閔勇+徐琳+劉曉艷+高天雨+王開梅+楊自文

摘要：通過48孔板微培養(yǎng)的方法對336株芽孢桿菌菌株進(jìn)行黃曲霉毒素B1生物降解菌的快速篩選，獲得14株能在以香豆素作為惟一碳氮源的培養(yǎng)基中生長的芽孢桿菌菌株。在投料濃度為100 μg/kg條件下，對這14株芽孢桿菌進(jìn)行復(fù)篩，獲得1株黃曲霉毒素B1降解率為83.20%的芽孢桿菌菌株。通過16S rDNA序列比對分析，初步確定這株芽孢桿菌為巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）。

關(guān)鍵詞：黃曲霉毒素B1；生物降解；香豆素；巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）

中圖分類號：S852.66 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）20-5249-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.20.021

Abstract： Rapid screening of Aflatoxin B1 biodegration strains was carried out through microcultivation in 48 rectangular well deep well plates. 336 Bacillus strains were screened and 12 strains could grow in the media using coumarin as the sole source of energy and carbon. The 14 strains were re-screened in the media containing 100 μg/kg Aflatoxion B1. One strain which the biodegration ratio of Aflatoxin B1 reached 83.2% was obtained. After gene sequencing and sequence alignment of 16S rDNA，the strain was preliminarily identified as Bacillus megaterium.

Key words： Aflatoxin B1； biodegration； coumarin； Bacillus megaterium

黃曲霉毒素（Aflatoxin AFT）是由黃曲霉（Aspergillus flavus）、寄生曲霉（Aspergillus parasiticus）和特異曲霉（Aspergillus nomius）等多種真菌在生長過程中產(chǎn)生并分泌的一類結(jié)構(gòu)相似的次級代謝產(chǎn)物，主要包括AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1、AFM2、AFB2a、AFG2a、AFBM2a和AFGM2a等，其中黃曲霉毒素B1（AFB1）分布范圍最廣、化學(xué)性質(zhì)最穩(wěn)定，且是黃曲霉毒素中毒性最強(qiáng)的，具有很強(qiáng)的致癌性、致突變性、致畸性和強(qiáng)免疫抑制性等作用[1]。黃曲霉毒素常存在于各種動物飼料和人類食品中。用污染的飼料飼養(yǎng)畜禽，會導(dǎo)致肉、乳及其制品的污染，人類食用被污染的食品會導(dǎo)致急性中毒，引起肝臟壞死出血，慢性中毒可引起肝癌，嚴(yán)重的可造成死亡[2，3]。因此，在實(shí)踐中采取必要可行的措施減少和消除AFB1帶來的危害刻不容緩。

AFB1的傳統(tǒng)脫毒方法有堿處理法、氧化處理法、高溫法、吸附劑法和抗氧化劑法等。但是這些方法具有破壞營養(yǎng)、去毒不徹底和成本高等缺陷，實(shí)際的防控和脫毒效果并不理想[1，4]。目前，AFB1的生物脫毒技術(shù)越來越成為研究的熱點(diǎn)，該技術(shù)主要利用微生物的代謝產(chǎn)物，如酶類，分解破壞AFB1產(chǎn)生低毒或無毒的降解產(chǎn)物。微生物及生物酶脫毒因具有解毒效率高、特異性強(qiáng)、對飼料和環(huán)境無污染等特點(diǎn)和優(yōu)勢而備受研究者重視。已發(fā)現(xiàn)多種微生物，包括細(xì)菌、放線菌、酵母菌、霉菌和藻類等均有降解AFB1的能力。

本研究以香豆素為惟一碳氮源，通過48孔板培養(yǎng)的方式對實(shí)驗(yàn)室保存的336株芽孢桿菌進(jìn)行初篩，將長勢良好的菌株與AFB1在48孔板中共培養(yǎng)，然后采用ELISA試劑盒測定AFB1降解率的方法進(jìn)行復(fù)篩，篩選到了2株高效降解AFB1的菌株，并對其中一株菌株進(jìn)行了16S rDNA鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)菌株：湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心從土樣中分離并保存的336株芽孢桿菌。

種子培養(yǎng)基LB配制方法參照文獻(xiàn)[5]；初篩培養(yǎng)基：KH2PO4 0.5 g、NH4NO3 2.0 g、CaCO3 2.0 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、FeSO4 20 mg，溶于1 000 mL去離子水中（pH 7.0），121 ℃滅菌20 min，滅菌的無機(jī)鹽培養(yǎng)基與過濾除菌的0.2%香豆素水溶液等體積混合，即為初篩培養(yǎng)基；復(fù)篩培養(yǎng)基：酵母粉3.0 g、蛋白胨5.0 g、葡萄糖6.0 g、NaCl 10.0 g，溶于1 000 mL去離子水中（pH 7.0）。

1.2 方法

1.2.1 芽孢桿菌活化 在48孔板中每孔各加入1 mL LB培養(yǎng)基，滅菌后接種芽孢桿菌菌株，將48孔板置于96孔板混勻儀上于37 ℃、200～250 r/min條件下振蕩培養(yǎng)48 h。

1.2.2 AFB1生物降解菌的初篩 在滅菌后的48孔板中每孔加入800 μL的香豆素初篩培養(yǎng)基，吸取200 μL活化好的芽孢桿菌菌液并將其轉(zhuǎn)移至初篩培養(yǎng)基中，于30 ℃、200～250 r/min條件下振蕩培養(yǎng)72 h，挑取生長良好的菌落，轉(zhuǎn)接于新鮮的香豆素初篩培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，如此重復(fù)3～4次。

1.2.3 AFB1生物降解菌的復(fù)篩 為避免細(xì)胞在原環(huán)境中的碳氮源干擾，對能在以香豆素為惟一碳氮源培養(yǎng)基中生長的菌株進(jìn)行復(fù)篩。在48孔板中每孔加入800 μL復(fù)篩培養(yǎng)基，滅菌后接種需要進(jìn)行復(fù)篩的芽孢桿菌菌株。將48孔板置于96孔板混勻儀上，于30 ℃、200～250 r/min條件下振蕩培養(yǎng)24 h，然后每孔加入200 μL AFB1（500 μg/kg，終濃度為100 μg/kg），于30 ℃繼續(xù)振蕩培養(yǎng)72 h。

1.2.4 AFB1提取和競爭性酶聯(lián)免疫方法（ELISA）測定 提取方法參考文獻(xiàn)[6]，AFB1含量按間接競爭ELISA方法操作，具體見百奧森科技公司產(chǎn)品說明書，待測空白對照孔的AFB1終濃度為2 μg/kg。450 nm酶標(biāo)儀讀數(shù)，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算處理的AFB1含量及降解率。計(jì)算公式如下：

式中，x1代表空白對照AFB1含量（2 μg/kg）；x2代表處理的AFB1的含量；y代表降解率。

1.2.5 菌株的鑒定 ①形態(tài)觀察。菌株接種于LB培養(yǎng)基平板上，37 ℃培養(yǎng)48 h，觀察菌落形態(tài)、色澤，顯微鏡觀察細(xì)胞形狀等；②細(xì)菌16S rDNA序列測定。A.按照參考文獻(xiàn)[5]中方法提取細(xì)菌基因組DNA；B.16S rRNA基因序列的PCR，引物（27F 5′-AGAGTTTGATCC TGGCTCAG-3′；l492R 5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′）；C.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工生物工程有限公司純化、測序；D.測序結(jié)果在NCBI使用Blast比對，從GenBank數(shù)據(jù)庫中獲得與菌株16S rDNA同源的公認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)序列數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 AFB1降解菌株的初篩

通過48孔板微培養(yǎng)，對336株芽孢桿菌，共計(jì)7板菌株進(jìn)行了初篩，經(jīng)過3次轉(zhuǎn)接，獲得14株能在以香豆素作為惟一碳氮源的培養(yǎng)基中生長的芽孢桿菌菌株（表1）。

2.2 AFB1標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

將系列AFB1標(biāo)準(zhǔn)溶液（0、0.10、0.25、0.50、1.00、2.00 μg/kg）測得的吸光度OD值，測得不同AFB1含量下對應(yīng)的吸光度A450，如表2所示。

以橫坐標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的常用對數(shù)值（lgC），縱坐標(biāo)為各標(biāo)準(zhǔn)孔OD值與0 μg/kg標(biāo)準(zhǔn)孔OD值的比值[B樣品/B（0 μg/kg）]，繪制散點(diǎn)圖并添加線性趨勢線，得到AFB1標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。由圖1可知，AFB1含量與各標(biāo)準(zhǔn)孔OD值與0 μg/kg標(biāo)準(zhǔn)孔OD值的比值[B樣品/B（0 μg/kg）]的關(guān)系式，即線性回歸方程y=-29.503x+84.158，R2=0.995 9，說明變量y的變異中有99.59%是由變量x引起的，擬合優(yōu)度較好，故可根據(jù)此方程來計(jì)算AFB1的含量。

2.3 AFB1降解菌株的復(fù)篩

篩選出的14株芽孢桿菌菌株降解AFB1能力的結(jié)果見表3。由表3可知，14株芽孢桿菌均具有降解AFB1的能力，根據(jù)空白對照AFB1含量為2 μg/kg，計(jì)算各處理降解率。其中，CC6菌株和EF4菌株AFB1降解率分別達(dá)83.20%和79.10%，明顯優(yōu)于其他菌株。

2.4 菌株分子鑒定

將CC6芽孢桿菌菌株16S rDNA基因序列在NCBI中經(jīng)Blast比對，從GenBank數(shù)據(jù)庫中獲得有關(guān)種的公認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)序列數(shù)據(jù)進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析（圖2）。由圖2可知，CC6菌株與巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）位于同一個(gè)分支，同源性達(dá)100%。

3 小結(jié)與討論

本研究通過48孔長方形深孔板微生物培養(yǎng)的方法，對實(shí)驗(yàn)室保存的336株芽孢桿菌菌株進(jìn)行了AFB1生物降解菌的快速篩選，獲得14株能在以香豆素作為惟一碳氮源的培養(yǎng)基上生長的菌株。通過添加AFB1作為底物，對這14株芽孢桿菌進(jìn)行復(fù)篩，在AFB1投料濃度為100 μg/kg的條件下，篩選得到兩株降解率分別為83.20%和79.10%的菌株。本研究再次驗(yàn)證使用香豆素作為惟一碳氮源篩選AFB1生物降解菌株是一種簡潔、快速和安全的方法[6]。經(jīng)過16S rDNA序列測定和GenBank數(shù)據(jù)庫序列比對分析，初步確定降解效率最高的芽孢桿菌CC6為巨大芽孢桿菌。相比其他研究中篩選得到的真菌和假單胞菌等菌株，芽孢桿菌在實(shí)際應(yīng)用方面具有更大的優(yōu)勢。

本研究采用了酶聯(lián)免疫法（ELISA）檢測待測樣品中AFB1的濃度?；诳乖贵w特異性反應(yīng)建立起來的酶聯(lián)免疫吸附分析法，具有特異性強(qiáng)、分析時(shí)間短的特點(diǎn)，而且其靈敏度與薄層層析法或高效液相色譜法相當(dāng)或更高，發(fā)酵液提取均可在48孔板中完成，操作方便，提取后即可直接測定，不需要凈化過程，一次可測定大量樣本。

與國內(nèi)其他AFB1生物降解菌篩選的研究相比，在菌株的培養(yǎng)方面首次提出了48孔長方形深孔板培養(yǎng)的方法。48孔長方形深孔板每孔的體積為5 mL，選擇的裝量為1 mL，與常用的96孔正方形深孔板相比，48孔板裝量更大，振蕩培養(yǎng)時(shí)更容易形成湍流，可以保證菌株生長過程獲得充足的氧氣，此時(shí)菌體生長和產(chǎn)物合成的變化趨勢均與搖瓶培養(yǎng)過程非常相似。通過48孔板培養(yǎng)的方式，可以明顯提高初篩與復(fù)篩的效率，培養(yǎng)基消耗也少，具有環(huán)保、高效、便捷的優(yōu)點(diǎn)。

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