劉星芳， 張秀梅， 賴(lài)麗娟， 舒 鵬， 黃志華， 占麗芳， 單熱愛(ài)4，， 黃 誠(chéng)

高滲氯化鈉羥乙基淀粉40對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷后MMP-9和層粘連蛋白表達(dá)的影響

劉星芳1， 張秀梅1， 賴(lài)麗娟1， 舒 鵬2， 黃志華3，4， 占麗芳5， 單熱愛(ài)4，5， 黃 誠(chéng)3，4

目的 探討高滲氯化鈉羥乙基淀粉40(HSH)對(duì)大鼠腦缺血-再灌注(I/R)損傷后神經(jīng)功能行為學(xué)評(píng)分，腦水腫情況，腦梗死體積以及腦組織中基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)和層粘連蛋白(Laminin)表達(dá)的影響。方法 48只雄性SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、實(shí)驗(yàn)1組、實(shí)驗(yàn)2組。大鼠局灶性腦I /R損傷模型制備成功后120 min，假手術(shù)組和模型組靜脈輸注0.9%生理鹽水，實(shí)驗(yàn)1組和2組分別靜脈輸注HSH 4 ml/kg和8 ml/kg。再灌注24 h后，行神經(jīng)功能行為學(xué)評(píng)分，觀察腦水腫情況，TTC染色測(cè)算腦梗死體積，用免疫印跡方法檢測(cè)缺血區(qū)腦組織MMP-9和Laminin的表達(dá)。結(jié)果 與假手術(shù)組比較，模型組神經(jīng)功能行為學(xué)評(píng)分升高(P<0.001)；腦水腫加重；腦梗死體積增加(P<0.001)；MMP-9蛋白表達(dá)升高(P<0.05)；Laminin蛋白表達(dá)降低(P<0.01)。與模型組比較，實(shí)驗(yàn)1組和2組神經(jīng)功能行為學(xué)評(píng)分降低(P<0.001)；腦水腫緩解；腦梗死體積減少(P<0.001)；實(shí)驗(yàn)1組MMP-9蛋白表達(dá)減少(P<0.01)，Laminin蛋白表達(dá)升高(P<0.05)；實(shí)驗(yàn)2組MMP-9蛋白和Laminin蛋白表達(dá)均無(wú)明顯變化。結(jié)論 用HSH治療大鼠腦I /R損傷后，大鼠神經(jīng)功能行為學(xué)評(píng)分改善，腦水腫減輕，腦梗死體積減小，血腦屏障通透性降低，其機(jī)制可能與降低MMP-9和增加Laminin蛋白的表達(dá)有關(guān)。且保護(hù)作用以4 ml/kg劑量效果更佳。

腦缺血再灌注損傷； 高滲氯化鈉羥乙基淀粉40； MMP-9； Laminin

高滲氯化鈉羥乙基淀粉(HSH)是一種血容量擴(kuò)充藥，它具有減輕組織水腫、改善微循環(huán)、提高晶體與膠體滲透壓的優(yōu)點(diǎn)[1]。課題組前期研究表明，HSH對(duì)腦缺血再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)損傷有保護(hù)作用[2～4]，且降低腦組織含水率。因此，HSH很可能通過(guò)保護(hù)血腦屏障起作用。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)TTC染色觀察腦梗死體積及檢測(cè)血腦屏障相關(guān)蛋白MMP-9和Laminin，進(jìn)一步探討HSH對(duì)大鼠急性腦I/R損傷后血腦屏障的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 健康雄性SD大鼠24只(購(gòu)自贛南醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，體重250～300 g，隨機(jī)均分成假手術(shù)組、模型組、實(shí)驗(yàn)1組(4 ml/kgHSH)和實(shí)驗(yàn)2組(8 ml/kgHSH)。

1.2 腦缺血再灌注損傷模型制備 大鼠用10%的水合氯醛3.5 ml/kg腹腔注射麻醉后，模型組、實(shí)驗(yàn)1組和實(shí)驗(yàn)2組采用大腦中動(dòng)脈拴線法[5，6]制備大鼠局灶性腦缺血再灌注模型，將一尼龍線(長(zhǎng)4 cm，直徑0.26 mm)經(jīng)頸總動(dòng)脈主干切口緩慢向頸內(nèi)動(dòng)脈入顱方向推進(jìn)，以頸總動(dòng)脈分叉處為標(biāo)記，推進(jìn)18～20 mm感到輕微阻力時(shí)，達(dá)到大腦前動(dòng)脈，阻斷大腦中動(dòng)脈的所有血液供應(yīng)，120 min后，拔出尼龍線，縫合皮下組織和皮膚，完成腦缺血再灌注損傷模型。假手術(shù)組僅需要暴露和分離出頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈，不閉塞大腦中動(dòng)脈。術(shù)中嚴(yán)格控制室溫在23～25 ℃。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在腦缺血120 min后，假手術(shù)組和模型組經(jīng)舌下靜脈輸注0.9%生理鹽水4 ml/kg，實(shí)驗(yàn)1組和2組分別從舌下靜脈輸注HSH 4 ml/kg和8 ml/kg，均于30 min內(nèi)微量泵恒速輸完。大鼠蘇醒后，放回鼠籠。

1.3 神經(jīng)功能行為學(xué)評(píng)分 再灌注24 h后，參照Longa氏評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[5]進(jìn)行神經(jīng)功能行為學(xué)評(píng)分。0分：未觀察到神經(jīng)功能缺陷癥狀；1分：輕度局灶性神經(jīng)功能缺陷，不能完全伸展手術(shù)對(duì)側(cè)前爪；2分：中度局灶性神經(jīng)功能缺陷，向手術(shù)對(duì)側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分：重度神經(jīng)功能缺陷，向手術(shù)對(duì)側(cè)傾倒；4分：不能行走，意識(shí)昏迷。

1.4 TTC染色觀察腦梗死體積 大鼠斷頭取腦后，-20 ℃冰凍3 min后，以矢狀縫后人字形分叉點(diǎn)為起始標(biāo)記點(diǎn)切成1.0～2.0 mm厚(6片/只)腦片置于2%氯化2、3、5-三苯基四氮唑溶液中，37 ℃避光溫育30 min，然后移至PBS配制的4%多聚甲醛液中固定，腦梗死區(qū)呈白色，照相。

2 結(jié) 果

2.1 HSH對(duì)腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)功能行為學(xué)評(píng)分、腦水腫和腦梗死體積的影響 與假手術(shù)組比較，模型組神經(jīng)功能行為學(xué)評(píng)分增高(P<0.001)，腦水腫情況明顯，腦梗死體積增加(P<0.001)。與模型組比較，實(shí)驗(yàn)1組和2組神經(jīng)功能行為學(xué)評(píng)分降低(P<0.001)，腦水腫情況緩解，腦梗死體積減小(P<0.001)(見(jiàn)表1和圖1、2)。

2.2 HSH對(duì)腦缺血再灌注損傷后MMP-9和Laminin蛋白的表達(dá)的影響 與假手術(shù)組比較，模型組損傷側(cè)腦組織中MMP-9蛋白的表達(dá)明顯增多(P<0.05)，Laminin蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.01)；與模型組比較，實(shí)驗(yàn)1組損傷側(cè)腦組織中MMP-9蛋白的表達(dá)減少(P<0.01)，Laminin蛋白表達(dá)升高(P<0.05)，實(shí)驗(yàn)2組MMP-9蛋白和Laminin蛋白表達(dá)均無(wú)明顯變化(見(jiàn)圖3，圖4)。

組別神經(jīng)功能評(píng)分(分)腦梗死體積(%)假手術(shù)組模型組實(shí)驗(yàn)1組實(shí)驗(yàn)2組02.5±0.5*0.9±0.8△1.6±0.5△029.9±0.6*2.9±0.4△5.7±0.4△

與假手術(shù)組比較*P<0.001；與模型組比較△P<0.001

圖1 各組腦水腫情況

圖2 各組TTC染色腦梗死范圍的影響

與假手術(shù)組相比*P<0.05；與模型組相比##P<0.01

與假手術(shù)組相比**P<0.01；與模型組相比#P<0.05

3 討 論

高滲氯化鈉羥乙基淀粉40(HSH)為復(fù)方制劑，含10.5 g 4.2%氯化鈉+19 g 7.6%羥乙基淀粉40，數(shù)字模型下晶膠最合適比例。前期研究表明，在大鼠腦缺血再灌注損傷模型中HSH可降低缺血區(qū)腦組織iNOS活性、減少NO含量[2]；提高大鼠腦I/R的抗氧化作用、增強(qiáng)氧自由基的清除[3]；使腦組織Ca+-Mg+-ATPase活性的升高可促進(jìn)Ca+向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)，降低細(xì)胞內(nèi)的Ca+濃度，從而對(duì)抗腦缺血-再灌注損傷所致的鈣超載，保護(hù)腦細(xì)胞[4]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，HSH可以改善大鼠腦缺血再灌注損傷后的神經(jīng)功能行為學(xué)評(píng)分、腦水腫情況以及腦梗死體積。

基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是調(diào)控腦內(nèi)基質(zhì)最重要的酶系統(tǒng)之一，MMPs介導(dǎo)緊密結(jié)合蛋白的降解是早期BBB損傷的一個(gè)重要機(jī)制[7]。其中MMP-9與腦缺血水腫時(shí)血腦屏障的破壞關(guān)系最為密切，它能降解和重塑細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的聚集和遷移，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡，參與血管反應(yīng)的病理生理過(guò)程以及神經(jīng)血管的再生和重塑[8]。腦缺血時(shí)，MMP-9被誘導(dǎo)激活，通過(guò)降解緊密連接蛋白和基底膜成分[9]導(dǎo)致血管壁完整性破壞，從而增加BBB通透性，導(dǎo)致血管源性水腫、白細(xì)胞浸潤(rùn)和出血性轉(zhuǎn)化，加重神經(jīng)功能缺損[10]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，模型組中MMP-9蛋白的表達(dá)明顯升高，這可能是因?yàn)槿毖俟嘧p傷誘發(fā)炎癥反應(yīng)或者氧自由基，刺激MMP-9的基因轉(zhuǎn)錄，從而導(dǎo)致MMP-9合成增加。而HSH實(shí)驗(yàn)組的大鼠MMP-9蛋白的表達(dá)明顯低于模型組。HSH可能通過(guò)同時(shí)提高晶體和膠體的滲透壓，減輕腦水腫，改善腦血供，從而減少M(fèi)MP-9的表達(dá)。

Laminin主要存在于基底膜結(jié)構(gòu)中，是基底膜所特有的非膠原糖蛋白。Laminin的主要功能是作為基底膜的主要結(jié)構(gòu)成分對(duì)基底膜的組裝起關(guān)鍵作用，在細(xì)胞表面形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)并將細(xì)胞固定在基底膜上。在缺氧或炎癥導(dǎo)致的BBB功能障礙中，Laminin作為一個(gè)關(guān)鍵分子參與了BBB損傷后的修復(fù)[11]。由于Laminin是MMP-9的主要作用底物，所以在腦缺血損害中Laminin的降解可破壞BBB的完整性，加重BBB的損害[12]。本實(shí)驗(yàn)顯示，腦缺血再灌注損傷后Laminin蛋白的表達(dá)明顯降低，這和MMP-9的表達(dá)成負(fù)性相關(guān)。這更說(shuō)明了，可能是腦缺血再灌注損傷導(dǎo)致的水腫和炎癥等因素造成MMP-9合成增多從而使Laminin的降解也增多。而HSH實(shí)驗(yàn)組中的Laminin的表達(dá)明顯升高，故認(rèn)為HSH保護(hù)血腦屏障，減輕腦水腫也與Laminin表達(dá)增加有關(guān)，除可能因MMP-9表達(dá)降低，Laminin破壞減少，HSH是否可以直接刺激Laminin表達(dá)增加尚未見(jiàn)報(bào)道。

HSH實(shí)驗(yàn)組中，4 ml/kg組比8 ml/kg組效果更好，可能原因是8 ml/kg的劑量對(duì)于腦缺血再灌注大鼠來(lái)說(shuō)容量負(fù)荷過(guò)大，減弱了對(duì)腦組織細(xì)胞的保護(hù)作用。也可能因?yàn)锽BB嚴(yán)重破壞導(dǎo)致HSH在兩側(cè)的梯度滲透壓減弱，只有在HSH的有效窗才能取得平衡，且與BBB的損傷程度成反比[13]。

本研究結(jié)果表明，腦缺血再灌注損傷后，MMP-9蛋白表達(dá)的升高和Laminin蛋白表達(dá)的減少參與了其病理變化，促進(jìn)BBB的損傷，使得大鼠神經(jīng)功能行為學(xué)評(píng)分和腦梗死體積等均增加，腦水腫明顯。早期給予HSH治療可能通過(guò)減少M(fèi)MP-9蛋白的表達(dá)，增加Laminin蛋白的表達(dá)對(duì)缺血再灌注腦損傷具有一定程度的保護(hù)作用。

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Effect of hypertonic sodium chloride hydroxyethyl starch 40 on expression of MMP-9 and Laminin after rats cerebral ischemia reperfusion injury

LIUXingfang，ZHANGXiumei，LAILijuan，etal.

(MasterGraduateStudent，GannanMedicalUniversity，Ganzhou341000，China)

Objective To observe the effect of Hypertonic Sodium Chloride Hydroxyethyl Starch 40 (HSH) on neurological evaluations，degree of encephaledema，cerebral infarction volume and expression of MMP-9 and Laminin in rat cerebral ischemia/reperfusion(I/R) injury model. Methods 48 male SD rats were randomly divided into shame，model，experimental 1 and 2 group. Rat focal cerebral I/R injury model should been accomplished，after 120 minutes，shame and model group were treated with physiological saline，experimental 1 and 2 group were treated with 4 ml/kg and 8 ml/kg HSH by vein injection. After 24 hours’ reperfusion，neurological evaluations，TTC staining and degree of encephaledema would be executed，the expression of MMP-9 and Laminin would be tested by western blotting. Results Compared to the shame group，model group’s cerebral neurological evaluations(P<0.001)，infarction volume(P<0.001) and expression of MMP-9(P<0.05) respectively increased with an obvious encephaledema，but Laminin decreased(P<0.05). Compared to model group，experimental 1 and 2 group’s neurological evaluations(P<0.001) and cerebral infarction volume(P<0.001) decreased with a catabatic degree of encephaledema；the expression of MMP-9 in experimental 1 group decreased(P<0.05) and Laminin increased(P<0.05)，but those of experimental 2 group had no obvious change. Conclusion HSH can significantly reduce neurological evaluations，cerebral infarction volume，degree of encephaledema and BBB’s permeability in rat cerebral I/R injury model. These findings indicated that MMP-9 and Laminin may be involved in the protective mechanisms of HSH against cerebral I/R injury. The dose of 4 ml/kg is better.

Cerebral ischemia reperfusion injury； Hypertonic sodium chloride hydroxyethyl starch 40； MMP-9； Laminin

1003-2754(2017)01-0009-04

2016-09-12；

2016-12-03

江西省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(No. GJJ12548)；江西省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No. 20142BAB205020)；贛南醫(yī)學(xué)院研究生創(chuàng)新專(zhuān)項(xiàng)資金項(xiàng)目(No. YC2015-S408) 作者單位：(1.贛南醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院，江西 贛州 341000；2.贛南醫(yī)學(xué)院本科生，江西 贛州 341000；3.贛南醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，江西 贛州 341000；4.贛南醫(yī)學(xué)院疼痛醫(yī)學(xué)研究所，江西 贛州 341000；5.贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院麻醉科，江西 贛州 341000)

單熱愛(ài)，E-mail：shanreai@163.com

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