杜 娟， 徐曉巍， 崔正權(quán)， 王祎龍， 賈鑫明， 盧 瑛

(1. 上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院 農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室 上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心， 上海 201306； 2. 南京愛納瑪斯醫(yī)藥科技有限公司， 南京 211100；3. 同濟大學(xué) 醫(yī)學(xué)院 生物醫(yī)學(xué)工程與納米科學(xué)研究院， 上海 200092；4. 同濟大學(xué) 醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室， 上海 200092)

乙肝前S1抗原的磁性免疫層析檢測的影響因素研究

杜 娟1， 徐曉巍1， 崔正權(quán)2， 王祎龍3， 賈鑫明4， 盧 瑛1

(1. 上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院 農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室 上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心， 上海 201306； 2. 南京愛納瑪斯醫(yī)藥科技有限公司， 南京 211100；3. 同濟大學(xué) 醫(yī)學(xué)院 生物醫(yī)學(xué)工程與納米科學(xué)研究院， 上海 200092；4. 同濟大學(xué) 醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室， 上海 200092)

以免疫磁珠作為檢測探針，構(gòu)建了以血清中前S1抗原為標志物的乙肝檢測層析試紙條，并重點分析了磁珠粒徑、抗體偶聯(lián)量、pH值、緩沖液和反應(yīng)溫度對該層析檢測的影響作用。研究表明，磁珠的分散穩(wěn)定性對免疫層析檢測有顯著的影響，因此，磁珠粒徑可以作為一項評判其分散穩(wěn)定性的質(zhì)控指標。同時，優(yōu)化抗體添加量，控制層析樣本pH值在6.5 ～ 9.0之間，并使用pH值更加穩(wěn)定的PBS基礎(chǔ)緩沖液都可以提高層析試紙條檢測乙肝抗原的靈敏度和穩(wěn)定性?？蔀楦哽`敏和高穩(wěn)定性磁性免疫層析試紙條產(chǎn)品的研發(fā)提供理論依據(jù)。

前S1抗原; 血清樣本; 乙肝檢測; 免疫層析試紙條; 免疫磁珠

乙型肝炎是目前流行最廣泛、危害最嚴重的病毒性肝炎之一。乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus，HBV)是一種嗜肝細胞病毒，主要引發(fā)肝細胞炎癥、壞死、纖維化甚至肝癌[1-2]。在臨床上，乙肝五項是HBV感染的常規(guī)檢查項目。HBV的免疫學(xué)標記共3對，即表面抗原(HBsAg)和表面抗體(抗HBs或HBsAb)、e抗原(HBeAg)和e抗體(抗HBe或HBeAb)以及核心抗原(HBcAg)和核心抗體(抗HBc或HBcAb)。由于核心抗原在血液中不易檢測到，因此臨床上主要檢測另外兩對半抗原抗體，也稱為“乙肝兩對半”檢測。研究表明，表面抗原(HBsAg)基因組分別編碼S、前S1、前S2 3種蛋白[3-4]。前S1抗原(PreS1Ag)位于病毒顆粒的表面是外膜蛋白的重要組成部分，具有高度的免疫原性，是一種反映HBV復(fù)制且易于檢測的血清標志物，因此檢測前S1可以起到早期診斷乙肝的作用，具有重要的臨床意義[5-9]。

乙肝檢測的主要方法是PCR[10]和ELISA[11]。其中，HBV-DNA定量PCR因具有較高的特異性和靈敏度是目前乙肝檢測的黃金標準，但是，該方法對檢測人員的技術(shù)要求非常高，且成本大、耗時長，因此也限制了它的應(yīng)用范圍。隨著技術(shù)的突破，一項基于ELISA原理設(shè)計的免疫層析檢測技術(shù)逐步發(fā)展起來，該技術(shù)具有操作簡便、成本低廉和檢測快捷等優(yōu)點，已被廣泛應(yīng)用于食源性致病菌、毒素或病毒的檢測中[12-16]。目前，研究人員已將這種快速檢測技術(shù)應(yīng)用于HBV檢測，獲得較傳統(tǒng)ELISA法更高的檢測靈敏度和特異性，診斷效率達到97 %以上[17-19]。作為免疫層析檢測中常用的標記探針，磁性納米材料憑借其獨特的磁性能，可在外加磁場的作用下方便快捷地實現(xiàn)目標物的分離和純化[20-21]，同時，可定量且穩(wěn)定的磁信號也使得磁性免疫層析技術(shù)擁有高于其他標記探針10倍甚至1000倍的靈敏度[22]。

本課題組在磁性免疫層析試紙條檢測方面已做了大量研究工作，并已經(jīng)建立了以前S1為乙肝檢測標志物的磁性免疫層析試紙條[23]。在此工作基礎(chǔ)上，本研究以乙肝患者血液作為檢測樣本，主要分析了磁珠粒徑、抗體偶聯(lián)量、pH值、基礎(chǔ)緩沖液和反應(yīng)溫度對乙肝檢測層析試紙條的影響作用，為提高檢測靈敏度及優(yōu)化該項檢測技術(shù)提供了思路，同時也為今后進一步開發(fā)高靈敏、高穩(wěn)定性磁性免疫層析試紙條產(chǎn)品提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

人血清樣本和前S1(PreS1)單克隆抗體由同濟大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫與炎癥研究中心及南京愛納瑪斯醫(yī)藥科技有限公司聯(lián)合提供；羧基磁珠來自同濟大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程與納米科學(xué)研究院；小鼠IgG、山羊抗小鼠二抗、硝酸纖維素膜、吸水墊、樣品墊、結(jié)合墊購自上海捷寧生物科技有限公司；底板、卡槽、覆膜購自美國Magna Bioscience公司；MES(2-嗎啉乙磺酸)購自Alafa公司；EDC(1-乙基-3-二甲基氨基丙基碳酰二亞胺鹽酸鹽)、NHS(N-羥基琥珀酰亞胺)購自美國PIERCE公司；Tween-20、蔗糖、四硼酸鈉、硼酸、BSA牛血清白蛋白購于上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；磁信號分析儀(Magnetic assay reader，MAR)購自Magna Bioscience公司。實驗用水均為去離子水，試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 免疫磁珠的制備

采用NHS/EDC法進行抗體偶聯(lián)[24]。偶聯(lián)過程包括活化、偶聯(lián)、封閉和保存4個步驟。首先，取1 mg羧基磁珠，以MEST(pH 5.0，含0.05 %Tween-20(V/V)的MES溶液)作為活化緩沖液，加入5 μL EDC(0.5 g/mL)和10 μL NHS(0.25 g/mL)活化劑，室溫圓周反應(yīng)30 min以活化磁珠表面的羧基；接著以硼酸鹽吐溫緩沖液(簡稱BST，pH 9.0，含0.05 % Tween-20)作為偶聯(lián)緩沖液，加入一定量的抗體室溫圓周反應(yīng)3 h，將抗體偶聯(lián)到磁珠上；偶聯(lián)結(jié)束后，加入含1 % BSA(M/V)的BST溶液(簡稱BST-BSA)室溫圓周反應(yīng)30 min以封閉殘留的活化羧基；最后將偶聯(lián)好的免疫磁珠懸浮于含0.05%(M/V) NaN3的BST-BSA溶液中，4℃保存待用。

1.2.2 ELISA法測定抗體偶聯(lián)量

由于偶聯(lián)過程后留存的上清液中還殘留未偶聯(lián)的抗體，因此我們利用ELISA法定量偶聯(lián)上清液中抗體量，并根據(jù)下面公式計算得到偶聯(lián)量和偶聯(lián)率：

抗體偶聯(lián)量(μg)=加入的抗體的量-上清中的抗體量

抗體的偶聯(lián)率(%)=(加入的抗體量-上清中的抗體量)/加入的抗體量×100%

標準曲線是用一系列梯度濃度的小鼠IgG為樣品，并測試其在490 nm處的吸光度值。待測樣品為免疫磁珠相應(yīng)的偶聯(lián)上清液。

1.2.3 免疫層析試紙條的組裝

所用層析試紙條均為實驗室自制[25-26]。首先將硝酸纖維素膜CN140貼在透明底板上，然后將吸水墊、結(jié)合墊、樣品墊依次銜接在底板上，之后用噴膜儀在硝酸纖維素膜上噴點抗體，其中，乙肝表面抗體(HBsAb)噴點在T線區(qū)域作為檢測線，山羊抗小鼠IgG噴點在C線區(qū)域作為質(zhì)控線，之后37℃烘干2 h，然后將透明覆膜覆蓋在硝酸纖維素膜上，最后將組建好的試紙裁切成0.5 cm寬的免疫層析試紙條(圖1)。

圖 1 免疫層析試紙條結(jié)構(gòu)示意圖Fig 1 Structure schematic of immunochromatographic test strip

1.2.4 檢測流程

檢測前，首先取一定量保存液中的免疫磁珠用BST洗滌2次，然后加入磁珠懸浮液(含10 mg/mL海藻糖、10 mg/mL蔗糖的BST)進行適當超聲分散后制成免疫磁珠懸浮液。檢測時，以10 mmol/L磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7.2)為層析體系的基礎(chǔ)緩沖液。小牛血清為陰性樣本，乙肝患者血清樣本為陽性樣本。取120 μL血清樣本、14 μL層析體系、6 μL免疫磁珠懸浮液室溫混合均勻，然后將混合溶液滴加到試紙條的樣品墊上，層析一段時間后，肉眼觀察C線、T線區(qū)域的條帶進行定性檢測，并待層析完全后，將試紙條卡入卡槽中置于磁信號分析儀(MAR)中讀取磁信號值以獲得定量檢測結(jié)果。

1.2.5 層析體系加速破壞實驗

將分別由PBS和BS緩沖液配置的層析體系置于37℃下加速破壞2、4、6、8、10、12和14 d，并在每個時間節(jié)點下分別測試pH值和層析試紙條檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 結(jié)果判定

本實驗構(gòu)建的免疫層析試紙條是基于“雙抗夾心”的反應(yīng)原理，因此若在檢測區(qū)域呈現(xiàn)兩條明顯的條帶或者T線條帶比C線條帶顏色淺均為陽性結(jié)果；若僅在C線處出現(xiàn)一條帶為陰性結(jié)果；若C線處沒有條帶，則試紙條存在問題，結(jié)果視為無效。在定量測試時，MAR儀可同時讀取試紙條上C線和T線處的磁信號值。因此，我們以陽性樣本與陰性樣本的T線磁信號的比值(S/N)對檢測結(jié)果進行評價，當S/N≥ 2.1，其結(jié)果視為陽性，當S/N< 2.1，其結(jié)果視為陰性。另外，當磁信號值低于60時，條帶肉眼不可見，其結(jié)果也視為陰性。同時，我們以S/N值和T線磁信號值作為層析性能的間接評價指標。

2.2 磁珠粒徑對層析檢測的影響

分別將6種不同粒徑大小的磁珠在免疫PreS1抗體后進行層析檢測評價，結(jié)果如表1所示。從表1中可見，6種磁珠在免疫層析檢測中的陰性樣本值都比較低，并隨著粒徑增大有逐漸降低的趨勢。從陽性血清樣本檢測值來看，在不同樣本稀釋度下，T線磁信號值均隨著磁珠粒徑增大而逐漸降低。對比發(fā)現(xiàn)，當檢測低濃度血清樣本時(1∶128)，1號和2號磁珠的T線磁信號分別為119和73，在肉眼可見范圍，其S/N值分別為4.31和2.29，結(jié)果為陽性；而其他4種磁珠(3號～ 6號)的T線磁信號值均低于60，肉眼不可見，檢測結(jié)果均判為陰性。這說明了1號和2號磁珠的層析性能最好，更適用于開發(fā)高靈敏度層析檢測。

從表中6種磁珠的多分散系數(shù)(PDI)可以看出，隨著水合粒徑的增大，6種磁珠的PDI在逐漸增大，這說明了磁珠在溶液中的分散穩(wěn)定性逐漸降低[27-28]。并且在偶聯(lián)抗體實驗中，5號和6號磁珠極易團聚成大顆粒，出現(xiàn)沉降現(xiàn)象。在類似的研究中，Yan等[29]對比200 nm和1000 nm磁珠在免疫層析檢測副溶血性弧菌時發(fā)現(xiàn)，200 nm的磁珠更適用于免疫層析檢測，并發(fā)現(xiàn)隨著磁珠粒徑增大，磁響應(yīng)越強，粒子間因各向異性產(chǎn)生的偶極矩作用增大，在溶液中有更大的團聚傾向，因此在層析檢測中較大團聚體的免疫磁珠更容易滯留在結(jié)合墊和硝酸纖維素膜接合處，出現(xiàn)堵塞現(xiàn)象，從而導(dǎo)致C線和T線條帶顏色變淺、檢測值降低。因此，我們認為磁珠的分散穩(wěn)定性對免疫層析應(yīng)用有很大影響，并且，磁珠的粒徑可以作為一個質(zhì)控指標來判斷磁珠的分散穩(wěn)定性能。

表1 磁珠粒徑對免疫層析檢測的影響Table 1 Effect of hydrodynamic size of magnetic nanobeads on the immunochromatographic assay

*：PDI為多分散系數(shù)

2.3 抗體偶聯(lián)量對層析檢測的影響

為探討抗體偶聯(lián)量對層析檢測的影響，我們?nèi)? mg磁珠分別在80 μg、100 μg、120 μg和140 μg的抗體添加量下進行PreS1抗體偶聯(lián)，并將制得的4種免疫磁珠用于免疫層析檢測乙肝血清樣本。其中，以乙肝弱陽性血清和陽性血清作為陽性血清樣本，牛血清作為陰性血清樣本。

經(jīng)ELISA法測定的抗體偶聯(lián)量和偶聯(lián)率如圖2-a所示。當添加80 ～120 μg抗體時，偶聯(lián)量和偶聯(lián)率均隨著抗體添加量的增加而增加，并當抗體添加量為120 μg時，偶聯(lián)率達到最大；而當添加140 μg時，雖然抗體偶聯(lián)量進一步增大，但相應(yīng)的偶聯(lián)率卻在降低。圖2-b中顯示了4種免疫磁珠的層析T線磁信號值。從圖中可見，抗體添加量對4種免疫磁珠檢測陰性和弱陽性樣本的磁信號值影響不大。但對比陽性樣本磁信號值，我們發(fā)現(xiàn)隨著抗體添加量增加其磁信號值逐漸增大，而對于添加140 μg的免疫磁珠，其磁信號值卻在降低。因此，我們認為在制備免疫磁珠時，抗體添加量的增加有利于磁珠表面實際偶聯(lián)量的增加，并對免疫層析檢測有促進作用，然而當抗體添加量進一步增大時，雖然實際抗體偶聯(lián)量增大，但其偶聯(lián)率卻降低，并且因較多抗體包覆也會降低免疫磁珠的分散穩(wěn)定性，從而降低其免疫層析性能[30]。所以綜合考慮，選擇合適的抗體添加量在制備免疫磁珠和免疫層析檢測時都是一個需要重點關(guān)注的因素。

圖2 抗體偶聯(lián)量對免疫層析檢測的影響Fig 2 Effect of coupled antibody on immunochromatographic assay

a:抗體偶聯(lián)量和偶聯(lián)率；b:免疫層析T線磁信號值

2.4 pH值對層析檢測的影響

在層析檢測前，將待測血清樣本與層析液混合得到的層析樣本，用4 %乙酸和1 mol/L NaOH分別調(diào)節(jié)pH值至5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5和10。圖3顯示了pH值對層析檢測的影響。從圖3-a中可以看到不同pH值下層析試紙條檢測的定性照片，而圖3-b是其相應(yīng)的定量磁信號值。結(jié)果顯示，當pH值較低或較高時，層析樣本的磁信號值都相對較低；而當pH值為8和8.5時，層析磁信號值最高。綜合定性和定量結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)，當層析樣本的pH值在6.5 ～ 9時，其T線條帶顏色變化細微，且相應(yīng)磁信號值的變化也不大，因此在利用免疫層析試紙條進行乙肝檢測時，控制層析樣本的pH值在6.5～9之間均可。

圖3 pH值對免疫層析檢測的影響Fig 3 Effects of pH values on immunochromatographic assay

a：試紙條定性照片；b： 試紙條定量檢測值

2.5 基礎(chǔ)緩沖液對層析檢測的影響

本研究主要對比分析了兩種常用的基礎(chǔ)緩沖液(PBS和BS)對層析檢測的影響，結(jié)果如圖4所示。在兩種基礎(chǔ)緩沖液配置的層析體系的加速破壞實驗中，我們分別測試了每個時間節(jié)點下層析體系的pH值(圖4-a)，并應(yīng)用于層析檢測評價(圖4-b)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨時間推移，以PBS為基礎(chǔ)的層析體系，其pH值變化極小，而以BS為基礎(chǔ)的層析體系pH值變化較大，37℃下加速14 d后，其pH值降低了0.5。從相應(yīng)時間下的層析磁信號值來看，在PBS為基礎(chǔ)的層析體系中，其層析磁信號值相對穩(wěn)定，CV值為12.33 %，而以BS為基礎(chǔ)的層析體系，其層析磁信號值變化較大，CV值為24.76%，且呈下降趨勢。采用Origin軟件進行t檢驗分析，我們發(fā)現(xiàn)兩種層析體系下的層析檢測值在0.05水平上具有顯著性差異。從2.4中pH值對層析檢測的影響可知，當層析樣本的pH值低于6.5時，將不利于層析檢測，因此，為了保證層析檢測的靈敏度和穩(wěn)定性，使用PBS基礎(chǔ)緩沖液來進行層析體系的配置是較好的選擇。

圖4 兩種基礎(chǔ)緩沖液對免疫層析檢測的影響Fig 4 Effect of buffer on immunochromatographic assay

a：pH值變化；b：磁信號值變化

2.6 反應(yīng)溫度對層析檢測的影響

本實驗分別設(shè)置了4℃、15℃、25℃和37℃下的層析檢測，結(jié)果如圖5所示。由圖5可知，隨著層析反應(yīng)溫度增大，其陰性樣本檢測值均在60以下，變化不大；而其陽性血清樣本的層析磁信號值隨溫度逐漸增大，并在37℃時磁信號值達到最大，其CV值在10 %以下，說明檢測值穩(wěn)定；而在室溫下，平行試紙條的磁信號值相差較大，檢測穩(wěn)定性較差。經(jīng)過分析，這種由反應(yīng)溫度帶來的差異很可能是與抗體反應(yīng)活性有關(guān)，37℃是抗原抗體反應(yīng)的最適溫度，因此更有利于免疫層析檢測。

圖5 反應(yīng)溫度對層析檢測的影響Fig 5 The effect of reaction temperature on immunochromatographic assay

3 結(jié)論

本研究以免疫磁珠作為檢測探針，構(gòu)建了以血清中前S1抗原為標志物的乙肝檢測層析試紙條，并重點分析了磁珠粒徑、抗體偶聯(lián)量、pH值、緩沖液和反應(yīng)溫度對該層析檢測的影響作用。研究表明，磁珠的分散穩(wěn)定性對免疫層析檢測有很大的影響，磁珠的粒徑可以作為一個質(zhì)控指標來判斷磁珠的分散穩(wěn)定性能，在本研究中選用200 nm的磁珠更有利于層析檢測。根據(jù)文獻報道及本課題組多年研究成果可知，單分散且均一的磁珠有利于提高其檢測穩(wěn)定性[31]，并且在類似的研究中，Wang等[32]也發(fā)現(xiàn)磁珠的粒徑會影響層析泳動速率進而影響檢測時間，因此粒徑越小的磁珠適用于層析檢測。另外，優(yōu)化合適的偶聯(lián)抗體添加量也是提高層析檢測靈敏度的一個關(guān)鍵點，在制備免疫磁珠用于層析檢測前S1抗原時，1 mg磁珠添加120 μg抗體是最優(yōu)條件。同時，控制層析樣本pH值在6.5 ～ 9之間，使用pH值更穩(wěn)定的PBS基礎(chǔ)緩沖液，以及37℃的檢測溫度都有利于提高乙肝檢測層析試紙條的靈敏度和穩(wěn)定性。綜上，我們認為本研究結(jié)果可為高靈敏和穩(wěn)定的磁性免疫層析試紙條的研發(fā)提供理論指導(dǎo)，進而拓展這項檢測技術(shù)的應(yīng)用范圍。

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Influences of magnetic immunochromatographic assay for detection of PreS1region of hepatitis B virus surface antigen

DU Juan1, XU Xiao-wei1, CUI Zheng-quan2, WANG Yi-long3, JIA Xin-ming4, LU Ying1

(1. Laboratory of Quality & Safety Risk Assessment for Aquatic Products on Storage and Preservation, Ministry of Agriculture, Shanghai Engineering Research Center of Aquatic-Product Processing & Preservation, College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306； 2. Nanjing iNanoMax Medtech Limited Company, Nanjing 211100；3. The Institute for Biomedical Engineering and Nano Science,Tongji University School of Medicine, Shanghai 200092；4. Department of Immunology,Tongji University School of Medicine, Shanghai 200092, China)

To establish a rapid assay for HBV, a magnetic immunochromatographic assay (MICA) for detection of PreS1Ag in serum samples of people was developed in our study. The influences of hydrodynamic size of magnetic nanobeads, coupled antibody, pH, basal buffer, reaction temperature on the MICA were analyzed emphatically. Results showed that dispersion stability of magnetic nanobeads monitored by hydrodynamic size had a strong effect on MICA. Moreover, optimal antibody addition, proper pH value of 6.5 to 9 and using PBS with more stable pH as the basal buffer could be beneficial to improve the sensitivity and stability of MICA. The results of this research are expected to provide the theoretical guidance for the future development of MICA.

PreS1Ag; serum samples; hepatitis B test; immunochromatographic assay; magnetic nanobeads

2016-04-11；

2016-04-21

上海市科委“科技創(chuàng)新行動計劃”生物醫(yī)藥領(lǐng)域科技支撐項目(No. 15441905900);上海市科委工程中心能力提升項目(16DZ2280300)

杜 娟，碩士，主要從事磁性復(fù)合納米材料制備及免疫層析檢測研究，E-mail:juandu12350@163.com

盧 瑛，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事納米生物技術(shù)，食品質(zhì)量安全研究，E-mail：y-lu@shou.edu.cn

R446.6

A

2095-1736(2017)01-0011-05

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2017.01.011