朱 勇，應(yīng) 杰，孫亞米，周麗絨

（1.農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室（寧波），浙江寧波 315040；2.寧波市鄞江中學(xué)，浙江寧波 315040）

紫外分光光度法檢測香椿中硝酸鹽方法研究

朱 勇1，應(yīng) 杰2，孫亞米1，周麗絨1

（1.農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室（寧波），浙江寧波 315040；2.寧波市鄞江中學(xué)，浙江寧波 315040）

食品、農(nóng)產(chǎn)品中檢測硝酸鹽含量采用的標(biāo)準(zhǔn)方法各有特點，基于香椿本身較高的亞硝酸鹽含量會給采用NY/T 1279-2007檢測硝酸鹽帶來影響，且硝酸根離子和亞硝酸根離子在紫外區(qū)219 nm處具有等吸收波長特性的原因，通過亞硝酸根對硝酸根標(biāo)液干擾程度的研究，提出采用標(biāo)準(zhǔn)加入法或在硝酸根標(biāo)液中加入一定量的亞硝酸根溶液模擬樣品狀態(tài)的方法來消除這一干擾，既達(dá)到簡單便捷的目的，又確保了香椿數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。

香椿；硝酸鹽；亞硝酸鹽；紫外分光光度法

香椿（Toona sinensis）原產(chǎn)于中國，分布于長江南北的廣泛地區(qū)，具有較高的營養(yǎng)價值。但隨著深入研究發(fā)現(xiàn)，香椿中亞硝酸鹽含量較高，從1.433～1 048 mg·kg-1［1-3］不等，遠(yuǎn)超GB 2762-2012《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中污染物限量》對亞硝酸鹽在蔬菜及其制品腌制蔬菜的限量規(guī)定（20 mg·kg-1以NaNO2計），香椿這一特性在新鮮蔬菜樣品中屬于較為特殊的情況，使得檢測香椿中硝酸鹽的含量需關(guān)注這一特殊現(xiàn)象。目前檢測食品、蔬菜、水果中硝酸鹽的標(biāo)準(zhǔn)方法主要有GB 5009.33-2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》和NY/T 1279-2007《蔬菜、水果中硝酸鹽的測定紫外分光光度法》。GB 5009.33-2010采用離子色譜法能很好地分離硝酸鹽與亞硝酸鹽，使二者不受干擾，但儀器較為昂貴，不是所有實驗室都有；第二種檢測方法常用分光光度法，適合大部分實驗室，缺點是硝酸鹽的測定采用鎘柱還原法，還原成亞硝酸鹽后，測定亞硝酸鹽值來計算硝酸鹽的含量，試驗過程煩瑣，周期長，需要具備一定的經(jīng)驗；而NY/T 1279-2007利用紫外分光光度法測定新鮮蔬菜及水果中硝酸鹽含量過程簡單，操作方便。水果、蔬菜樣品在去除色素、蛋白質(zhì)及其他干擾物質(zhì)的基礎(chǔ)上，利用硝酸根離子和亞硝酸根離子在紫外區(qū)219 nm處具有等吸收波長的特性，測定其吸光度，其測得結(jié)果為硝酸鹽和亞硝酸鹽吸光度的總和。鑒于新鮮蔬菜、水果中亞硝酸鹽含量甚微，可忽略不計，測定結(jié)果為硝酸鹽的吸光度［4］。此法適用于大部分蔬菜水果，但香椿樣品由于自身的亞硝酸鹽含量的特殊性，采用NY/T 1279-2007方法，亞硝酸的含量對硝酸鹽測定結(jié)果的影響程度還需進(jìn)一步探討。

1 材料與方法

1.1 儀器及試劑

BlueStar B紫外可見分光光度計（北京萊伯泰科儀器有限公司）；ICS-2100離子色譜（美國賽默飛世爾科技公司）；723N分光光度計（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；M illi-QADVA10超純水儀（美國M illipore公司）。

水中亞硝酸鹽氮成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為GBW（E）080223，以亞硝酸根計329 mg·L-1；水中硝酸根成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為GBW（E）080264，以硝酸根計1 000 mg·L-1，國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心。

1.2 前處理方法

1.2.1 離子色譜法

5 g勻漿香椿樣品，以80 m L水洗入100 m L容量瓶中，超聲提取30 min，75℃水浴中放置5 m in，取出放置室溫，加水稀釋至刻度，搖勻后濾紙過濾，取部分溶液于10 000 r·min-1離心15 min，上清液過OnGuardⅡRP柱凈化后待進(jìn)樣。

1.2.2 分光光度法

5 g勻漿香椿樣品，置于50 m L燒杯中，加12.5 m L飽和硼砂溶液，以70℃左右的水約300 m L洗入500 m L容量瓶中，于沸水浴中加熱15 min，取出置冷水浴中放置至室溫，在振蕩上述提取液時加入5 m L亞鐵氰化鉀溶液（106 g· L-1），搖勻，再加入5 mL乙酸鋅溶液（220 g· L-1），加水定容，搖勻，放置30 min后，用濾紙過濾。吸取40.0 m L濾液，置于50 m L帶塞比色管中，加入2 m L對氨基苯磺酸（4 g·L-1），靜置5 m in，加入1 m L鹽酸萘乙二胺（2 g·L-1），加水至刻度，混勻，靜置15 min，上機(jī)比色。

硝酸鹽測定采用鎘柱還原。先以25 mL稀氨緩沖液沖洗鎘柱，流速控制在3～5 m L·min-1，吸取20 m L濾液于50 m L燒杯中，加5 m L氨緩沖溶液混合，注入鎘柱還原，以原燒杯收集流出液，當(dāng)貯液漏斗中的樣液流盡后，再加5 m L水置換柱內(nèi)留存的樣液，將全部收集液如前再經(jīng)鎘柱還原1次，第2次流出液收集于100 m L容量瓶中，繼以水流經(jīng)鎘柱洗滌3次，每次20 mL，洗液一并收集于同一容量瓶中，加水至刻度，混勻取10 mL還原后的樣液于50 m L比色管中，按亞硝酸鹽比色法進(jìn)行操作比色。

1.2.3 紫外分光光度法

取10 g勻漿香椿樣品于100 m L燒杯中，用100 m L水分次將樣品轉(zhuǎn)移到250 m L容量瓶中，加入5 m L氨緩沖溶液，2 g粉末狀活性炭，在可調(diào)式往返振蕩器上（200次·min-1）振蕩30 min，加入亞鐵氰化鉀溶液（150 g·L-1）和硫酸鋅溶液（300 g·L-1）各2 m L，混合后加水定容至250 m L，搖勻放置5 min，過濾，取2 m L濾液于50 m L容量瓶內(nèi)加水定容，比色。

1.3 儀器條件

離子色譜條件為Dionex IonPac AS11-HC離子色譜柱（4 mm×250 mm），流動相A為氫氧化鉀溶液，梯度洗脫條件為6 mmol·L-130 min，70 mmol·L-15 min，6 mmol·L-15 m in，流速1.0 m L·m in-1，進(jìn)樣量25μL，柱溫30℃，電導(dǎo)檢測器檢測池溫度為35℃。分光光度計條件為1 cm比色杯，波長538 nm。紫外分光光度計條件為1 cm石英比色皿，波長219 nm。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.4.1 離子色譜法

移取亞硝酸鹽和硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液，加水稀釋，制成系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，含亞硝酸根離子濃度為0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg·L-1；含硝酸根離子濃度為0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mg·L-1。用離子色譜儀分析，以濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.2 分光光度法

移取亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液，加水稀釋，制成系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，含亞硝酸根離子濃度為0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.15、0.20、0.25 mg·L-1。用分光光度計分析，以濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.3 紫外分光光度法

移取硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液，加水稀釋，制成系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，含硝酸根離子濃度為0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 mg·L-1。用紫外分光光度計分析，以濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 亞硝酸根對硝酸根標(biāo)準(zhǔn)溶液的影響

考慮到個別香椿中亞硝酸根的含量能高至1 048 mg·kg-1，參照NY/T 1279-2007的處理方式，無法消除亞硝酸根，在用紫外分光光度計檢測硝酸根的同時，也有不同濃度的亞硝酸根干擾。模擬樣品中各濃度亞硝酸鹽（以亞硝酸鈉計）經(jīng)過前處理后殘留在比色溶液中的濃度，模擬試劑采用標(biāo)準(zhǔn)溶液精準(zhǔn)配制。隨著亞硝酸根濃度的提高，吸光度均有不同的增加。

從表1可知，雖然亞硝酸根對硝酸根的吸光度有正向干擾，但從各自標(biāo)線的相關(guān)系數(shù)線性關(guān)系來考量，相關(guān)系數(shù)符合試驗要求。曲線整體抬升，硝酸根的吸光度收到干擾，斜率改變。雖然硝酸根、亞硝酸根是等吸收波長，但不完全是等濃度吸收。這同李祥的研究相符［6］。

表1 不同濃度亞硝酸根對硝酸根標(biāo)準(zhǔn)曲線的干擾

將沒有亞硝酸鹽影響的標(biāo)準(zhǔn)曲線吸光度值分別代入受影響的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出樣品含亞硝酸鹽4、10 mg·kg-1影響時的待進(jìn)樣溶液中硝酸根濃度，同沒有影響時的值比較相對相差。

表2表明，當(dāng)樣品中含亞硝酸鹽含量在4 mg· kg-1時，相對相差均小于5%，符合NY/T 1279-2007的精密度要求；而當(dāng)樣品中亞硝酸鹽含量在10 mg· kg-1時，相對相差均大于5%，不符合標(biāo)準(zhǔn)要求。樣品中亞硝酸鹽含量越高，硝酸鹽偏離正確值就越遠(yuǎn)。鑒于新鮮蔬菜、水果中亞硝酸鹽含量甚微［4］，目前新鮮蔬菜中的亞硝酸鹽限量已取消，GB 2762-2005《食品中污染物限量》（已作廢）將蔬菜中亞硝酸鹽限量設(shè)定在4 mg·kg-1。所以除香椿以外的絕大部分新鮮蔬菜、水果樣品中亞硝酸鹽含量均會小于4 mg· kg-1，對硝酸鹽測定帶來的影響可以忽略，同時也驗證了NY/T 1279-2007的原理部分。

表2 不同濃度亞硝酸根對硝酸根干擾后含量的準(zhǔn)確度

2.2 方法的前處理比較

GB 5009.33-2010的2個方法及NY/T 1279-2007均對樣品的前處理做出各自規(guī)定，詳見1.2部分。3個方法采用不同方式加入不同試劑，花費不同時間對樣品進(jìn)行硝酸根、亞硝酸根提取。以此為依據(jù)，將香椿樣品采用這3個方法進(jìn)行前處理，再分別用離子色譜、分光光度計、紫外分光光度計進(jìn)行樣液檢測。由于紫外分光光度計法只是測試硝酸根的含量，故沒有亞硝酸根的數(shù)據(jù)。

由表3可知，不同前處理方法所測得的亞硝酸根數(shù)據(jù)、硝酸根數(shù)據(jù)相對相差均小于5%，達(dá)到GB 5009.33-2010、NY/T 1279-2007所規(guī)定的精密度要求。由此完全可以選擇適合本實驗室的3個方法的前處理方式中任一個，以最便捷的方式、最適合本實驗室人員操作習(xí)慣來完成試驗，香椿樣品的結(jié)果不受前處理方法的影響。

表3 采用不同標(biāo)準(zhǔn)試驗結(jié)果mg·kg-1

2.3 香椿樣品中亞硝酸根對硝酸根的影響

依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)對香椿樣品進(jìn)行前處理及上機(jī)檢測，離子色譜法、分光光度法分別測得亞硝酸根、硝酸根濃度。由表4可知，采用紫外分光光度計法考慮到亞硝酸鹽對硝酸鹽的干擾，將處理液分為3種方式進(jìn)行上機(jī)檢測。1）直接上機(jī)測定。2）采用標(biāo)準(zhǔn)加入法測定。將1 000 mg·L-1硝酸根標(biāo)準(zhǔn)溶液吸取一定量，用樣液定容至50 m L，配成含標(biāo)準(zhǔn)溶液硝酸根離子濃度為0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 mg·L-1系列，求得標(biāo)準(zhǔn)曲線后計算硝酸根含量。3）根據(jù)離子色譜法、分光光度法測得的香椿亞硝酸根均值含量156 mg·kg-1，經(jīng)前處理，硝酸鹽待測液中含亞硝酸根0.248 mg·L-1，配制硝酸根標(biāo)準(zhǔn)溶液時，所有標(biāo)液中用移液槍均加入亞硝酸根標(biāo)液0.037 7 m L，模擬樣液的基體，配成的硝酸根系列標(biāo)液均含0.248 mg·L-1的亞硝酸根。直接上機(jī)測定的結(jié)果受到亞硝酸根的干擾，明顯偏高；采用標(biāo)準(zhǔn)加入法和標(biāo)液中加亞硝酸根的方式可避免干擾，得到正確的檢測結(jié)果。

表4 采用不同標(biāo)準(zhǔn)試驗結(jié)果mg·kg-1

3 小結(jié)與討論

食品、蔬菜、水果中硝酸根離子的測定一般采用3種方法。第一法涉及離子色譜儀，適合大批量樣品，可以同時測定硝酸根和亞硝酸根；第二法為實驗室常用方法，但硝酸根需要通過鎘柱還原成亞硝酸根來測試，前處理煩瑣，需要較強(qiáng)的動手能力，不適合大批量樣品；第三法為紫外分光光度法，較為簡便，試驗過程中所用試劑較少，缺點是不能同時得到亞硝酸鹽結(jié)果［6］。

硝酸根離子和亞硝酸根離子在紫外區(qū)219 nm處具有等吸收波長的特性，給采用紫外分光光度法測定香椿中硝酸根含量帶來難度。通過標(biāo)準(zhǔn)加入法或在硝酸根標(biāo)液中加入一定量的亞硝酸根溶液模擬樣品狀態(tài)這兩種方法來消除這一基質(zhì)干擾，既簡單便捷，又確保了數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。

［1］ 陳欣.香椿芽亞硝酸鹽含量變化規(guī)律及亞硝酸鹽降解技術(shù)研究［D］.濟(jì)南：山東大學(xué)，2010.

［2］ 楊玉珍，彭方仁，曹一達(dá).不同種源香椿芽硝酸鹽、亞硝酸鹽及Vc含量變化的研究［J］.食品科學(xué)，2007，28（6）：48-51.

［3］ 喬海濤，時桂英，徐建余，等.不同采收期紅香椿硝酸還原酶活性及亞硝酸鹽含量的變化［J］.山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，48（1）：51-53.

［4］ 蔬菜、水果中硝酸鹽的測定紫外分光光度法：NY/T 1279-2007［S］.

［5］ 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定：GB 5009.33-2010［S］.

［6］ 李祥，陳宗姮，袁硯，等.亞硝酸鹽對紫外分光光度法測定硝酸鹽的影響［J］.實驗室研究與探索，2014，33（11）：10-14.

［7］ 吳大付，任秀娟，李東方.蔬菜硝酸鹽含量測定方法研究［J］.河南科技學(xué)院學(xué)報，2010，38（3）：36-38.

（責(zé)任編輯：張瑞麟）

S-3

A

0528-9017（2017）01-0128-04

文獻(xiàn)著錄格式：朱勇，應(yīng)杰，孫亞米，等.紫外分光光度法檢測香椿中硝酸鹽方法研究［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，58（1）：128-131.

10.16178/j.issn.0528-9017.20170141

2016-07-15

寧波市科技新苗培養(yǎng)計劃（甬教基〔2015〕112號）

朱 勇（1978-），男，浙江普陀人，高級農(nóng)藝師，從事農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量檢測研究工作，E-mail：zjzszy@163.com。