李響?yīng)おざおげ?2,3

(1.中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院,青島266003;2.中國海洋大學(xué)海洋生物多樣性與進(jìn)化研究所,青島266003;3.青島海洋科學(xué)與技術(shù)國家實(shí)驗(yàn)室,青島266100)

CRISPR/Cas9技術(shù)及其在海洋生物中的應(yīng)用現(xiàn)狀與展望

李響1董波1,2,3

(1.中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院,青島266003;2.中國海洋大學(xué)海洋生物多樣性與進(jìn)化研究所,青島266003;3.青島海洋科學(xué)與技術(shù)國家實(shí)驗(yàn)室,青島266100)

CRISPR系統(tǒng)是細(xì)菌對抗噬菌體和外源質(zhì)粒的一種獲得性免疫系統(tǒng),基于細(xì)菌Ⅱ型CRISPR系統(tǒng)開發(fā)的CRISPR/Cas9技術(shù)體系是目前適用范圍最廣、效率最高的基因編輯工具。與鋅指核酸酶(Zinc-finger nucleases,ZFN)技術(shù)和類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶(Transcriptionactivatorlikeeffectornucleases,TALEN)技術(shù)相比,CRISPR/Cas9具有簡便、高效、廉價等優(yōu)點(diǎn)。目前CRISPR/Cas9技術(shù)已經(jīng)成功應(yīng)用于大多數(shù)模式生物的基因編輯,但其在海洋生物中的應(yīng)用才剛剛開始。文章將從CRISPR/Cas9技術(shù)入手,介紹其發(fā)展過程、作用機(jī)制、應(yīng)用現(xiàn)狀,并分析其在海洋生物中的應(yīng)用與前景展望,以期推動這一技術(shù)在更多海洋生物研究中得到應(yīng)用,解決限制海洋生物功能基因驗(yàn)證和深度開發(fā)海洋生物基因資源等方面的難題。

CRISPR/Cas9;基因編輯;海洋生物;功能驗(yàn)證;基因資源

21世紀(jì)被稱為“海洋的世紀(jì)”,占地球表面積71%的海洋,孕育著數(shù)量龐大的海洋生物,截止2007年中國海域記錄的海洋生物種類為22629種[1],并不斷有新報道的海洋物種。這些海洋生物中一部分是人類重要的食物來源,如魚蝦貝藻等經(jīng)濟(jì)種類都是我國人民餐桌上的美味。另外,由于某些海洋生物為適應(yīng)海洋環(huán)境所進(jìn)化形成的獨(dú)特身體結(jié)構(gòu),使其成為生物學(xué)基礎(chǔ)研究的優(yōu)良模式生物。海膽是人類較早使用的模式生物,早在19世紀(jì)90年代,科學(xué)家就用海膽作為材料開展了受精生物學(xué)和發(fā)育生物學(xué)的研究,證明了動物胚胎發(fā)育存在調(diào)整型發(fā)育[2]。尾索動物海鞘由于其卵和幼體透明,結(jié)構(gòu)簡單,基因組較小且為單拷貝,并且在進(jìn)化上是最接近脊椎動物的無脊椎動物,也是人們較早利用開展進(jìn)化發(fā)育生物學(xué)研究的模式動物[3]。鑒于海洋生物的經(jīng)濟(jì)和科研價值,對其基礎(chǔ)及應(yīng)用研究也在不斷深入。

近十年來,隨著第二代高通量測序技術(shù)的發(fā)展,



玻璃海鞘(Ciona intestinalis)[4]、薩氏海鞘Ciona savignyi)[5]、海膽(Strongylocentrotus purpuratus)[6]、住囊蟲(Oikopleura dioica)[7]、佛羅里達(dá)文昌魚(Branchiostoma floridae)[8]、牡蠣(Crassostrea gigas)[9]、半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis)[10]、大黃魚(Larimichthys crocea)[11]、海帶(Saccharina japonica)[12]等大量海洋生物的基因組被測定,這為海洋生物學(xué)的研究者們提供了比以往更加豐富的遺傳基因資源。然而海洋生物普遍存在生長周期長,生活環(huán)境復(fù)雜的特點(diǎn),大多難以在實(shí)驗(yàn)室條件下長期養(yǎng)殖,僅僅依靠傳統(tǒng)的正向遺傳學(xué)方法進(jìn)行研究費(fèi)時費(fèi)力,已經(jīng)明顯不能滿足現(xiàn)實(shí)的要求。面對這些龐大的數(shù)據(jù),海洋生物學(xué)家們需要有更強(qiáng)大的分子生物學(xué)工具,特別是基因編輯工具的支持,才能更為有效地利用海洋生物基因資源。CRISPR/Cas9技術(shù)是近三年來高速發(fā)展的一種基因編輯技術(shù),2013年、2015年先后兩次被Science雜志評為當(dāng)年的十大科學(xué)突破,2015年更是位居榜首。CRISPR技術(shù)自2013年首次應(yīng)用于人類細(xì)胞后[13—15],已在多個物種中取得成功,成為眾多研究者操作基因組的不二選擇。本文將從CRISPR/Cas9技術(shù)入手,介紹其發(fā)展過程及其在海洋生物中的應(yīng)用現(xiàn)狀和前景展望,以期推動這一技術(shù)在海洋生物研究中得到廣泛應(yīng)用。

1 基因編輯技術(shù)的發(fā)展歷史與現(xiàn)狀

基因編輯技術(shù)是反向遺傳學(xué)的重要研究手段。在反向遺傳學(xué)的發(fā)展過程中,曾經(jīng)出現(xiàn)了大量的實(shí)用技術(shù)。早在1979年,Scherer和Davis就利用同源重組的方法編輯了釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的基因,成功構(gòu)建了刪除his3基因的菌株和在染色體XV中插入半乳糖誘導(dǎo)區(qū)的菌株[16]。1985年,Smithies等[17]又利用同源重組的方法編輯了人類細(xì)胞的基因。20世紀(jì)90年代中后期至21世紀(jì)初,又相繼誕生了RNA干擾[18]、基因敲降技術(shù)[19,20],大大加速了分子生物學(xué)的研究進(jìn)程。人工核酸酶技術(shù)是最近幾年出現(xiàn)的一種全新的基因編輯技術(shù)。人工核酸酶是一類人工構(gòu)建的能識別特定DNA序列并能在DNA分子上形成雙鏈切割(Double strandbreaks,DSB)的核酸酶。受損的DNA通過兩種修復(fù)機(jī)制,既非同源末端連接(Non-homologous endjointing,NHEJ)和同源重組(Homologousrecombination,HR)[21—23]進(jìn)行修復(fù)。在哺乳動物細(xì)胞中非同源末端連接是一種重要的易錯修復(fù)機(jī)制,在修復(fù)過程中,DNA雙鏈?zhǔn)軗p部位會插入或缺失部分堿基,當(dāng)這種插入或缺失處于基因開放閱讀框內(nèi),并且插入或缺失堿基數(shù)不為3或3的倍數(shù)時,就會造成開放閱讀框的移碼突變,使這個開放閱讀框的信息不能正確翻譯,從而起到基因敲除的作用[24]。而在釀酒酵母細(xì)胞中,同源重組則是一種占統(tǒng)治地位的修復(fù)機(jī)制,二倍體釀酒酵母通過另一條染色體作為提供正確片段的供體來修復(fù)受損的DNA,當(dāng)人工核酸酶的切割發(fā)生在單倍體釀酒酵母中時,通過提供人工設(shè)計的供體,可實(shí)現(xiàn)對單倍體釀酒酵母的定點(diǎn)基因編輯[25]。人工核酸酶技術(shù)經(jīng)過近幾年的發(fā)展,形成了3種代表性的技術(shù),即鋅指核酸酶技術(shù)(Zincfingernucleases,ZFN)、類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶技術(shù)(Transcriptionactivator-likeeffectornuclease,TALEN)和CRISPR/Cas9技術(shù)。

鋅指核酸酶,是第一代人工核酸酶技術(shù)。鋅指蛋白,最早于1985年在非洲爪蟾(Xenopus laevis)的轉(zhuǎn)錄因子TFIIIA中發(fā)現(xiàn)[26]。1988年Frankel和Pabo將鋅指蛋白定義為調(diào)節(jié)蛋白中的一些依賴鋅離子的DNA結(jié)合域,這些氨基酸序列富含Cys殘基,并通過與鋅離子的結(jié)合而形成穩(wěn)定的手指狀結(jié)構(gòu),故名鋅指蛋白[27]。通常,每個鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域可以識別3個堿基,將3—6個鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域相連即可識別連續(xù)的9—18個堿基[28]。約翰霍普金斯大學(xué)的Kim等[29]最先將鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域與限制性核酸內(nèi)切酶FokⅠ的催化結(jié)構(gòu)域融合,獲得了具有新識別特性的核酸內(nèi)切酶。當(dāng)2個FokⅠ結(jié)構(gòu)域形成二聚體時,能實(shí)現(xiàn)對DNA的雙鏈切割,因此必須在靶點(diǎn)兩側(cè)設(shè)計2個串聯(lián)鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域才能實(shí)現(xiàn)對靶點(diǎn)的精確切割。構(gòu)建鋅指核酸酶的主要方法有:Wright等[30]最早使用的模塊組裝法(Modularassembly, MA)、Sangamo公司的專利技術(shù)CompoZr方法以及“鋅指聯(lián)合會”提出的開源在線設(shè)計軟件ZiFiTTargete(http://zifit.partners.org/ZiFiT/)等[31]。

類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶(TALEN),屬于第二代人工核酸酶系統(tǒng),被Science評為2012年的十大科學(xué)突破。TALEN技術(shù)基于一類來自于植物病原黃單胞桿菌(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria)的蛋白TALE蛋白家族,AvrBs3是該家族第一個被發(fā)現(xiàn)的成員[32]。TALE蛋白類似于真核生物的轉(zhuǎn)錄因子,可以識別特異的DNA序列進(jìn)而調(diào)控宿主植物內(nèi)源基因的表達(dá)[33]。TALE蛋白肽鏈中部是由1—33個長度約33—35個氨基酸殘基的重復(fù)單元和C端的長度為20個氨基酸殘基的半重復(fù)單元構(gòu)成的DNA識別和結(jié)合結(jié)構(gòu)域。重復(fù)單元中的+12和+13位置的氨基酸殘基是特異識別DNA堿基的關(guān)鍵位點(diǎn),稱為重復(fù)可變雙殘基(Repeatvariablediresidue,RVD)。對應(yīng)A、T、C、G四種堿基,最常見的RVD序列分別是NI(AsnIle)、NG(AsnGly)、HD(HisAsp)和NN(AsnAsn)。TALE相比鋅指蛋白最大的優(yōu)勢是DNA的堿基排列與重復(fù)單元有很好的一一對應(yīng)關(guān)系,而不存在鋅指蛋白的上下文效應(yīng)。TALEN技術(shù)的DNA切割結(jié)構(gòu)域與ZFN相同,都是FokⅠ,因此TALEN的作用靶點(diǎn)同樣需要成對設(shè)計。Bogdanove和Voytas[34]提出了TALEN靶位點(diǎn)選擇的原則并建立了最早的TALEN網(wǎng)站(https:// talent.cac.cornell.edu/)。上文提到的ZiFiT網(wǎng)站也提供TALEN靶點(diǎn)的設(shè)計工具。TALEN技術(shù)應(yīng)用的瓶頸在于重復(fù)序列的構(gòu)建,應(yīng)用中一般會選擇10bp以上的靶點(diǎn)序列,這就至少需要9.5個重復(fù)單元,每個重復(fù)單元33—35個氨基酸殘基,這個重復(fù)結(jié)構(gòu)的對應(yīng)的DNA序列總長將達(dá)到近1kb,利用常規(guī)方法構(gòu)建這一重復(fù)序列是十分困難的。針對這一重復(fù)序列,研究者們提出了GoldenGate、連續(xù)克隆組裝、固相合成、長粘末端組裝、單元組裝法等不同的組裝策略[34]。

2013年出現(xiàn)的CRISPR/Cas9技術(shù)改造自細(xì)菌的Ⅱ型CRISPR系統(tǒng),被稱為第三代人工核酸酶。相比ZFN和TALEN技術(shù),CRISPR技術(shù)更加簡便,在應(yīng)用中只用到Cas9蛋白和sgRNA兩個元件,針對不同的靶點(diǎn)序列只需改變sgRNA上約20nt的識別序列即可。同時,該技術(shù)低廉的價格和極高的突變效率,使其出現(xiàn)之后迅速在多種生物中得到成功應(yīng)用,逐步取代了ZFN和TALEN兩種技術(shù)。

2 CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)

2.1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)

CRISPR是Clusteredregularlyinterspacedshort palindromicrepeatsequences的縮寫,稱為成簇規(guī)律間斷短回文重復(fù)序列。Cas9則是CRISPRassociatedgene9的縮寫。CRISPR最早發(fā)現(xiàn)于1987年, Ishino等[35]在克隆大腸桿菌K12(Escherichia coli)的iap基因的時候發(fā)現(xiàn),在該基因3′非翻譯區(qū)中存在5個29個堿基對的重復(fù)序列,它們中間則是不重復(fù)的32個堿基對的間隔序列,但是文章中并沒有描述其具體功能。20世紀(jì)90年代,陸續(xù)在許多古生菌和細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)了類似的間斷重復(fù)序列,但是這些序列始終沒有統(tǒng)一的名稱[36—39]。2000年Mojica等[40]依照這些序列的結(jié)構(gòu)特點(diǎn),將其命名為短規(guī)律間隔重復(fù)序列(ShotRegularlySpacedRepeats,SDSRs)。2002年,Jansen等[41]將這種重復(fù)序列命名為CRISPR (Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeatsequences),指出該基因座由重復(fù)的repeat序列和位于其repeat序列中間的spacer序列組成;同時,研究者還在該基因座附近確定了4種Cas基因(CRISPR-associatedgene)的ORF,并將其命名為Cas1-4,其中Cas3預(yù)測具有DNA解旋酶的功能,而Cas4預(yù)測具有核酸外切酶的功能,但是CRISPR和Cas基因的具體功能當(dāng)時還未知。同年,Makarova等[42]提出這些ORF和CRISPR基因座可能構(gòu)成了一種潛在的DNA修復(fù)系統(tǒng)。2005年,Haft等[43]通過生物信息學(xué)方法確定了45種Cas蛋白家族,其中有1種預(yù)測為HNH結(jié)構(gòu)域核酸內(nèi)切酶的蛋白Csn1即后來被廣泛應(yīng)用的Cas9。Bolitin等[44]發(fā)現(xiàn)細(xì)菌CRISPR基因座中的spacer區(qū)有很多序列來源于噬菌體,并且細(xì)菌抵抗噬菌體侵襲的能力與其spacer序列的數(shù)量相關(guān)。Mojica等[45]也發(fā)現(xiàn),在多種細(xì)菌中都有一部分spacer序列來源于細(xì)菌以外的病毒、質(zhì)粒或非染色體成分,在釀膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes)菌株SF370中,甚至有超過90%的Spacer序列來源于噬菌體,這些spacer序列的存在與細(xì)菌對抗噬菌體的能力密切相關(guān)。2006年,Makarova等[46]提出Cas蛋白和CRISPR基因介導(dǎo)細(xì)菌以類似真核細(xì)胞RNA干擾的方式對抗侵入的質(zhì)粒和噬菌體。2007年,Barrangou等[47]發(fā)現(xiàn),細(xì)菌通過整合噬菌體基因組中的序列為自身新的spacer序列來獲得免疫該種噬菌體的能力,增添或刪除spacer序列將改變細(xì)菌對某些噬菌體的抗性。2008年,Brouns等[48]發(fā)現(xiàn)細(xì)菌CRISPR基因座編碼的pre-RNA經(jīng)過Cas蛋白的加工后產(chǎn)生的小crRNA可以介導(dǎo)細(xì)菌對病毒的免疫反應(yīng)。Koonin和Makarova[49]在2009年的綜述文章中總結(jié)了這一時期的工作,指出CRISPR系統(tǒng)是細(xì)菌的一種獲得性免疫系統(tǒng)。2009年Hale等[50]研究發(fā)現(xiàn)CRISPR系統(tǒng)可以在RNA的指導(dǎo)下切割RNA。2010年,Garneau等[51]發(fā)現(xiàn)CRISPR系統(tǒng)通過切割入侵的噬菌體或質(zhì)粒的DNA來實(shí)現(xiàn)對病原的免疫。2011年Deltcheva等[52]發(fā)現(xiàn)crRNA的成熟需要細(xì)菌體內(nèi)一種被稱為tracrRNA的小RNA介導(dǎo),并且需要Csn1蛋白(Cas9)和RNA酶III的參與。2011年,Sapranauskas等[53]證實(shí)Ⅱ型CRISPR系統(tǒng)僅需要Cas9一種蛋白參與即可完成切割DNA的過程。2012年8月,Jinek等[54]發(fā)現(xiàn)Cas9是一種由tracrRNA和crRNA介導(dǎo)的DNA內(nèi)切酶并提出了將CRISPR改造為基因編輯系統(tǒng)的設(shè)想。2013年1月,Cong等[13]和Mali等[15]在Science上同時發(fā)表各自的研究成果,首次在真核細(xì)胞中利用CRISPR技術(shù)實(shí)現(xiàn)了基因的定點(diǎn)突變。隨后,Jinek等[14]也在eLife上發(fā)表文章,驗(yàn)證了其2012年的設(shè)想,利用CRISPR在人類細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了基因的定點(diǎn)敲除。一個屬于CRISPR的新時代就此拉開了帷幕(圖1)。

2.2 CRISPR系統(tǒng)的分類和作用機(jī)制

CRISPR基因座廣泛存在于古細(xì)菌和細(xì)菌中,接近90%的古細(xì)菌和超過40%的細(xì)菌基因組或質(zhì)粒中含有至少1個CRISPR基因座[55]。根據(jù)構(gòu)成CRISPR系統(tǒng)的原件不同和crRNA成熟方式的差異,細(xì)菌的CRISPR系統(tǒng)可分為三種類型,稱為Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。其中Ⅱ型系統(tǒng)僅需要Cas9一種蛋白即可完成對外源DNA的雙鏈切割,因此最適合改造成人工核酸酶系統(tǒng)用于基因定點(diǎn)編輯[56,57]。典型的II型CRISPR基因座(CRISPRloucs)結(jié)構(gòu)如下, 5′端是可轉(zhuǎn)錄為tracrRNA的區(qū)域,中間是包括Cas9在內(nèi)的多種Cas蛋白的ORF區(qū)域,靠近3′端則是CRISPR重復(fù)間隔區(qū)域(CRISPRrepeat-spacer array)。整個CRISPR重復(fù)間隔區(qū)域由一段引導(dǎo)序列(Leadersequence)引導(dǎo),其下游是間隔分布的重復(fù)序列(Repeat),以及位于重復(fù)序列之間的間隔序列(Spacer),間隔序列起源于曾經(jīng)侵入的噬菌體或質(zhì)粒[56—59]。

圖1CRISPR技術(shù)的發(fā)現(xiàn)簡史(參考Hsu,et al.,2014)Fig.1MilestonestudiesinthediscoveryofCRISPR/Cas9techniqueforgenomeeditingandengineering

Ⅱ型CRISPR系統(tǒng)在細(xì)菌體內(nèi)作用過程可以分為三個階段(圖2)。第一階段是間隔序列的攝取。當(dāng)噬菌體首次入侵時,Cas蛋白識別噬菌體中的原型間隔序列臨近基序(ProtospacerAdjacentMotif Sequence,PAMSequence),并將噬菌體DNA裂解后的片段整合到宿主細(xì)菌的基因組的CRISPR基因座的間隔序列(Spacer)區(qū)域中。第二階段是crRNA和tracrRNA共同成熟及Cas9切割復(fù)合體的形成。在這一階段轉(zhuǎn)錄形成的前crRNA(Pre-crRNA)和未成熟的tracrRNA有部分片段以堿基互補(bǔ)的方式結(jié)合形成雙鏈RNA區(qū)域,同時Cas9蛋白會識別tracrRNA的莖環(huán)結(jié)構(gòu)并與之結(jié)合,隨后RNA酶Ⅲ對雙鏈RNA區(qū)域進(jìn)行切割,完成Pre-crRNA和tracrRNA的共同成熟,成熟的crRNA、tracrRNA和Cas9形成穩(wěn)定的Cas9切割復(fù)合體。第三階段是Cas9切割復(fù)合體對外源DNA的切割。在這一階段,crRNA會識別外源DNA中的一條鏈,以堿基互補(bǔ)的方式與之結(jié)合,位于Cas9蛋白N端的RuvC核酸酶結(jié)構(gòu)域和位于蛋白肽鏈中部的HNH核酸酶結(jié)構(gòu)域分別結(jié)合DNA的雙鏈并完成對DNA的雙鏈切割(Doublestrand breaks,DSBs)形成平末端。被切割的DNA在細(xì)菌體內(nèi)降解,完成細(xì)菌對噬菌體的免疫過程[52,54,58]。

2.3 CRISPR技術(shù)的應(yīng)用

CRISPR在基因敲除中的應(yīng)用通過將細(xì)菌CRISPR系統(tǒng)的元件導(dǎo)入真核細(xì)胞,可以在真核細(xì)胞的基因的特定位置上形成雙鏈切割,進(jìn)而激活修復(fù)機(jī)制,實(shí)現(xiàn)基因的定點(diǎn)敲除。在細(xì)菌中Ⅱ型CRISPR系統(tǒng)的必備元件包括crRNA、Cas9蛋白、tracrRNA三種成分,同時在crRNA的加工過程中還需要RNaseⅢ的參與[52]。而在真核細(xì)胞中,并不存在天然的pre-crRNA,只需導(dǎo)入成熟的crRNA即可,因此不需要RNA酶Ⅲ的參與。2013年,Cong等[13]的研究也證實(shí)了這一點(diǎn),同時該研究還發(fā)現(xiàn)人工設(shè)計的crRNA的靶點(diǎn)在位于其PAM序列上游至少13個堿基以內(nèi)的范圍內(nèi)不能存在任何點(diǎn)突變,否則將造成crRNA無法識別靶點(diǎn)而使基因敲除失敗,該研究首次成功利用CRISPR技術(shù)敲除了人類細(xì)胞的基因。Jinek等[54]在研究細(xì)菌CRISPR系統(tǒng)時發(fā)現(xiàn)人工合成的引導(dǎo)RNA(guideRNA,gRNA某些研究中也稱為singleguideRNA,sgRNA)代替tracrRNA和crRNA可以取得類似的結(jié)果。Jinek等[14]隨后在其利用CRISPR敲除人類細(xì)胞基因的研究中,也采取了合成gRNA的策略。2013年,Mali等[15]在其研究中,利用人工設(shè)計的gRNA,取得了與Cong等相似的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。這些研究,為CRISPR系統(tǒng)在真核細(xì)胞中廣泛應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)?，F(xiàn)在對于真核生物,只需利用CRISPRdirect(http://crispr.dbcls.jp/)等軟件(該軟件提供了超過200種生物的基因組信息,用于排除gRNA設(shè)計過程中潛在的脫靶位點(diǎn))針對靶基因設(shè)計的特異性的gRNA,選擇合適的轉(zhuǎn)基因方法將gRNA(或表達(dá)gRNA的質(zhì)粒)和表達(dá)重組Cas9蛋白的質(zhì)粒(或mRNA)導(dǎo)入到細(xì)胞內(nèi)即可實(shí)現(xiàn)對靶基因的定點(diǎn)敲除(圖3)。

斑馬魚(Danio rerio)是第一種成功利用CRISPR技術(shù)進(jìn)行基因敲除的脊椎動物,2013年Hwang等[60]利用CRISPR技術(shù)嘗試敲除斑馬魚胚胎中的10個基因,其中8個獲得了較高的突變效率。目前利用CRISPR技術(shù)已經(jīng)在人類體外培養(yǎng)細(xì)胞[13—15]、小鼠細(xì)胞[13]、斑馬魚[60]、小鼠(Mus musculus)[61]、大鼠(Rattus norvegicus)[62]、熱帶爪蟾(Xenopus tropicalis)[63]、果蠅(Drosophila melanogaster)[64]、秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans)[65]、水稻(Oryza sativa)[66]、小麥(Triticum aestivum)[66]、擬南芥(Arabidopsis thaliana)[67]、煙草(Nicotiana benthamiana)[67]、家蠶(Bombyx mori)[68]、赤擬谷盜(Tribolium castaneum)[69]等多種物種中實(shí)現(xiàn)了基因定點(diǎn)敲除。

圖2細(xì)菌CRISPR基因座的作用機(jī)制Fig.2ThemechanismsofCRISPRlociinBacteria第1階段.噬菌體DNA序列插入CRISPR基因座(CRISPRlocus)的間隔序列(Spacer)中。第2階段.pre-crRNA和tracrRNA的共同成熟與Cas9復(fù)合體的形成。第3階段.Cas9切割復(fù)合體對侵入的噬菌體DNA進(jìn)行切割。藍(lán)色虛框僅標(biāo)明不同階段,不表示任何細(xì)胞結(jié)構(gòu)(參考DoudnaandCharpentier,2014;Hsu,et al.,2014;Wiedenheft,et al.,2012;李君等,2013)Stage1.GenomeDNAofbacteriophageisinsertedintothespacersequenceoftheCRISPRloci.Stage2.pre-crRNAandtracrRNAcomaturationandCas9cleavagecomplexformation.Stage3.BacteriophageDNAiscutbyCas9cleavagecomplex.Bluedashgridlinesmark thedifferentworkingstages.Theydonotindicateanycellstructure

圖3CRISPR用于基因敲除的原理Fig.3TheproceduresandprincipleofCRISPRforgeneknockoutA.經(jīng)過共同成熟過程后形成的的crRNA:tracrRNA復(fù)合體示意圖。B.通過在crRNA和tracrRNA之間添加連接序列(圖中紫色部分)形成的引導(dǎo)RNA(guideRNA,gRNA)示意圖。C.利用CRISPR系統(tǒng)在真核細(xì)胞中進(jìn)行基因敲除的一般方法示意圖。表達(dá)gRNA的質(zhì)粒和表達(dá)Cas9的質(zhì)粒通過轉(zhuǎn)染、電穿孔、顯微注射等轉(zhuǎn)基因方法進(jìn)入細(xì)胞后,在細(xì)胞內(nèi)經(jīng)過轉(zhuǎn)錄、翻譯等過程后形成gRNA和Cas9蛋白的復(fù)合體,識別特異的DNA序列并完成切割,隨后激活DNA修復(fù)機(jī)制,修復(fù)過程產(chǎn)生移碼突變,造成基因敲除的效果(參考Jinek,et al., 2013;Stolfi,et al.,2014)A.SchematicofcrRNA:tracrRNAcomplexafterco-maturation.B.SchematicofgRNAthatformedbyaddingalinker-sequence(thepurple part)betweencrRNAandtracrRNA.C.ProceduresofgeneknockoutviaCRISPRsystem.PlasmidsthatexpressgRNAandCas9 respectivelyenterthecellbytransfection,electroporationandmicroinjection.Cas9andgRNAformacomplexthatrecognizesandcutsthe specificDNAsequenceincell.DNAbreakswillinduceitsrepairmechanismatthesiteofdamage.Thus,DNAwillbeeditedthrough codingframeshiftinthisprocess

CRISPR在基因編輯中的應(yīng)用Cas9在目標(biāo)DNA上產(chǎn)生雙鏈切割(DSB)后,會激活機(jī)體的修復(fù)機(jī)制。針對不同的修復(fù)機(jī)制,有不同的方法實(shí)現(xiàn)基因編輯。如果DNA以非同源末端連接的方式進(jìn)行修復(fù),可以添加兩端為平末端的DNA供體,在修復(fù)過程中有一定幾率形成供體與破損末端的連接,從而實(shí)現(xiàn)基因編輯[70]。但是這種情況效率很低,不能保證插入的方向,而且非同源末端連接是一種易錯修復(fù)機(jī)制,修復(fù)過程中可能會產(chǎn)生堿基的插入或缺失。如果細(xì)胞以同源重組的方式修復(fù),需要添加兩端含有與破損末端的同源序列的DNA供體,通過同源重組將供體與破損基因組整合,以實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)編輯[70]。這種方式更為精確,但是某些物種因?yàn)橥粗亟M不是主要的修復(fù)方式而造成無法使用這種方法(圖4)。在釀酒酵母中同源重組是最主要的修復(fù)方式,適合以這種方式進(jìn)行基因編輯。Jakounas等[25]在釀酒酵母中的研究證明,通過一次轉(zhuǎn)入可以表達(dá)多個gRNA的質(zhì)粒,可以在釀酒酵母中利用CRISPR系統(tǒng)一次編輯同一代謝通路中的多個基因。Chang等[71]在斑馬魚中借助mloxP重組系統(tǒng),成功在CRISPR系統(tǒng)產(chǎn)生的切口處插入了目的DNA片段。Li等[72]利用CRISPR技術(shù)建立了斑馬魚的基因敲入模型,成功標(biāo)記了斑馬魚神經(jīng)元。Wagner等[73]利用CRISPR技術(shù)和同源重組的原理成功編輯了惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum)的基因組,使其破壞紅細(xì)胞的能力下降。

利用Cas9失活突變體dCas9的應(yīng)用對Cas9蛋白結(jié)構(gòu)的研究表明,Cas9有兩個重要的DNA切割結(jié)構(gòu)域——RuvC核酸酶結(jié)構(gòu)域和HNH結(jié)構(gòu)域。位于N端的RuvC核酸酶結(jié)構(gòu)域切割與gRNA序列相同的DNA鏈,而位于肽鏈中部的HNH結(jié)構(gòu)域則切割與gRNA互補(bǔ)結(jié)合的DNA鏈的。如果將位于肽鏈第10位的天冬氨酸突變?yōu)楸彼?突變體D10A)將造成RuvC結(jié)構(gòu)域失活,如果840位的組氨酸突變?yōu)楸彼?突變體H840A)將造成HNH結(jié)構(gòu)域失活,這2種突變體將都只能進(jìn)行單鏈切割。如果突變體同時具有上述2種突變D10A和H840A,則該突變體將喪失切割雙鏈的能力,而只保留結(jié)合gRNA并識別靶基因的能力,這種突變體被稱為dCas9[74,75]。

dCas9可用于調(diào)控基因的表達(dá)。Qi等[75]在基因編碼區(qū)的上游區(qū)域設(shè)計一系列sgRNA識別位點(diǎn),利用dCas9蛋白與之結(jié)合,利用空間位阻阻斷目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄,實(shí)現(xiàn)基因敲降,這種技術(shù)被稱為CRISPRi。Perez-Pinera等[76]的研究發(fā)現(xiàn),將可以激活轉(zhuǎn)錄的VP64結(jié)構(gòu)域與dCas9蛋白構(gòu)建為融合蛋白, dCas9-VP64融合蛋白可在sgRNA的介導(dǎo)下結(jié)合在目標(biāo)基因編碼區(qū)上游的調(diào)控區(qū)域,進(jìn)而激活目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄,激活的強(qiáng)度與上游結(jié)合的sgRNA數(shù)量存在一定的相關(guān)性。Zalatan等[77]在利用dCas9調(diào)控基因表達(dá)方面則另辟蹊徑,在其研究中,dCas9本身并不偶聯(lián)任何激活或抑制基因轉(zhuǎn)錄的結(jié)構(gòu)域,而是在sgRNA3′末端偶聯(lián)上重新設(shè)計的2種不同的RNA折疊區(qū)域,利用這段新的RNA折疊區(qū)域分別識別并結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域VP64和轉(zhuǎn)錄抑制結(jié)構(gòu)域KRAB,從而激活或抑制釀酒酵母內(nèi)相應(yīng)基因的表達(dá)。

通過在dCas9蛋白上偶聯(lián)不同的接頭,還可以利用CRISPR系統(tǒng)對基因組進(jìn)行一些特殊操作。如將熒光蛋白偶聯(lián)到dCas9上,可利用其來構(gòu)建探針以識別特定的核酸序列。Ma等[78]在研究中成功使用了3種來自不同細(xì)菌的識別不同PAMsequence的dCas9蛋白來標(biāo)記同一染色體的不同區(qū)域。又如,將乙酰轉(zhuǎn)移酶偶聯(lián)到dCas9上,可利用其進(jìn)行表觀基因組編輯。Hilton等[79]將人類的乙酰轉(zhuǎn)移酶p300偶聯(lián)到dCas9上,通過加強(qiáng)靶基因組蛋白的乙?；瘉碓鰪?qiáng)基因的表達(dá)水平。

圖4不同DNA修復(fù)機(jī)制下的基因編輯方法(參考GillesandAverof,2014)Fig.4MethodsofgeneeditingunderthedifferentmechanismsofDNArepair

CRISPR在醫(yī)藥方面的應(yīng)用CRISPR技術(shù)可用于快速的構(gòu)建疾病的動物模型。利用傳統(tǒng)的方式構(gòu)建疾病動物模型耗時較長,而利用CRISPR系統(tǒng),僅需一代時間,就能獲得轉(zhuǎn)基因小鼠[61]。麻省理工學(xué)院的Xue等[80]利用尾靜脈注射的方式,將CRISPR系統(tǒng)導(dǎo)入成年小鼠肝臟內(nèi),成功敲除了其P53和Pten這兩個重要的抑癌基因,使得成年小鼠肝臟發(fā)生了腫瘤。Platt等[81]則利用慢病毒載體將Cas9整合到小鼠的基因組上,再利用慢病毒將包含有P53、Lkb1、Kras基因靶點(diǎn)的sgRNA送入小鼠體內(nèi),成功誘發(fā)了小鼠的肺癌,建立了小鼠的肺癌模型。

CRISPR技術(shù)在醫(yī)藥方面的另一個重要應(yīng)用是用于基因治療。許多人類遺傳病是單一基因的缺陷造成的,如在我國南方地區(qū)發(fā)病率較高的地中海貧血癥,是由于珠蛋白缺失或點(diǎn)突變造成的。2014年,Xie等[82]為利用CRISPR基因治療地中海貧血邁出了重要一步,在該項研究中,研究者們利用地中海貧血患者的皮膚細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生iPSC,并利用CRISPR技術(shù)結(jié)合piggyBac轉(zhuǎn)座子修復(fù)了有缺陷的珠蛋白基因,隨后誘導(dǎo)iPSC分化形成可以穩(wěn)定表達(dá)正常珠蛋白的紅細(xì)胞。2015年4月,中山大學(xué)的黃軍就[83]課題組首次嘗試?yán)肅RISPR技術(shù)修復(fù)了人類三核胚胎中的地中海貧血相關(guān)基因,獲得了一定的成功。運(yùn)用CRISPR技術(shù)進(jìn)行基因治療的另一個熱點(diǎn)是艾滋病。治療的思路源于世界上第一例被治愈的艾滋病患者“柏林病人”,該患者同時患有艾滋病和白血病,在其接受白血病治療過程中接受了骨髓移植,骨髓供體的造血干細(xì)胞恰好帶有一種罕見的被稱為delta32的突變,該突變可以使CCR5受體發(fā)生改變而使HIV不能進(jìn)入T細(xì)胞中,患者因骨髓移植同時治愈了白血病和艾滋病。根據(jù)這一思路,可以提取患者自身的造血干細(xì)胞,使用CRISPR技術(shù)改變其CCR5受體,在重新移植進(jìn)患者體內(nèi),使HIV不能侵襲改造過的T細(xì)胞,但是目前該方法還停留在基礎(chǔ)研究階段,未進(jìn)行任何臨床試驗(yàn)[84—86]。Hua等[87]選擇了一種直接利用CRISPR技術(shù)清除病毒的策略,他們針對HIV-1的LTRU3區(qū)域設(shè)計sgRNA,直接切除那些已經(jīng)整合到感染者基因組上的病毒DNA,從而抑制病毒復(fù)制,但該方法能否徹底清除數(shù)量眾多的被感染細(xì)胞中的病毒DNA還有待驗(yàn)證。

3 CRISPR技術(shù)在海洋生物中應(yīng)用的現(xiàn)狀

目前,CRISPR系統(tǒng)在海洋生物中應(yīng)用的報道還比較少,最早公開的報道見于2014年,Sasaki等[88]首先在玻璃海鞘中利用CRISPR技術(shù)實(shí)現(xiàn)了基因定點(diǎn)敲除。在該研究中,作者針對玻璃海鞘的Hox3、Hox5、Hox12共選擇了8個長度為20個堿基的靶點(diǎn),并構(gòu)建了相應(yīng)的sgRNA表達(dá)框架;隨后利用電穿孔方式將這些表達(dá)框架分別導(dǎo)入玻璃海鞘的受精卵中,一同導(dǎo)入的還有表達(dá)Cas9蛋白的mRNA;結(jié)果顯示,有6個sgRNA框架未能發(fā)揮作用,針對Hox3的1個sgRNA框架和Hox5的1個sgRNA框架使目標(biāo)基因產(chǎn)生了突變。該研究還確定,導(dǎo)入的sgRNA表達(dá)框架質(zhì)量必須大于1.5pg,表達(dá)Cas9蛋白mRNA的質(zhì)量必須大于15pg,系統(tǒng)才能在玻璃海鞘受精卵中產(chǎn)生相應(yīng)突變,突變率隨著注射量的增加而增加。同年Stolfi等[89]也成功的利用CRISPR系統(tǒng)在玻璃海鞘中實(shí)現(xiàn)了基因定點(diǎn)突變。Stolfi等[89]等選擇的靶基因是在發(fā)育過程中決定細(xì)胞命運(yùn)的ebf基因,共構(gòu)建了2個gRNA表達(dá)載體,利用電穿孔技術(shù)分別將這2個載體同Cas9蛋白表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入玻璃海鞘受精卵中,取得了較高的突變效率。同時針對gRNA表達(dá)載體在玻璃海鞘體內(nèi)轉(zhuǎn)錄提前終止的問題,事先對載體上的部分序列進(jìn)行了改造,以幫助這些質(zhì)粒在細(xì)胞中順利轉(zhuǎn)錄。最近,該研究組發(fā)展了新簡化的Cas9構(gòu)建方法,并構(gòu)建了玻璃海鞘引導(dǎo)RNA數(shù)據(jù)庫,用于系統(tǒng)的玻璃海鞘功能基因的敲除[90]。Ikmi等[91]利用分別用CRISPR技術(shù)和TALEN技術(shù)對?？?Nematostella vectensis)的NvFP-7R進(jìn)行了敲除, NvFP-7R是一種內(nèi)源的紅色熒光蛋白,經(jīng)過基因敲除的海葵不能發(fā)出紅色熒光,該研究還證明了NvFP-7R并不是?？l(fā)育所必須的。Perry和Henry[92]則嘗試?yán)肅RISPR技術(shù)對大西洋角螺(Crepidula fornicata)的β-catenin基因進(jìn)行編輯,成功在其CDS的3′端添加了一段編碼熒光蛋白mCherry的序列,在大西洋角螺幼蟲中可以檢測到具有紅色熒光信號的β-catenin蛋白。Square等[93]利用CRISPR技術(shù)對海七鰓鰻(Petromyzon marinus)進(jìn)行研究,研究者將Cas9的mRNA和針對TYR基因設(shè)計的gRNA注射進(jìn)受精卵中,成功對TYR基因進(jìn)行了敲除。Lin和Su[94]利用顯微注射技術(shù)將表達(dá)Cas9蛋白的mRNA和針對spNodal基因設(shè)計的sgRNA注入到海膽的受精卵中,成功敲除了海膽的spNodal基因,在該研究中作者針對spNodal基因的2個外顯子分別設(shè)計了3種gRNA,在全部6種gRNA中有5種獲得了較好的敲除效果,產(chǎn)生了預(yù)期的放射狀表型。Martin等[95]用CRISPR技術(shù)在海洋甲殼端足類動物中成功實(shí)現(xiàn)了對HOX基因的定點(diǎn)敲除。Nymark等[96]將CRISPR技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域拓展到了海洋藻類中,他們利用CRISPR技術(shù)成功敲除了三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)的CpSRP54基因。

在海洋經(jīng)濟(jì)生物有關(guān)的研究中,目前僅見2篇相關(guān)報道。Edvardsen等[97]在研究大西洋鮭(Salmo salar)身體著色過程中的關(guān)鍵基因slc45a2和tyr過程中,利用CRISPR技術(shù)對其進(jìn)行了敲除,針對每個基因分別設(shè)計的3種sgRNA均不同程度的導(dǎo)致了大西洋鮭的幼體體色變淺,證明了CRISPR系統(tǒng)確實(shí)可以在大西洋鮭體內(nèi)發(fā)揮作用。最近,研究人員利用CRISPR/Cas9技術(shù)在脊尾白蝦(Exopalaemon carinicauda)中成功實(shí)現(xiàn)了幾丁質(zhì)酶基因EcChi4的敲除,并觀察了EcChi4敲除對脊尾白蝦生長發(fā)育的影響[98]。

4 CRISPR技術(shù)在海洋生物中的應(yīng)用前景展望

現(xiàn)今制約CRISPR技術(shù)在海洋生物中開展的主要因素是多數(shù)海洋生物缺少成熟穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因技術(shù)。因此建立成熟的轉(zhuǎn)基因方法是實(shí)現(xiàn)CRISPR技術(shù)在海洋生物中大規(guī)模應(yīng)用的先決條件。一旦解決轉(zhuǎn)基因方法的問題,可以嘗試進(jìn)行Cas9蛋白穩(wěn)定表達(dá)轉(zhuǎn)基因海洋生物品系的構(gòu)建,這將大大推動CRISPR技術(shù)在海洋生物中的應(yīng)用。目前在果蠅研究中,有研究者[24]通過轉(zhuǎn)基因手段將表達(dá)Cas9蛋白的基因片段整合到果蠅基因組中,當(dāng)需要利用CRISPR進(jìn)行基因敲除時,只需將gRNA的表達(dá)載體導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因果蠅卵中,即可完成定點(diǎn)突變,該方法可以大大提高了基因敲除的效率。Platt等[81]也成功構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)Cas9的轉(zhuǎn)基因小鼠,用于快速構(gòu)建癌癥小鼠模型。

在海洋動物的CRISPR技術(shù)應(yīng)用中,還有一個值得探索的方向是光遺傳學(xué)與CRISPR技術(shù)的結(jié)合。光遺傳學(xué),就是結(jié)合生物工程方法,利用光對某些生物活動進(jìn)行控制。在CRISPR的研究中,可以利用光控元件與Cas9蛋白的偶聯(lián),在時間和空間上實(shí)現(xiàn)對CRISPR系統(tǒng)的進(jìn)行控制。Nihongaki等[99]將正常的Cas9蛋白分成2部分,分別偶聯(lián)上不同的光控元件,該光控元件源自粗糙脈胞菌(Neurospora crassa),存在帶正電與帶負(fù)電的兩種形式,黑暗狀態(tài)下以單體形式存在,在藍(lán)光作用下能形成異源二聚體從而使與之偶聯(lián)的被分割為2部分的Cas9蛋白重新聚合成一個完整蛋白。在Nihongaki等[100]的另一項研究中,則利用失去雙鏈切割能力的Cas9突變體dCas9偶聯(lián)光控元件CIB1,該融合蛋白與gRNA形成復(fù)合體識別并結(jié)合靶DNA,在藍(lán)光作用下,偶聯(lián)了光控元件CYB2的激活因子可以與上述復(fù)合體結(jié)合,從而激活靶基因的表達(dá)。Polsein和Gersbach[101]在研究中也使用了類似的方法,所不同的是,他們所使用的Cas9偶聯(lián)了2個CIBN結(jié)構(gòu)域,效率較只偶聯(lián)1個結(jié)構(gòu)域更高。上述光遺傳學(xué)技術(shù)如果用于海洋動物中,就能方便的利用光控制基因的時空表達(dá)模式,將有助于發(fā)育生物學(xué)研究。

CRISPR另一個極具潛力的應(yīng)用方向是海洋動物遺傳育種。2015年美國FDA批準(zhǔn)了轉(zhuǎn)基因三文魚上市銷售,成為首例獲準(zhǔn)上市的轉(zhuǎn)基因動物[102]?；蚬こ淌侄斡糜谶z傳育種正逐漸被消費(fèi)者認(rèn)可。Qian等[103]在2015年的一項研究中利用鋅指核酸酶技術(shù)敲除了家豬(Susscrofa domestica)體內(nèi)抑制肌肉生長的mstn基因,獲得了肌肉含量更加豐富的家豬品種。CRISPR技術(shù)比鋅指核酸酶技術(shù)更加簡便、快捷、廉價。目前CRISPR技術(shù)在海洋經(jīng)濟(jì)魚類大西洋鮭[97]和淡水魚類斑馬魚[60,71,72]和青鳉(Oryzias latipes)[104]中均取得了成功。如果在水產(chǎn)領(lǐng)域應(yīng)用推廣此項技術(shù),敲除魚、蝦、貝類的肌肉抑制基因,獲取更高肌肉含量的水產(chǎn)品種將具有十分廣闊的市場前景。

目前,利用CRISPR技術(shù)在幾乎所有的模式生物中實(shí)現(xiàn)基因的定點(diǎn)敲除和編輯,在海洋生物中也已有9種生物,即玻璃海鞘[88—90]、海膽[94]、?？鸞91]、大西洋角螺[92]、海七鰓鰻[93]、大西洋鮭[97]、端足類動物[95]、脊尾白蝦[98]、三角褐指藻[96]中獲得了成功,涵蓋了尾索動物、棘皮動物、刺胞動物、貝類、圓口綱、魚類、甲殼動物和藻類等8個生物類群。相信不遠(yuǎn)的將來,隨著人們認(rèn)識的進(jìn)一步的深入,CRISPR技術(shù)一定可以在更多的海洋生物體內(nèi)實(shí)現(xiàn)基因編輯,幫助研究者們獲得更多、更有價值的研究成果。

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CRISPR/CAS9 AND ITS APPLICATIONS IN MARINE ORGANISMS

LIXiang1andDONGBo1,2,3
(1.College of Marine Life Sciences,Ocean University of China,Qingdao266003,China;2.Institute of Evolution & Marine Biodiversity,Ocean University of China,Qingdao266003,China;3.Laboratory for Marine Biology and Biotechnology, Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology,Qingdao266100,China)

CRISPR(Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeatsequences)isanadaptiveimmunesystem thatconfersresistancetobacteriophageorexogenousplasmidinbacteria.CRISPR/Cas9technologydevelopedfrom bacterialtypeIICRISPRsystemhasbecomeapowerfulgenomiceditingtoolsuccessfullyusedinmostofexisting creatures.ComparedwithZinc-fingernucleases(ZFN)andTranscriptionactivatorlikeeffectornucleases(TALEN) techniques,theadvantagesofCRISPR/Cas9technicalsystemaremoresimple,highlyefficient,andcheaper.Butfor marineorganisms,itisnotwidelyusedbecauseofthedifficultyoftransferringexogenousDNAintomostofmarine animals.Inthisreview,weintroducedthedevelopmentalcourse,workingmechanisms,prospectsofCRISPR/Cas9 technologyandthecurrentstatusofitsapplicationinmarineorganisms.Moreover,weanalyzedthepotentialapplicationofdCas9andthecombinationofCas9andoptogeneticcontrolmethodonstudyinggeneregulatorymechanismsin marineanimals,whichmightpromotefurtherapplicationofCRISPR/Cas9technologyinmoremarineorganismsinthe nearfuture.

CRISPR/Cas9;Geneediting;Marineorganisms;Functionidentification;Generesources



10.7541/2017.31

Q789

A

1000-3207(2017)01-0244-13

2016-03-23;

2016-06-17

國家自然科學(xué)基金(31572352);山東省自然科學(xué)基金(ZR2015DM003);山東省泰山學(xué)者建設(shè)工程專項經(jīng)費(fèi)資助[Supportedby theNationalNaturalScienceFoundationofChina(31572352);theNaturalScienceFoundationofShandongProvince (ZR2015DM003);TaishanScholarProgramofShandongProvince]

李響(1986—),男,天津市人;博士研究生;主要從事動物基因組編輯技術(shù)的研究。E-mail:lx861024@126.com

董波,男,遼寧丹東人;博士,教授;主要從事動物胚胎發(fā)育與器官形態(tài)發(fā)生方面的研究。E-mail:bodong@ouc.edu.cn