姚 健,陳慶隆,張 誠,鐘國祥,王洪秀,馬吉平

(江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)應(yīng)用微生物研究所,江西 南昌 330200)

1株產(chǎn)木聚糖酶菌株的鑒定、產(chǎn)酶條件的優(yōu)化及酶學(xué)性質(zhì)初探

姚 健,陳慶隆,張 誠,鐘國祥,王洪秀,馬吉平

(江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)應(yīng)用微生物研究所,江西 南昌 330200)

以木聚糖為唯一碳源,從腐敗的甘蔗葉中分離木聚糖降解菌,結(jié)合木聚糖水解圈法及胞外酶活測(cè)定(DNS)法篩選到1株高產(chǎn)木聚糖酶的菌株ZJ-1。16S rRNA序列及系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明ZJ-1菌株與鏈霉菌(登錄號(hào): KC856931.1)處于同一最小分支,且與多株鏈霉菌屬菌株的相似性均達(dá)到98%以上,故將菌株ZJ-1初步鑒定為鏈霉菌(Streptomycessp. ZJ-1)。在最適產(chǎn)酶條件(碳源CMC-Na、氮源蛋白胨、初始培養(yǎng)pH 6.5～10.0、培養(yǎng)溫度25 ℃、連續(xù)培養(yǎng)6 d)下，ZJ-1所產(chǎn)木聚糖酶的活性達(dá)40.0 U/mL。ZJ-1所產(chǎn)木聚糖酶的最適反應(yīng)溫度為60 ℃,最適反應(yīng)pH值為6.0。

木聚糖酶；鏈霉菌；菌株鑒定;產(chǎn)酶條件優(yōu)化;酶學(xué)性質(zhì)

半纖維素是存在于自然界中非常豐富的資源,約占植物干重的35%,廣泛存在于農(nóng)副產(chǎn)品如玉米芯、麥麩、米糠、秸稈及甘蔗渣中,在自然界中含量僅次于纖維素[1]。木聚糖是半纖維素的重要組成部分,是由β-D-吡喃型木糖單元經(jīng)β-1,4-糖苷鍵連接構(gòu)成主鏈,主鏈上帶有乙?；?、阿拉伯糖殘基和葡萄糖殘基等多種不同的取代基,來源或分支程度不同的主側(cè)鏈與不同的取代基共同構(gòu)成的復(fù)雜而多樣的木聚糖分子[2]。木聚糖的完全降解需要多種酶的共同參與,其中,β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶作用于木聚糖主鏈生成不同鏈長的寡糖,是木聚糖降解酶系中最關(guān)鍵的酶[3],同時(shí)也是目前研究較多、應(yīng)用較廣泛的木聚糖降解酶。利用酶法生產(chǎn)的低聚木糖在動(dòng)物腸道內(nèi)對(duì)雙歧桿菌等有高選擇性增殖效果,在降低膽固醇、維持腸道健康和促進(jìn)鈣吸收等方面都有重要的作用[3]。另外,木聚糖酶在制漿造紙、食品、飼料添加劑及生物轉(zhuǎn)化等方面都起到重要的作用[1]。

木聚糖酶在自然界分布廣泛且相當(dāng)豐富,國內(nèi)外研究人員已從環(huán)境中篩選到產(chǎn)木聚糖酶的真菌[4-9]、細(xì)菌[10-11]和放線菌[2,13]。本研究從霉變的甘蔗葉中篩選到了1株鏈霉菌(Streptomycessp.),對(duì)該菌株進(jìn)行了鑒定,并對(duì)其產(chǎn)酶條件及酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了初步探討,以期為進(jìn)一步誘變篩選高活力菌株或克隆木聚糖酶基因提供微生物菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品 來自海南某地霉變甘蔗葉。

1.1.2 試劑 3,5-二硝基水楊酸、苯酚購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；樺木木聚糖購于阿拉丁試劑公司。

0.2%木聚糖溶液:稱取0.2 g木聚糖，溶解于100 mL Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液(50 mmol/L, pH 7.0)。DNS試劑[14]:稱取10 g 3,5-二硝基水楊酸,放置于500 mL去離子水中,緩慢加入10 g NaOH,50 ℃水浴溶解，依次加入200 g酒石酸鉀、2 g苯酚和5 g無水Na2SO4,待全部溶解后定容至1000 mL,過濾并保存于棕色瓶中,7 d后使用。

1.1.3 培養(yǎng)基 篩選培養(yǎng)基(w/v): NaNO32 g、K2HPO41 g、KCl 0.5 g、MgSO40.5 g、木聚糖 10 g、瓊脂20 g、ddH2O 1 L。產(chǎn)酶培養(yǎng)基(w/v):氮源2 g、K2HPO41 g、KCl 0.5 g、MgSO40.5 g、碳源5 g、ddH2O 1000 mL。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 木聚糖降解菌的篩選及鑒定

1.2.1.1 木聚糖降解菌的初篩 取0.5 cm×0.5 cm霉變的甘蔗葉,用無菌水清洗并收集清洗液,經(jīng)稀釋后涂布于篩選培養(yǎng)基上,30 ℃培養(yǎng)5～7 d,反復(fù)劃線純化培養(yǎng)以獲得純培養(yǎng)菌株。

1.2.1.2 木聚糖降解菌的復(fù)篩 將初篩獲得的純培養(yǎng)菌株復(fù)制到木聚糖固體平板培養(yǎng)基上,30 ℃培養(yǎng)5～7 d。用0.1%的剛果紅染色30 min,用1 mol/L的NaCl脫色30 min,挑選有透明圈的菌株進(jìn)行液體培養(yǎng)。

1.2.1.3 16S rRNA基因測(cè)序及分析 利用細(xì)菌提取試劑盒提取基因組,16S rRNA基因PCR擴(kuò)增體系(50 μL)：25 μL PrimerSTAR Max DNA聚合酶(2×)、1 μL模板、引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(3′-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-5′)各1 μL、22 μL ddH2O。反應(yīng)程序:98 ℃ 4 min；98 ℃ 10 s、55 ℃ 10 s、72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。用PCR產(chǎn)物純化試劑盒(天根)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化后與pMD-18T載體連接,轉(zhuǎn)入大腸桿菌后,37 ℃過夜培養(yǎng)；經(jīng)酶切驗(yàn)證后,送往上海英俊公司進(jìn)行測(cè)序。將序列提交到NCBI數(shù)據(jù)庫中并用Blast軟件進(jìn)行序列比對(duì),用MEGA 5.0軟件采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1.2.2 酶活性的測(cè)定 將篩選到的菌株進(jìn)行液體培養(yǎng)后,離心(12000 g×5 min)收集上清液，作為粗酶液供酶活性檢測(cè)。取200 μL粗酶液,加入200 μL 0.2%木聚糖,60 ℃水浴10 min；加入200 μL DNS溶液,100 ℃水浴10 min；冷卻后于520 nm處測(cè)定光吸收值。粗酶液經(jīng)100 ℃處理10 min后作為陰性對(duì)照；酶液樣品設(shè)3個(gè)平行。

1.2.3 培養(yǎng)條件的優(yōu)化

1.2.3.1 碳源及其濃度對(duì)酶活性的影響 分別選取果糖(Pectin)、乳糖(Lactose)、纖維素(Cellulose)、微晶纖維素(Avicel)、木糖(Xylose)和CMC-Na作為唯一碳源,在30 ℃下以120 r/min震蕩培養(yǎng)5 d,按1.2.2中的方法測(cè)定木聚糖酶的活性。在碳源確定的基礎(chǔ)上,碳源濃度分別設(shè)為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和2.5%,按上述方法培養(yǎng)及測(cè)定酶活性。

1.2.3.2 氮源對(duì)酶活性的影響 分別選取NH4Cl、尿素(Urea)、NaNO3、牛肉膏(Beef extract)、酵母提取物(Yeast extract)、蛋白胨(Peptone)和(NH4)2SO4作為唯一氮源,在30 ℃下以120 r/min震蕩培養(yǎng)5 d,按1.2.2中的方法測(cè)木聚糖酶的活性。

1.2.3.3 初始培養(yǎng)pH值對(duì)酶活性的影響 分別選取6.0、6.5、7.0、7.5、8.0和8.5作為菌體培養(yǎng)的初始pH值,在30 ℃下以120 r/min震蕩培養(yǎng)5 d,按1.2.2中的方法測(cè)木聚糖酶的活性。

1.2.3.4 培養(yǎng)溫度對(duì)酶活性的影響 分別選取15、20、25、30和35 ℃作為菌體的培養(yǎng)溫度,以120 r/min震蕩培養(yǎng)5 d,按1.2.2中的方法測(cè)木聚糖酶的活性。

1.2.3.5 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)酶活性的影響 在最佳碳源及其濃度、氮源、溫度和初始pH的基礎(chǔ)上,菌體在培養(yǎng)的過程中每隔24 h取樣1次,共取樣7次,按1.2.2中的方法測(cè)木聚糖酶的活性。

1.2.4 酶學(xué)性質(zhì)的研究

1.2.4.1 酶的最適反應(yīng)溫度 選取最適培養(yǎng)條件下的粗酶液,按1.2.2中的方法,在30～70 ℃條件下測(cè)定粗酶液的木聚糖酶活性;另外,將粗酶液在30～70 ℃條件下放置1 h,然后在最適溫度下檢測(cè)粗酶液的溫度穩(wěn)定性。

1.2.4.2 酶的最適反應(yīng)pH值 選取最適培養(yǎng)條件下的粗酶液,將反應(yīng)體系的pH值分別調(diào)整至pH 4.0～6.0(100 mmol/L醋酸鹽緩沖液)、pH 5.5～8.0 (100 mmol/L磷酸鹽緩沖液)、pH 7.5～9.0 (100 mmol/L Tris-HCl緩沖液)、pH 8.5～10.0 (100 mmol/L glycine-NaOH緩沖液),然后在最適反應(yīng)溫度下按1.2.2中的方法測(cè)定粗酶液的木聚糖酶活性。

1.2.4.3 木聚糖酶酶解產(chǎn)物的分析 采用薄層層析法分析木聚糖酶的酶解產(chǎn)物,展開劑為正丁醇∶乙酸∶水(v/v/v)=2∶1∶1,顯色劑為甲醇∶濃硫酸(v/v)=95∶5,烘烤顯色[3]。

2 結(jié)果與分析

2.1 木聚糖降解菌的篩選及鑒定

經(jīng)多次篩選平板的分離純化,共得到10株木聚糖降解菌。根據(jù)篩選平板上水解圈的大小,選取酶活力較大的菌株ZJ-1做進(jìn)一步的研究。平板培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)其菌落特征符合鏈霉菌的一般特征,即菌落呈放射狀,表面干燥、粗糙,與培養(yǎng)基結(jié)合緊密,不易挑取,表面覆蓋一層干粉狀的孢子。以ZJ-1菌株的基因組DNA為模板,利用16S rRNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測(cè)序，得到1條長為1347 bp的片段,并將該序列提交至GenBank,登錄號(hào)為KX714289.1。根據(jù)序列比對(duì)結(jié)果并選取相關(guān)序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,分析結(jié)果表明ZJ-1與Streptomycessp. WMMB 784 (登錄號(hào):KC856931.1)處于同一分支,兩者的相似性為100%。此外,ZJ-1與多株鏈霉菌(Streptomycessp.)的相似性均在98%以上,故將該木聚糖降解菌初步鑒定為鏈霉菌(Streptomycessp.),命名為Streptomycessp. ZJ-1。

圖1 基于16S rRNA構(gòu)建的進(jìn)化樹

2.2Streptomycessp. ZJ-1產(chǎn)酶條件的優(yōu)化

2.2.1 碳源及其濃度對(duì)Streptomycessp. ZJ-1產(chǎn)木聚糖酶的影響 在其它條件恒定的情況下,以CMC-Na為碳源時(shí),菌株ZJ-1產(chǎn)木聚糖酶的活性高于其它碳源時(shí)的；果膠和微晶纖維素作碳源時(shí)次之,故將CMC-Na定為ZJ-1產(chǎn)酶的最佳碳源(圖2A)。另外本研究發(fā)現(xiàn),隨著碳源CMC-Na濃度的升高,其產(chǎn)木聚糖酶的活性逐漸升高,當(dāng)濃度達(dá)到1.0%時(shí),木聚糖酶的活性達(dá)到最高；此后隨著其濃度的進(jìn)一步升高,木聚糖酶的活性逐漸降低(圖2B)。

圖2 不同碳源(A)及CMA-Na濃度(B)對(duì)木聚糖酶活性的影響

2.2.2 氮源對(duì)Streptomycessp. ZJ-1產(chǎn)木聚糖酶的影響 在其它條件恒定的情況下,以蛋白胨作為氮源時(shí),菌株ZJ-1產(chǎn)木聚糖酶的活性最高(圖3)；其次為NaNO3；尿素和牛肉膏作氮源時(shí)最差。這可能是因?yàn)榈鞍纂俗鳛橛袡C(jī)氮源時(shí)營養(yǎng)比較豐富,使菌株在含有有機(jī)氮源的培養(yǎng)基中表現(xiàn)出生長旺盛、菌體濃度增長迅速等特點(diǎn)[16]。

2.2.3 初始pH值對(duì)Streptomycessp. ZJ-1產(chǎn)木聚糖酶活性的影響 在其它條件恒定的情況下,當(dāng)培養(yǎng)基初始pH值低于6.0時(shí),木聚糖酶活性極低,僅為最高酶活性的20%;當(dāng)培養(yǎng)基初始pH升為6.5時(shí),木聚糖酶活性升高到最高酶活性的80%;隨著pH的升高,木聚糖酶的活性逐漸升高,當(dāng)pH到達(dá)8.5時(shí),木聚糖酶的活性最高;此后隨著pH的進(jìn)一步升高,木聚糖酶的活性逐步降低,但在pH 10.0的條件下,木聚糖酶的活性仍有最高酶活性的90%左右,這表明菌株Streptomycessp. ZJ-1在pH 6.5～10.0的范圍內(nèi)均可生成有活性的木聚糖酶(圖4)。

2.2.4 培養(yǎng)溫度及培養(yǎng)時(shí)間對(duì)Streptomycessp. ZJ-1產(chǎn)木聚糖酶活性的影響 溫度對(duì)微生物的生長繁殖及其代謝有重要的影響,故選用合適的溫度對(duì)微生物產(chǎn)酶具有至關(guān)重要的作用。在其它條件恒定的情況下,當(dāng)Streptomycessp. ZJ-1的培養(yǎng)溫度為25 ℃時(shí),其產(chǎn)木聚糖酶的活性達(dá)到最大值;超過25 ℃時(shí),木聚糖酶的活性迅速降低,這說明Streptomycessp. ZJ-1的最適發(fā)酵溫度為25 ℃(圖5A)。此外,發(fā)酵時(shí)間的長短直接影響木聚糖酶的活性。發(fā)酵時(shí)間對(duì)Streptomycessp. ZJ-1產(chǎn)木聚糖酶的影響如圖5B所示,木聚糖酶的活性隨發(fā)酵時(shí)間的延長而提高,至發(fā)酵到第6天時(shí)達(dá)到最高點(diǎn),之后隨著時(shí)間的延長而逐漸降低。為了減少發(fā)酵成本及降低染菌概率,選擇6 d為Streptomycessp. ZJ-1的最佳發(fā)酵時(shí)間。

圖3 不同氮源對(duì)木聚糖酶活性的影響

圖4 初始培養(yǎng)pH值對(duì)木聚糖酶活性的影響

2.3 木聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)初步分析

2.3.1 pH值對(duì)酶活性的影響 將獲得的粗酶液在pH 4.5～10.0條件下測(cè)木聚糖酶的活性,結(jié)果如圖6所示。由圖6可見,當(dāng)pH低于6.0時(shí),隨著pH的升高,木聚糖酶的活性逐步升高;當(dāng)pH超過6.0時(shí),隨著pH的升高,酶活性逐漸降低；當(dāng)pH值為10.0時(shí)酶活性達(dá)到最低值,僅為最高酶活性的10%。故Streptomycessp. ZJ-1產(chǎn)木聚糖酶的最適反應(yīng)pH值為6.0。

圖5 培養(yǎng)溫度(A)及培養(yǎng)時(shí)間(B)對(duì)木聚糖酶活性的影響

圖6 pH值對(duì)木聚糖酶活性的影響

2.3.2 溫度對(duì)酶活性的影響 獲得的木聚糖酶粗酶液在30～70 ℃條件下的活性如圖7A所示。從圖7A可以看出：當(dāng)溫度低于60 ℃時(shí),隨著溫度的升高,木聚糖酶的活性逐步升高;當(dāng)溫度超過60 ℃時(shí),酶活性有所降低,但仍保有最高時(shí)90%的相對(duì)酶活性。故Streptomycessp. ZJ-1產(chǎn)木聚糖酶的最適反應(yīng)溫度為60 ℃。另外,將木聚糖酶在35～70 ℃條件下放置1 h,然后測(cè)木聚糖酶的活性,結(jié)果圖7B所示,在低于55 ℃條件下,該酶能保持很好的穩(wěn)定性；當(dāng)溫度升高到60 ℃時(shí),喪失30%左右的酶活性;當(dāng)溫度升高到70 ℃時(shí),酶活性基本喪失,僅為原來的10%。

2.3.3 木聚糖酶酶解產(chǎn)物分析 以樺木木聚糖為底物的水解產(chǎn)物,經(jīng)薄層層析色譜圖分析均可觀察到木二糖、木三糖、木四糖及木五糖,但還有一些聚合度大于5的多糖(圖8)。

3 討論與小結(jié)

半纖維素是農(nóng)作物秸稈的重要組成部分,是世界上豐富的可再生有機(jī)資源。但由于其結(jié)構(gòu)復(fù)雜,用常規(guī)的方法難以將其充分降解,現(xiàn)在一般采用物理化學(xué)等預(yù)處理方法結(jié)合高效半纖維素降解菌來快速降解半纖維素。本實(shí)驗(yàn)通過木聚糖固體培養(yǎng)基分離篩選,結(jié)合透明圈的大小,從腐敗的甘蔗葉表面篩選到10株半纖維素降解菌,經(jīng)過對(duì)這10株菌株進(jìn)行木聚糖酶活性檢測(cè),最終選擇到1株具有高酶活性的菌株ZJ-1；經(jīng)16S rRNA序列同源性分析,菌株ZJ-1與Streptomycessp. WMMB 784的相似性為100%,初步確定該菌株屬于鏈霉菌(Streptomycessp.)。

圖7 溫度對(duì)木聚糖酶活性(A)及穩(wěn)定性(B)的影響

圖8 TLC分析木聚糖酶的水解產(chǎn)物

本研究篩選到的菌株Streptomycessp. ZJ-1具有較好的產(chǎn)木聚糖酶的能力,該菌在以CMC-Na為碳源,蛋白胨為氮源,初始培養(yǎng)pH 6.5～10.0,培養(yǎng)溫度為25 ℃的條件下,連續(xù)培養(yǎng)6 d,其產(chǎn)木聚糖酶的活性達(dá)40.0 U/mL。酶學(xué)性質(zhì)初步研究結(jié)果表明, ZJ-1所產(chǎn)木聚糖酶的最適反應(yīng)溫度為60 ℃,最適反應(yīng)pH為6.0；其酶解產(chǎn)物包括木二糖、木三糖、木四糖及木五糖。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果為該菌株與其它菌株組成混合菌群進(jìn)行甘蔗葉的降解奠定了基礎(chǔ)。

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(責(zé)任編輯:黃榮華)

Identification of A Xylanase-producing Bacterial Strain,Optimization of Its Xylanase-producing Conditions,and Properties of Produced Xylanase

YAO Jian, CHEN Qing-long, ZHANG Cheng, ZHONG Guo-xiang, WANG Hong-xiu, MA Ji-ping

(Institute of Agricultural Applied Microbiology, Jiangxi Academy of Agricultural Sciences, Nanchang 330200, China)

A novel bacterial strain ZJ-1 producing xylanase was isolated from the decomposed sugarcane leaves by using the methods of xylanase-hydrolyzing ring and extracellular enzymatic activity determination. The Blast of the 16S rRNA fragment in GenBank and the phylogenetic tree analysis indicated that the homology of ZJ-1 withStreptomycessp. (accession number: KC856931.1) was more than 98%. Therefore, ZJ-1 was identified asStreptomycessp. ZJ-1. Under the optimum xylanase-producing conditions (using CMC-Na as carbon source, using peptone as nitrogen source, pH 6.5～10.0 for initial culture, culture for 6 days at 25 ℃), the activity of xylanase produced by ZJ-1 reached 40.0 U/mL. The optimum reaction temperature and reaction pH-value for the produced xylanase were 60 ℃ and 6.0, respectively.

Xylanase;Streptomycessp.; Identification of bacterial strain; Optimization of xylanase-producing condition; Enzymatic property

2016-10-08

江西省青年科學(xué)基金項(xiàng)目(20142BAB214010);科技部國際科技合作項(xiàng)目“農(nóng)村有機(jī)廢棄物資源化利用技術(shù)合作研究” (2012DFA91160);公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201103007、201203072、201303080)。

姚健(1982─),女,山東濰坊人,助理研究員,博士,主要從事微生物及微生物基因資源篩選研究。

Q559

A

1001-8581(2017)02-0090-05