唐會(huì)會(huì)+鄭玉才+王鵬非+金素鈺+黃林

摘要：測(cè)定牦?；蛐蛄?，并比較其在牦牛和雄性不育犏牛睪丸組織中的表達(dá)差異，以探究該基因與犏牛雄性不育的關(guān)系。從牦牛睪丸組織中提取總RNA，采用RT-PCR技術(shù)克隆并測(cè)序獲得牦?；虻腸DNA序列；利用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)檢測(cè)該基因在牦牛與犏牛睪丸組織中的表達(dá)情況。結(jié)果表明：克隆獲得的牦牛Prdx5序列長(zhǎng)759 bp，包含長(zhǎng)660 bp的CDS區(qū)，該序列與普通?；蛳嗖?個(gè)堿基，序列同源性為99.47%，相差的4個(gè)核苷酸導(dǎo)致推導(dǎo)的氨基酸序列存在3個(gè)氨基酸殘基差異；[WTBX][STBX]Prdx5[WTBZ][STBZ]在牦牛和犏牛睪丸組織中均有表達(dá)，在牦牛睪丸組織中的表達(dá)量極顯著高于犏牛（P<0.01），是犏牛睪丸組織中表達(dá)量的6倍，提示Prdx5在犏牛睪丸組織中低水平表達(dá)可能與其雄性不育有關(guān)。

關(guān)鍵詞：牦牛；雜交雄性不育；[WTBX][STBX]PRDX5[WTBZ][STBZ]基因；基因表達(dá)；睪丸

中圖分類號(hào)： Q785；S823.8文獻(xiàn)標(biāo)志碼：

文章編號(hào)：1002-1302（2016）08-0053-04

過(guò)氧化物氧化還原酶（Peroxiredoxin，PRDX）家族是過(guò)氧化物酶超家族成員[1]，廣泛分布于原核及真核生物體內(nèi)[2-3]。該家族蛋白利用其N-端保守的Cys殘基催化還原細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS），從而保護(hù)細(xì)胞免受內(nèi)外界環(huán)境中氧化脅迫帶來(lái)的損害，是一類巰基依賴性抗氧化蛋白酶[3]。PRDX5別稱AOEB166、PMP20、AOPP，是哺乳動(dòng)物Prx家族中唯一的非典型2-Cys Prx [4]，主要分布于細(xì)胞的線粒體、溶酶體、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核中[5-8]。該酶不僅在免疫調(diào)控[9]、細(xì)胞凋亡[10]、信號(hào)通路調(diào)節(jié)[11]等方面發(fā)揮作用，其功能主要在于還原細(xì)胞內(nèi)過(guò)量的ROS。過(guò)量的ROS會(huì)引起細(xì)胞及組織損傷，對(duì)動(dòng)物精子細(xì)胞更易造成損害，使精子細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化、DNA結(jié)構(gòu)破壞、凋亡加速，最終導(dǎo)致哺乳動(dòng)物雄性不育[12]。據(jù)估計(jì)，約1/4不育男性患者精液中ROS水平升高[13-14]。PRDX5能以高效的還原能力[15]保護(hù)精子免受氧化脅迫損害，因此Prdx5水平偏低可能與哺乳動(dòng)物雄性不育有關(guān)。

牦牛（Bos grunniens）是青藏高原特有牛種，其與普通牛（Bos taurus）的雜交后代（犏牛）表現(xiàn)出F1至F3代雄性不育，這極大限制了犏牛雜種優(yōu)勢(shì)的固定，是牦牛雜交改良的一大難題。目前，有關(guān)犏牛雄性不育分子機(jī)制研究的相關(guān)基因如b-Boule[16]、[WTBX][STBX]Dmrt7[WTBZ][STBZ][17]、[WTBX][STBX]Sycp3[WTBZ][STBZ][18]、[WTBX][STBX]Fabp5、Fabp9[WTBZ][STBZ][19]、[WTBX][STBX]Piwil1[WTBZ][STBZ][20]、Bvh[21]、Ldhc[22]等，主要涉及精子減數(shù)分裂阻滯、能量代謝、DNA甲基化、轉(zhuǎn)錄調(diào)控等方面，但從睪丸過(guò)氧脅迫角度探究犏牛雄性不育的機(jī)制尚未見(jiàn)報(bào)道。對(duì)牦牛與犏牛睪丸組織蛋白質(zhì)組學(xué)研究結(jié)果進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，牦牛睪丸PRDX5蛋白水平遠(yuǎn)高于犏牛（約3.9倍），過(guò)低的PRDX5蛋白水平可能會(huì)使犏牛睪丸組織遭受ROS氧化脅迫，影響精子的正常發(fā)生。本研究通過(guò)基因克隆的方法獲得了牦牛[WTBX][STBX]PRDX5[WTBZ][STBZ]基因的完整編碼區(qū)序列，并比較了牦牛與普通牛的基因序列及氨基酸序列；同時(shí)利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法分析該基因在牦牛和犏牛睪丸組織中的mRNA水平，以探索[WTBX][STBX]PRDX5[WTBZ][STBZ]基因表達(dá)水平與犏牛雄性不育的關(guān)聯(lián)。

1材料與方法

1.1材料

供試成年牦牛（n=9）及犏牛（n=7）的睪丸組織均于秋季采自四川省成都市青白江區(qū)屠宰場(chǎng)，采集后立即放入液氮速凍并送回實(shí)驗(yàn)室。所有樣品均于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2方法

1.2.1[WTBX][STBX]PRDX5[WTBZ][STBZ]基因的克隆測(cè)序

利用TRIzol試劑（Invitrogen公司）按照其產(chǎn)品操作說(shuō)明從睪丸組織中提取總RNA。以牦?？俁NA為模板，以O(shè)ligo（dT）18為反轉(zhuǎn)錄引物，采用RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit（Thermo公司）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈。根據(jù)已公布普通牛的[WTBX][STBX]Prdx5[WTBZ][STBZ]核酸序列（GenBank登錄號(hào)：NM_174749），運(yùn)用Primer Premier 5.0軟件在該序列的CDS區(qū)兩側(cè)設(shè)計(jì)PCR特異引物，即F：5′-TCCGCCCAGCCTTCTACCTC-3′；R：5′-GAAAGGGCCGGAGGAGGATAT-3′。以cDNA為模板，按照如下程序進(jìn)行擴(kuò)增：95 ℃預(yù)變性4 min；95 ℃變性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸90 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。預(yù)期能擴(kuò)增出包含[WTBX][STBX]PRDX5[WTBZ][STBZ]基因CDS區(qū)在內(nèi)的759 bp的片段。PCR產(chǎn)物采用2.0%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)E.Z.N.A.TM Cycle-Pure Kit（OMEGA公司）純化后連接到pMD19-T載體（TaKaRa公司），再轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α宿主中進(jìn)行克隆?？拱逼S重組篩選后挑選出20個(gè)陽(yáng)性單克隆進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，經(jīng)菌液PCR鑒定后，將含有目的片段的單克隆雙向測(cè)序，測(cè)序引物為pUC系列載體通用引物M13F及M13R。

1.2.2牦牛[WTBX][STBX]PRDX5[WTBZ][STBZ]基因的序列特征分析在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中使用Blast工具將所測(cè)序列與野牦牛、普通牛的cDNA序列進(jìn)行同源性比對(duì)，并在該數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)其編碼的氨基酸序列。使用蛋白質(zhì)預(yù)測(cè)在線分析軟件Phyre2（http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html）對(duì)Prdx5編碼的氨基酸序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.2.3牦牛及犏牛睪丸中基因豐度檢測(cè)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對(duì)牦牛及犏牛睪丸組織中的[WTBX][STBX]PRDX5[WTBZ][STBZ]基因mRNA表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)克隆測(cè)序后的cDNA序列以及普通牛內(nèi)參基因Gapdh、18S rRNA序列信息，采用Primer Premier 5.0軟件分別設(shè)計(jì)定量PCR特異引物（表1）。提取的總RNA經(jīng)質(zhì)量檢測(cè)合格后，取4 μg利用上述試劑盒自帶的隨機(jī)六聚體引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA作[HJ1.4mm]為定量模板。PCR反應(yīng)體系為：QuantiFastTM SYBR Green PCR Master mix（QIAGEN公司）12.5 μL、上下游引物各1 μL、模板1 μL、ddH2O 9.5 μL，總體積共25 μL。PCR程序?yàn)椋篬HJ]預(yù)變性95 ℃ 5 min；變性95 ℃ 15 s，引物退火（退火溫度詳見(jiàn)表1）20 s，72 ℃ 延伸15 s，共40個(gè)循環(huán)。定量PCR檢測(cè)分為牦牛組和犏牛組，組內(nèi)每個(gè)樣品[JP3]同時(shí)檢測(cè)目的基因和2個(gè)內(nèi)參基因，每個(gè)基因設(shè)3個(gè)平行重復(fù)。

1.2.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析每個(gè)樣品的檢測(cè)結(jié)果利用2個(gè)內(nèi)參基因CT值的幾何平均數(shù)對(duì)目的基因進(jìn)行校正。牦牛和犏牛組間相對(duì)表達(dá)水平使用2-ΔΔCT法[23]進(jìn)行計(jì)算；采用SPSS 13.0軟件對(duì)2組數(shù)據(jù)進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析，以α=0.05作為差異顯著標(biāo)準(zhǔn)。[FL）]

2結(jié)果與分析

2.1牦牛[WTBX][STBX]PRDX5[WTBZ][STBZ]基因的克隆測(cè)序

采用RT-PCR方法對(duì)牦牛睪丸組織中的基因進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，獲得1條特異的與預(yù)期大小相一致的DNA片段（圖1）。該片段經(jīng)克隆測(cè)序顯示其長(zhǎng)度為759 bp，包含長(zhǎng)660 bp的完整CDS區(qū)，與普通牛[WTBX][STBX]PRDX5[WTBZ][STBZ]序列比對(duì)證實(shí)該片段為牦牛[WTBX][STBX]PRDX5[WTBZ][STBZ]基因序列。相差4個(gè)堿基，其CDS區(qū)的227、231、433、476位堿基依次為A、A、G、A，普通牛則為G、G、A、G。4個(gè)堿基差異導(dǎo)致牦牛與普通牛氨基酸序列存在3處差異，即牦牛的76、145、159位氨基酸依次為Glu、Ala、Asn，普通牛則為Gly、Thr、Ser，氨基酸序列相似性為98.63%。

牦牛[WTBX][STBX]PRDX5[WTBZ][STBZ]基因推導(dǎo)的氨基酸序列含219個(gè)氨基酸殘基，是一個(gè)肽前體，其N-末端Met1至Met58區(qū)段為定位于線粒體的導(dǎo)肽，除導(dǎo)肽以外的肽段部分為成熟肽；成熟肽的C-末端還存在靶向進(jìn)入過(guò)氧化物酶體的SQL信號(hào)序列[24]。Prdx5成熟肽段區(qū)共有3個(gè)Cys殘基，其中Cys47為該酶保守的催化殘基，Cys151為還原活性必需的非典型Cys殘基，2個(gè)活性Cys殘基周圍高度保守的特征序列分別為“PGAFTPGCSKTHLPGF”、“LNVEPDGTGLTCSLA”[24]（圖2）。件]序列及內(nèi)參基因信息設(shè)計(jì)特異定量引物，定量PCR擴(kuò)增獲得的溶解曲線峰形單一，表明特異性好。所建立的所有基因標(biāo)準(zhǔn)曲線顯示，擴(kuò)增效率均落在 95%～105%范圍內(nèi)，符合相應(yīng)算法要求。定量結(jié)果分析表明，[WTBX]]基因在牦牛和犏牛睪丸組織中均有表達(dá)，在牦牛睪丸組織中的表達(dá)量極顯著高于犏牛（P<0.01），是犏牛睪丸組織中表達(dá)量的6倍（圖3）。

3結(jié)論與討論

本研究成功克隆并獲得了牦牛睪丸組織基因的cDNA序列。牦牛[WTBX][STBX]Prdx5[WTBZ][STBZ]所編碼的氨基酸序列與普通牛相似性為98.63%，相差3個(gè)氨基酸殘基，但均不位于該酶的活性保守區(qū)內(nèi)，表明該基因在進(jìn)化上具有較高的保守性[2]。有差異的3個(gè)氨基酸殘基均位于成熟肽段內(nèi)；從差異氨基酸極性上看，3個(gè)氨基酸中有2個(gè)在牦牛和普通牛中不變，僅145位氨基酸殘基在普通牛中為極性的Thr，而牦牛中為非極性的Ala。這種極性的差異是否導(dǎo)致空間結(jié)構(gòu)的變化，最終影響該酶在牦牛中的功能尚需進(jìn)一步研究。

哺乳動(dòng)物精細(xì)胞中的ROS對(duì)于受精、染色質(zhì)濃縮、細(xì)胞膜的重構(gòu)、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的激活、精子獲能、頂體反應(yīng)是必不可少的[25]。哺乳動(dòng)物精細(xì)胞膜由大量不飽和脂肪酸組成，且細(xì)胞質(zhì)僅存有低濃度可抵抗ROS的酶，因此氧化脅迫極易導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化而首先破壞精子細(xì)胞膜。此外，過(guò)量的ROS會(huì)影響精子運(yùn)動(dòng)，損壞DNA結(jié)構(gòu)，加速精細(xì)胞凋亡，引起精子數(shù)目減少、活力降低、功能損傷，最終導(dǎo)致雄性不育或胚胎發(fā)育異常[12]。Leyens等研究了[WTBX][STBX]Prdx5[WTBZ][STBZ]在普通牛的腦、心、腎、睪丸等22個(gè)組織中的表達(dá)情況，結(jié)果表明[WTBX][STBX]Prdx5[WTBZ][STBZ]在睪丸組織中的表達(dá)量最高，且遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他組織[24]，提示[WTBX][STBX]PRDX5[WTBZ][STBZ]基因的高表達(dá)可能與牛的繁育功能密切相關(guān)。本研究實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果分析顯示，[WTBX][STBX]Prdx5[WTBZ][STBZ]在牦牛睪丸組織中的表達(dá)量是犏牛的6倍，這與筆者所在課題組前期蛋白質(zhì)組學(xué)分析得到的結(jié)果相一致，即PRDX5蛋白在牦牛睪丸組織中的含量是犏牛的6倍。Knoops等通過(guò)比較PRDX5催化過(guò)氧化氫與有機(jī)過(guò)氧化物的速率，認(rèn)為PRDX5能更高速特異地還原脂質(zhì)過(guò)氧化物[4]，提示[WTBX][STBX]PRDX5[WTBZ][STBZ]基因的表達(dá)水平可能對(duì)精子細(xì)胞膜完整性及精子的存亡具有重要意義。PRDX5定位于精子的頭部和線粒體膜間隙，其表達(dá)水平對(duì)精子DNA的完整性及精子運(yùn)動(dòng)能力均產(chǎn)生影響[26]。此外，細(xì)胞中過(guò)量的過(guò)氧氮族（reactive nitrogen species，RNS）可使睪丸功能紊亂、促性腺激素分泌降低，從而對(duì)哺乳動(dòng)物的生殖能力造成損害[27]。PRDX5作為一種過(guò)氧亞硝基還原酶，能高速催化還原過(guò)氧亞硝基[15，28]，保護(hù)睪丸組織內(nèi)細(xì)胞免遭過(guò)氮脅迫。相對(duì)于牦牛而言，犏牛睪丸組織中[WTBX][STBX]Prdx5[WTBZ][STBZ]基因的低表達(dá)水平可能導(dǎo)致精子損傷凋亡[18]，從而使睪丸組織功能紊亂、激素水平改變以致雄性不育，[WTBX][STBX]PRDX5[WTBZ][STBZ]基因的表達(dá)水平可能與犏牛雄性不育有關(guān)。

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