培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+8 mg/L硝酸銀+50 g/L馬鈴薯，誘導(dǎo)率高達(dá)95%；誘導(dǎo)生根最佳培養(yǎng)基為1/2MS+0.8 mg/L NAA+0.2 mg/L 6-BA+100g/L 馬鈴薯。100 mg/L Kan和100 mg/L Amp為野生白芨遺傳轉(zhuǎn)化的最佳篩選壓；培養(yǎng)過程中添加外源有機(jī)物可以有效地促進(jìn)愈傷組織和不定芽的分化與增殖。建立了野生白芨種子的再生體系，發(fā)現(xiàn)了野生白芨種子的第3條發(fā)育途徑——愈傷組織分化途徑，并篩選出了適宜于野生白芨遺傳轉(zhuǎn)化體系的Kan和Amp篩選壓。

關(guān)鍵詞：白芨；愈傷組織分化途徑；再生體系；抗性篩選

中圖分類號(hào)：S567.23+9.043 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1002-1302（2017）01-0043-04

白芨為蘭科（Orchidaceae）白芨屬（Bletilla）多年生草本植物。因其花色和形狀等形態(tài)的不同，又被分為黃花白芨（B. ochracea）、華白芨（B. sinensis）、小白芨（B. formosana）和白芨（B. striata）4種[1]。在我國白芨主要分布于長江流域地區(qū)，其獨(dú)特的藥用價(jià)值，使其遭遇多年的掠奪式采挖，野生資源日益減少，瀕臨滅絕邊緣，現(xiàn)已被國家列為重點(diǎn)保護(hù)的野生藥用植物資源。白芨果莢內(nèi)種子多呈紡錘形，僅僅由幾個(gè)發(fā)育不完全的胚細(xì)胞構(gòu)成，無胚乳，無貯藏的營養(yǎng)物質(zhì)供給種子萌芽[2]，因而其在自然條件下萌發(fā)率極低。構(gòu)建其再生體系，可以初步有效解決育苗難題。白芨屬植物因其花色艷麗多彩，花型引人注目而具有較高觀賞價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，其地下假鱗莖中含有的白芨膠具有收斂止血、清熱解毒、消腫生肌之功效[3]，同時(shí)還具有較強(qiáng)的抗氧化和抗衰老作用，可用于保健、護(hù)膚及美容養(yǎng)顏等[4-5]。而野生白芨資源本身稀缺，加之含有的藥用成分白芨膠較少，野生采挖的白芨假鱗莖根本無法滿足目前的提取需求?，F(xiàn)有的研究大多集中在其再生體系的建立上，很少通過生物技術(shù)增加白芨膠的含量，因此要以白芨種子為基礎(chǔ)，篩選出葉芽對(duì)卡那霉素（Kan）、氨芐青霉素（Amp）的抗性臨界點(diǎn)，通過基因工程途徑構(gòu)建其遺傳轉(zhuǎn)化體系，培育白芨膠含量更高的白芨品種。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

白芨蒴果采自湖北神龍架林區(qū)，蒴果采期為花期結(jié)束后約120 d，蒴果未開裂且內(nèi)部白芨種子成熟。

1.2 蒴果消毒及種子萌芽

將果莢用自來水沖洗10 min，在超凈工作臺(tái)上先用75%乙醇消毒30 s，再用4%次氯酸鈉溶液浸泡10 min，消毒期間不停地翻動(dòng)果莢，使其消毒徹底，無菌水漂洗3次，然后用無菌濾紙吸干果莢表面的水分待用。在無菌條件下剖開蒴果，將種子均勻地抖落到培養(yǎng)基表面。本實(shí)驗(yàn)室篩選的白芨種子萌芽培養(yǎng)基：1/2MS+0.8 mg/L NAA+0.2 mg/L 6-BA（pH值5.8），然后置于溫度為（25±2） ℃的恒溫培養(yǎng)室中培養(yǎng)[6]，前2周為暗培養(yǎng)，2周之后轉(zhuǎn)為光暗交替培養(yǎng)，光照度為2 000～2 500 lx，光—暗周期14 h—10 h。

1.3 白芨愈傷組織的誘導(dǎo)

愈傷組織的形成有2種方式，一是在種子萌發(fā)培養(yǎng)基中，有部分種胚直接發(fā)育形成愈傷組織。二是將培養(yǎng)60 d的野生白芨的無菌幼苗切去根部和子葉，留下原球莖或者根狀莖，切成0.3～0.5 cm2 小塊，用不同質(zhì)量濃度的細(xì)胞分裂素6-BA與生長素NAA組合誘導(dǎo)形成愈傷組織，愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基在預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)如下：（1） 1/2MS+0.8 mg/L NAA+0.2 mg/L 6-BA+2 mg/L硝酸銀+50 g/L馬鈴薯；（2） 1/2MS+0.8 mg/L NAA+0.2 mg/L 6-BA+4 mg/L硝酸銀+50 g/L馬鈴薯；（3）1/2MS+0.8 mg/L NAA+0.2 mg/L 6-BA+6 mg/L硝酸銀+100 g/L馬鈴薯；（4）1/2MS+0.8 mg/L NAA+0.2 mg/L 6-BA+8 mg/L硝酸銀+100 g/L馬鈴薯；所有培養(yǎng)基的pH值均為5.8，愈傷組織的誘導(dǎo)在黑暗條件下進(jìn)行。

1.4 白芨不定芽的分化誘導(dǎo)

當(dāng)愈傷組織長到約1 cm3左右，可進(jìn)行叢生芽的誘導(dǎo)。叢生芽的誘導(dǎo)培養(yǎng)基在預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)如下：（1）MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA；（2）MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+4 mg/L硝酸銀；（3）MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+8 mg/L硝酸銀；（4）MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+12 mg/L硝酸銀；（5）MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+8 mg/L硝酸銀+50 g/L馬鈴薯；（6）MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+8 mg/L硝酸銀+100 g/L馬鈴薯；（7）MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+8 mg/L硝酸銀+200 g/L馬鈴薯；所有培養(yǎng)基的pH值均為5.8，不定芽的分化誘導(dǎo)在光照條件下進(jìn)行，光照度為2 000～2 500 lx。

1.5 白芨的生根培養(yǎng)

待叢生芽長到2～3 cm 時(shí)切下，放置在下列培養(yǎng)基進(jìn)行生根誘導(dǎo)：（1）1/2MS+2.0 mg/L NAA；（2）1/2MS+1.5 mg/L NAA；（3）1/2MS+1.0 mg/L NAA；（4）1/2MS+0.5 mg/L NAA+0.1 mg/L 6-BA；（5）1/2MS+0.5 mg/L NAA+50 g/L 馬鈴薯；（6）1/2MS+0.5 mg/L NAA+100 g/L 馬鈴薯；共6種不同的培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)生根，所有培養(yǎng)基的pH值均為58。在光暗交替下進(jìn)行誘導(dǎo)生根，光照度為2 000～2 500 lx，光—暗周期14 h—10 h。

1.6 培養(yǎng)條件的優(yōu)化

由于野生白芨種子為不完全結(jié)構(gòu)，其種子中僅有胚，而不含有胚乳，且種子表面被1層透明的種皮包被，使得外源營養(yǎng)物質(zhì)很難進(jìn)入到種皮內(nèi)，因此對(duì)于幾乎沒有營養(yǎng)物質(zhì)貯藏的野生白芨種子來說，添加其他物質(zhì)于培養(yǎng)基中就可能會(huì)有助于其愈傷組織的分化增殖和防止褐化現(xiàn)象。本試驗(yàn)以最佳芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為基礎(chǔ)添加以下物質(zhì)，外源有機(jī)物馬鈴薯過濾液：10、50、100 g/L；硝酸銀：4、6、8、10 mg/L；活性炭0.8 g/L。

1.7 野生白芨對(duì)抗生素敏感性的測定

將白芨愈傷組織切成 0.5 cm3左右的小塊，分別放置到不同濃度氨芐青霉素（Amp）和卡那霉素（Kan）的再生培養(yǎng)基1/2MS+3% Surcose+0.3% Phytagel+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+100 g/L馬鈴薯上，觀察不同濃度的Amp和Kan對(duì)白芨愈傷組織誘導(dǎo)和分化的影響，以確定最優(yōu)的篩選壓，篩選出適宜的濃度用于遺傳轉(zhuǎn)化。Amp的濃度梯度為0、20、50、100、150 mg/L，Kan的濃度梯度為0、25、50、75、100、125、150 mg/L，培養(yǎng)30 d 后統(tǒng)計(jì)篩選的效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子的有胚率分析

成熟野生白芨的果莢顏色為黃褐色，野生白芨種子的結(jié)構(gòu)，多呈紡錘形，由1層透明的種皮和乳白色的胚組成，且無胚乳，幾乎沒有營養(yǎng)物質(zhì)的貯藏[6]，有些種子顯微鏡下觀察還可以發(fā)現(xiàn)其殘留的胚柄，而且經(jīng)試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)有一些種子只有種皮而沒有胚，這是因?yàn)椴勺陨颀埣芰謪^(qū)的的野生白芨果莢未完全成熟所致，這與張建霞等報(bào)道的白芨種子的胚齡為20 周（140 d）后，胚基本停止發(fā)育，有胚率不再明顯提高，而胚的成熟度達(dá)到最佳[7]基本一致。在組織培養(yǎng)條件下培養(yǎng)7 d后，含有胚的種子會(huì)逐漸膨大且轉(zhuǎn)為綠色。顯微觀察和統(tǒng)計(jì)結(jié)果（表1）表明，本次試驗(yàn)所用野生白芨種子的有胚率為57.5%。

2.2 野生白芨種子發(fā)育情況分析

白芨種胚如圖1所示，主要以2種途徑發(fā)育成小苗，第1種是種胚轉(zhuǎn)綠膨大形成小球體，進(jìn)而發(fā)育成原球莖；第2種是種胚膨大形成小球體，小球體先形成根狀莖，然后頂端逐漸轉(zhuǎn)綠分化出芽， 形成葉片[8]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)野生白芨種胚在培養(yǎng)基上，還存在除了張燕等報(bào)道的2種主要的發(fā)育途徑[5]以外的第3種次要發(fā)育途徑：由種胚直接發(fā)育為淡綠色的愈傷組織，而后不斷增殖，發(fā)育為叢生芽，進(jìn)而生長成完整植株。試驗(yàn)初步推測愈傷組織發(fā)育途徑可能與培養(yǎng)基中的外源添加有機(jī)物和種子的呼吸作用有關(guān)，其發(fā)生機(jī)理有待進(jìn)一步研究。對(duì)所有試驗(yàn)中種胚的發(fā)生情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，在基本培養(yǎng)基相同且馬鈴薯的含量都為100 g/L的情況下，當(dāng)硝酸銀的含量為6、8 mg/L時(shí)，種胚的愈傷組織為濃綠色（圖2），其愈傷組織發(fā)育率分別為26.0%和22.8%（表1），表明6 mg/L的硝酸銀是種胚愈傷組織發(fā)育的最佳含量，且當(dāng)硝酸銀含量在6 mg/L以下時(shí)，其種胚的愈傷組織發(fā)育率與硝酸銀的含量呈正相關(guān)。由表1可知種胚的愈傷組織發(fā)育率和馬鈴薯的含量呈正相關(guān)。

2.3 不同激素濃度對(duì)野生白芨叢生芽的誘導(dǎo)

試驗(yàn)結(jié)果（表2）表明不定芽的誘導(dǎo)率最高的培養(yǎng)基為A3培養(yǎng)基（MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+ 8 mg/L 硝酸銀+50 g/L馬鈴薯），其誘導(dǎo)率高達(dá)95%，增殖系數(shù)為324，誘導(dǎo)的叢生芽較多，呈濃綠色，較粗壯，但生長緩慢，有褐化現(xiàn)象出現(xiàn)。而A4培養(yǎng)基（MS+1.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+10 mg/L硝酸銀+100 g/L馬鈴薯）中不定芽的誘導(dǎo)率為85%，叢生芽增殖系數(shù)最高，為6.03，誘導(dǎo)的叢生芽，多為青綠色，生長較快且很粗壯，較少有玻璃化現(xiàn)象出現(xiàn)（圖3）。A1培養(yǎng)基（MS+0.2 mg/L 6-BA+1.5mg/L NAA+4 mg/L硝酸銀+50 g/L馬鈴薯）和A2培養(yǎng)基（MS+0.5mg/L 6-BA+1 mg/L NAA+6 mg/L硝酸銀+100 g/L馬鈴薯）的分化效率和增殖系數(shù)較低，誘導(dǎo)率分別為22.5%和67.5%，增殖系數(shù)分別為2.12和3.11，且玻璃化現(xiàn)象和褐化現(xiàn)象嚴(yán)重。統(tǒng)計(jì)分析可知，A4培養(yǎng)基雖然叢生芽誘導(dǎo)率未達(dá)到最高，為85%，但其增殖系數(shù)高達(dá)6.03，可有效誘導(dǎo)葉芽分化和增殖，能更好地滿足植物基因工程研究的需要。

在野生白芨無菌苗的根狀莖上進(jìn)行間接愈傷組織誘導(dǎo)發(fā)現(xiàn)，青綠色的愈傷組織質(zhì)地較緊密，可誘導(dǎo)分化出粗壯的叢生芽， 且分化效率更高（圖4）。由表2數(shù)據(jù)分析可知，愈傷組織的分化誘導(dǎo)率和叢生芽的增殖系數(shù)與NAA的濃度、6-BA/NAA的濃度配比以及外源有機(jī)物馬鈴薯的含量呈正相關(guān)，在硝酸銀濃度不超過8 mg/L時(shí)，愈傷組織的分化誘導(dǎo)率和叢生芽的增殖系數(shù)會(huì)隨著其濃度的增加而提高，但當(dāng)硝酸銀的濃度為10 mg/L時(shí)，其愈傷組織的分化誘導(dǎo)率出現(xiàn)下降，說明過高的硝酸銀濃度不利于其愈傷組織的誘導(dǎo)分化。外源有機(jī)物可以有效提高其叢生芽的增殖系數(shù)，有利于芽的生長[9]。

2.4 不定根的誘導(dǎo)

不定根的誘導(dǎo)對(duì)于植株再生體系的建立至關(guān)重要[10]，在本研究中采用的4種生根培養(yǎng)基中，B4培養(yǎng)基（1/2MS+0.8 mg/L NAA+0.2 mg/L 6-BA+100 g/L 馬鈴薯）為最佳誘導(dǎo)生根培養(yǎng)基，其不定根誘導(dǎo)率高達(dá)97.5%，不定根發(fā)生密集，生長速度快且粗壯，為白色或者綠色（圖5）。B1培養(yǎng)基（1/2MS+1.0 mg/L NAA+50 g/L 馬鈴薯）的誘導(dǎo)率較高，為85%，但其不定根的發(fā)生量較少。其他2種培養(yǎng)基B2和B3也能有效誘導(dǎo)不定根的分化，但也存在不定根較瘦弱的不足。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，NAA可以有效促進(jìn)不定根的誘導(dǎo)和分化，對(duì)不定根的生長有著決定性的作用，而細(xì)胞分裂6-BA會(huì)極大抑制不定根的發(fā)生。而添加了馬鈴薯的培養(yǎng)基中不定根生長更為健壯，且生長速度更快，說明馬鈴薯可以提高不定根的誘導(dǎo)效率（表3）。

2.5 Kan 和Amp 抗性濃度的篩選

將葉芽分別置于含有不同濃度Kan和Amp的MS+05 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA+100 g/L馬鈴薯培養(yǎng)基上培養(yǎng)40 d 后觀察致死率（圖6、圖7），葉芽的致死率與Amp和Kan的濃度都成反比，當(dāng)Amp濃度為20 mg/L，其致死率僅為122%， 分化率高達(dá) 87.8%； 當(dāng)Amp濃度增加到 150 mg/L時(shí)，其致死率高達(dá)99.2%，分化率僅為0.6%（表4）。綜合試驗(yàn)的其他因素考慮，100 mg/L的Amp和100 mg/L的Kan是最佳的抗性濃度。

3 討論

野生白芨為蘭科植物，其種子發(fā)育不完整，且種子表面包被1層種皮，對(duì)于僅有種胚的種子的發(fā)芽是極大的障礙，這也使得野生白芨種子很難在自然條件下發(fā)芽。而合適的培養(yǎng)基和培養(yǎng)環(huán)境便成了其萌發(fā)的關(guān)鍵。在本試驗(yàn)采用的培養(yǎng)基中，發(fā)現(xiàn)了野生白芨種胚發(fā)生的第3條途徑——愈傷組織途徑。對(duì)于野生白芨種胚直接從種子發(fā)育成愈傷組織的現(xiàn)象，初步猜想可能是以下原因造成的：（1）種子的不完全胚被種皮限制，種胚無法進(jìn)行正常生長；（2）由于采收的種子中種胚的發(fā)育程度和成熟度不一致，導(dǎo)致部分種子不能提供種胚正常發(fā)育的營養(yǎng)物質(zhì)。這也正好可以解釋白芨在野外自然條件下萌發(fā)率不足萬分之一，但是其愈傷組織途徑的發(fā)生機(jī)理還有待更進(jìn)一步的研究。

蘭科植物的整個(gè)生活史中均有共生菌參與其中，這種生長的特異性也使得蘭科植物組織培養(yǎng)過程的各個(gè)階段都需要外源有機(jī)物。在野生白芨的再生體系中，馬鈴薯過濾液對(duì)野生白芨種子再生體系各個(gè)階段的生長都有著極大的促進(jìn)作用，在培養(yǎng)基中添加100 g/L的馬鈴薯過濾液等外源有機(jī)物和硝酸銀等可以極大促進(jìn)愈傷組織的分化和叢生芽的增殖，從而為野生白芨的再生體系建立更為優(yōu)越的條件。

在本研究中成功篩選出野生白芨的葉芽對(duì) Kan和Amp 抗性的濃度分別為100 mg/L 和100 mg/L。本研究結(jié)果為野生白芨應(yīng)用于植物基因工程，尤其是為培育白芨膠含量更高的優(yōu)質(zhì)白芨品種提供了參考。

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