董 妍,曾維惠△,李文彬

1.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院(西安 710004)，2.陜西省中醫(yī)醫(yī)院(西安 710003)

△通訊作者

姜黃素對H2O2>誘導(dǎo)人黑素細胞氧化應(yīng)激損傷的預(yù)保護作用

董 妍1,曾維惠1△,李文彬2

1.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院(西安 710004)，2.陜西省中醫(yī)醫(yī)院(西安 710003)

目的：探討姜黃素激活Nrf2對人黑素細胞免受H2O2誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷的預(yù)保護作用。方法：利用不同濃度的H2O2(50、100、200 μmol/L)處理人黑素細胞24 h,MTT檢測細胞活性,篩選H2O2體外誘導(dǎo)人黑素細胞氧化應(yīng)激的最適濃度；進一步使用10 μmol/L的姜黃素預(yù)處理細胞2 h后,使用最適濃度H2O2刺激24 h。MTT檢測細胞活性,DCFH-DA流式檢測細胞內(nèi)活性氧(ROS)含量，Real-time PCR測定Nrf2、Ho-1、Sod1、Cat的mRNA表達水平，Western blot檢測Nrf2蛋白表達。結(jié)果：100 μmol/L的H2O2處理人黑素細胞24 h后細胞活性顯著降低,10 μmol/L的姜黃素預(yù)處理2 h后,人黑素細胞活性顯著增強,流式檢測結(jié)果顯示細胞內(nèi)ROS含量顯著降低，Western blot檢測結(jié)果顯示Nrf2蛋白表達增加,Real-time PCR結(jié)果提示Nrf2、Ho-1、Sod1、Cat的mRNA表達水平顯著增強。結(jié)論：姜黃素保護人黑素細胞免受H2O2誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷的過程中激活了Nrf2信號通路,提示Nrf2是白癜風(fēng)氧化應(yīng)激致病機制中的關(guān)鍵分子,為臨床治療白癜風(fēng)提供了一種思路。

白癜風(fēng)是臨床上常見的一種自身免疫相關(guān)性皮膚病,其發(fā)病率呈逐年上升的趨勢,約占人群的1%～2%,好發(fā)于5～30歲兒童和青年。由于色素細胞受損導(dǎo)致色素脫失使白癜風(fēng)患者皮膚防御外界損傷的能力顯著下降，進一步引發(fā)其他皮膚疾病,甚至皮膚癌,嚴重影響患者身心健康。白癜風(fēng)的病因復(fù)雜,其確切的發(fā)病機制尚不清楚,臨床也缺少有效的治療藥物[1]。目前,多種機制被報道參與白癜風(fēng)的發(fā)病過程,如自身免疫學(xué)說、黑素細胞自毀學(xué)說、遺傳學(xué)說、神經(jīng)化學(xué)因子學(xué)說等[2]。越來越多的證據(jù)提示氧化應(yīng)激在誘發(fā)黑素細胞破壞或功能障礙方面可能發(fā)揮關(guān)鍵作用[3]。氧化應(yīng)激過程中產(chǎn)生大量的氧自由基攻擊細胞,特別是白癜風(fēng)患者的黑素細胞更易于受到損傷,其正常代謝、增殖和分化受到干擾,并可能進一步誘發(fā)機體自身免疫反應(yīng),形成瀑布式效應(yīng),最終造成黑素細胞不可逆性損傷。因此,闡明白癜風(fēng)患者黑素細胞易受到氧化損傷的具體分子機制,對指導(dǎo)臨床治療均具有重要的意義。姜黃素是從姜科植物的根莖中獲得的一種天然化合物,具有抑制蛋白質(zhì)的氧化及脂質(zhì)的過氧化等抗氧化作用。本研究旨在探討姜黃素對人黑素細胞免受H2O2誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷的預(yù)保護作用,從轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子2(NF-E2-related factor 2,Nrf2)信號通路切入,闡明其中可能的氧化應(yīng)激機制。

材料與方法

1 主要試劑和儀器 M254基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胎牛血清(Fetal bovine serum,FBS)購自美國Gibco公司；胰蛋白酶、DCFH-DA、雙抗(青霉素和鏈霉素)、二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO)、姜黃素購自美國Sigma公司；Nrf2、β-actin購自美國Abcam公司；Nrf2、Ho-1、Sod1、Cat引物由上海生工合成。Real-time PCR試劑盒、SYBR Green Realtime PCR Master Mix、八聯(lián)管購自大連寶生公司；流式細胞儀(美國BD公司)。

2 方 法 ①細胞培養(yǎng)和傳代：正常人黑素細胞由第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院組織工程中心惠贈。細胞復(fù)蘇成功后,每2天換液一次，待細胞生長至培養(yǎng)瓶瓶底80%～90%時，給與傳代。傳代時棄去舊培養(yǎng)液，向培養(yǎng)瓶中加入37 ℃預(yù)溫的0.25%胰酶消化液2 ml,輕搖使消化液流遍細胞表面,棄液，加入0.25%胰酶消化液0.5 ml，2～5 min后，在倒置顯微鏡下觀察，如發(fā)現(xiàn)細胞皺縮變圓、散開漂浮，則加入培養(yǎng)液終止消化，反復(fù)吹打瓶底，使細胞懸浮，將細胞懸液加入另外的培養(yǎng)瓶中,每瓶加10 ml培養(yǎng)液，以1∶3傳代。置于37 ℃,5%CO2及飽和濕度細胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。②MTT法檢測細胞增殖：將人黑素細胞以密度5000個/孔接種于96孔培養(yǎng)板,置于37 ℃,5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后加入不同濃度H2O2：50、100、200 μmol/L，篩選最適濃度的H2O2；進一步使用10 μmol/L的姜黃素預(yù)處理2 h后,使用最適H2O2刺激24 h。同時,設(shè)置空白對照組。每組6個復(fù)孔,10 μg/ml的MTT 37 ℃孵育4 h,小心吸取液體,每孔加入200 μl的DMSO,小心振蕩10 min，酶標儀492 nm波長下檢測吸光值(A值)。③實驗分組：實驗分為四組，H2O2組；姜黃素組,姜黃素濃度為10 μmol/L；姜黃素+H2O2組,10 μmol/L的姜黃素預(yù)處理2 h后使用最適H2O2刺激24 h；對照組,正常培養(yǎng)基。每組3個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。④DCFH-DA流式檢測：將人黑素細胞以1.5×105個/孔的密度接種于6孔培養(yǎng)板置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后加入藥物，分組同前，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，鏡下觀察細胞融合達到70%。小心吸取培養(yǎng)液，PBS洗滌細胞3次，每次3 min。棄去PBS后，每孔加入2 ml濃度為10 μmol/L的DCFH-DA(無血清培養(yǎng)基配置)，置于細胞培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育1 h。使用無血清培養(yǎng)基洗滌細胞3次,每次3 min。加入1 ml的0.25%胰酶約3 min，鏡下觀察細胞變圓,加入1 ml的含血清培養(yǎng)基終止細胞消化，輕輕吹打細胞，暗環(huán)境下收集細胞懸液，1000 r/min離心機4 ℃離心10 min,棄上清，加入1 ml的無血清培養(yǎng)基重懸制備成單細胞懸液，使用488 nm激發(fā)波長，525 nm發(fā)射波長流式檢測各組細胞熒光強度。⑤Western blot檢測：細胞給藥刺激48 h后收集,每組3個復(fù)孔。每孔加入100 μl的RIPA裂解液,收集細胞后4 ℃離心機1000 r/min離心30 min,取上清。BCA試劑盒定量蛋白濃度后加入5×蛋白上樣緩沖液，充分混勻后100 ℃變性10 min。每樣本取25 μg,SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)電泳約90 min,取PVDF膜置于10%脫脂牛奶中封閉非特異性抗原2 h,加入一抗Nrf2(1∶500)或β-actin(1∶1000)過夜,TBST洗脫3次,每次15 min。加入二抗(1∶1000)室溫避光孵育2 h,TBST洗脫兩次,每次15 min,最后一次使用TBS洗膜一次，15 min。暗室內(nèi)ECL試劑盒顯影、曝光,以Nrt2與β-actin條帶吸光度掃描灰度值的比值反應(yīng)目的蛋白Nrf2蛋白表達水平。⑥Real-time PCR檢測 ：使用Trizol法提取細胞總RNA,經(jīng)Nanodrop 2000檢測RNA含量及其純度，260/A280比值均介于1.9～2.1,代表所提取RNA濃度較純。Invitrgen逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成細胞cDNA，以其為模板進行Real-time PCR反應(yīng),引物序列由上海生工合成。Nrf2上游引物：5‘- TCAGCCAGCCCAGCACATCC-3’，下游引物：5‘- TCTGCGCCAAAAGCTGCATGC-3’；血紅素氧合酶-1(Ho-1)上游引物：5‘-GAGTCTAGAATGCAGGCATGCTGGCTCCC-3’，下游引物：5‘-GAGTCTAGACAAGCTACTATCAGACAATGC-3’。過氧化物歧化酶1(Sod1)上游引物：5‘-CCGATGTGTCTATTGAAGATTCTG-3’，下游引物：5‘-TTTCCACCTTTGCCCAAGTC-3’；過氧化氫酶(Cat)上游引物：5‘-TGAGGTTGAACAGATAGC-3’,下游引物：5‘- CACAGGTATATGAAGATAATTG-3’。PCR反應(yīng)體系為SYBR Green PCR Mix 10 μl,上下游引物各1 μl,cDNA模板2 μl,RNase-free ddH2O 6 μl；PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min后,進行循環(huán)，94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min擴增,共35個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。

結(jié) 果

1 MTT檢測細胞活性 給予50、100、200 μmol/L的H2O2處理24 h后,人黑素細胞的活力呈劑量依賴性降低(P<0.05)，選擇100 μmol/L濃度的H2O2為最佳刺激濃度(見圖1)。當(dāng)使用10 μmol/L的姜黃素預(yù)處理2 h后,可以顯著緩解H2O2引起的損傷作用,恢復(fù)細胞活力(見圖2)。

圖1 MTT檢測不同濃度H2O2對人黑素細胞增殖活性的影響

圖2 MTT檢測10 μmol/L的姜黃素對人黑素細胞增殖活性的影響

2 姜黃素對人黑素細胞內(nèi)ROS含量的影響 見圖3。與對照組相比,H2O2損傷組細胞內(nèi)DCF熒光強度顯著增加(P<0.05)。10 μmol/L的姜黃素預(yù)處理2 h后能明顯降低細胞內(nèi)DCF熒光強度(P<0.05)。

圖3 姜黃素對人黑素細胞ROS含量的影響

3 姜黃素對Nrf2蛋白表達的影響 見圖4。與對照組相比,H2O2損傷組細胞內(nèi)Nrf2蛋白的表達強度降低。而10 μmol/L的姜黃素預(yù)處理2 h后，姜黃素能顯著增加細胞內(nèi)Nrf2蛋白的表達強度。

4 姜黃素對Nrf2下游抗氧化基因表達的影響 見圖5。與對照組相比，H2O2損傷組細胞內(nèi)Nrf2、Ho-1、Sod1、Cat基因的表達顯著降低(P<0.05)。10 μmol/L的姜黃素預(yù)處理2 h后能顯著增加細胞內(nèi)Nrf2、Ho-1、Sod1、Cat基因的表達(P<0.05)。

圖4 姜黃素對人黑素細胞Nrf2蛋白表達的影響

圖5 姜黃素對人黑素細胞Nrf2、Ho-1、Sod1、Cat基因表達的影響

討 論

大量研究報道氧化應(yīng)激參與白癜風(fēng)的發(fā)展，而且與其病情的活動性也具相關(guān)性，甚至有專家認為ROS可作為白癜風(fēng)病情活動性的指標[4]。黑素細胞在合成黑素過程中產(chǎn)生大量ROS[5]，ROS增加黑素合成中間毒性產(chǎn)物，使得兒茶酚胺釋放增多，從而引起黑素細胞免疫性損傷[6]。此外，ROS可直接攻擊黑素細胞，誘導(dǎo)細胞凋亡，產(chǎn)生新的自身抗原或者釋放隱蔽抗原，破壞細胞免疫耐受，進一步引發(fā)免疫反應(yīng)。H2O2為首的ROS可以自由穿過各種細胞膜，滅活多種抗氧化酶，包括谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶、過氧化氫酶及乙酰膽堿酯酶，引起脂質(zhì)過氧化，對細胞危害較大。臨床研究報道，在進展期白癜風(fēng)患者表皮中檢測到H2O2濃度高達10-3mol/L，高于其生理濃度 (10-7～10-6mol/L)，該研究為氧化應(yīng)激參與白癜風(fēng)發(fā)病提供了最直接的證據(jù)[4]。本研究使用不同濃度的H2O2刺激人黑素細胞體外構(gòu)建氧化應(yīng)激模型，通過MTT檢測，最終選擇100 μmol/L的H2O2為最適刺激濃度，為本研究提供了良好的細胞模型基礎(chǔ)。

近年來，外源性提高皮膚細胞抗氧化能力，降低細胞氧化損傷成為減輕白癜風(fēng)發(fā)生的治療方向。因此，具有抗氧化作用的抗氧化物是研究白癜風(fēng)治療方法的熱點之一。Tuula 等[7]研究提示銀杏葉提取物中的銀杏內(nèi)酯和銀杏糖苷B、C、J及M具有抗氧化功能。槲皮素和綠茶提取物對 H2O2誘導(dǎo)的Mel-Ab細胞損傷具有保護作用，且兩者具有協(xié)同抗氧化作用[8]。Becatti 等[9]研究發(fā)現(xiàn)，辣椒辣素可抑制細胞內(nèi) ROS 的產(chǎn)生,提高細胞抗氧化能力，降低脂質(zhì)過氧化水平，抑制 Caspase 級聯(lián)反應(yīng)，從而延緩白癜風(fēng)進程。姜黃素是從姜科姜黃屬植物姜黃、郁金、莪術(shù)等的根莖中提取的一種天然有效成分，具有抗氧化效應(yīng)[10]。本研究使用MTT法觀察姜黃素對100 μmol/L的H2O2誘導(dǎo)細胞凋亡保護效應(yīng)，結(jié)果顯示10 μmol/L姜黃素預(yù)處理后,OD值顯著增加,提示姜黃素可以增強人黑素細胞的增殖活力。DCFH-DA法是常用的檢測細胞內(nèi)ROS含量的方法,其基本原理是DCFH-DA穿過細胞膜進入細胞內(nèi),與細胞內(nèi)ROS反應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)橛袩晒獾腄CF,進一步通過儀器接受其熒光信號。本研究結(jié)果顯示隨著H2O2濃度的增加,DCF強度越大,當(dāng)10 μmol/L姜黃素預(yù)保護2 h時,DCF強度降低。結(jié)果提示,H2O2刺激人黑素細胞抑制細胞增殖,10 μmol/L姜黃素可減緩H2O2的抑制效應(yīng),這一途徑可能是通過抑制ROS產(chǎn)生或加快ROS清除實現(xiàn)的。

皮膚暴露在物理、化學(xué)等環(huán)境下，催化產(chǎn)生ROS，皮膚細胞啟動抗氧化機制抑制ROS的過量生成，從而維持細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。Nrf2/KEAP1信號通路是細胞內(nèi)重要的內(nèi)源性抗氧化防御信號通路，在細胞抗氧化防御中發(fā)揮關(guān)鍵作用。Nrf2是一種含有亮氨酸拉鏈基本結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，屬于Cap-n-Colla(rCNC)調(diào)節(jié)蛋白家族，廣泛表達于各種細胞中，如肝臟、腎臟、皮膚、肺及消化道等[11]。Nrf2可與胞核內(nèi)的抗氧化反應(yīng)元件(ARE)的DNA序列結(jié)合，調(diào)控下游一系列II相解毒酶和抗氧化蛋白/酶的表達。在靜息狀態(tài)下，Nrf2與胞漿內(nèi)Keap1相結(jié)合鉚釘在胞漿中，通過泛素蛋白酶體途徑降解[12]。當(dāng)細胞遭受一定強度的外界氧化應(yīng)激刺激時，Nrf2與Keap1解偶聯(lián)并轉(zhuǎn)移入核,與核內(nèi)的ARE結(jié)合,啟動Ho-1、Sod1、Cat等一系列II相解毒酶和抗氧化基因的表達,維持細胞內(nèi)氧化-抗氧化平衡。然而,當(dāng)外界強度過大，超出細胞內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)清除ROS能力時，打破氧化-抗氧化平衡,最終引起細胞損傷。本研究結(jié)果顯示10 μmol/L的姜黃素預(yù)處理細胞2 h，Nrf2的表達量顯著升高，此外，下游抗氧化基因Ho-1、Sod1、Cat的mRNA水平都顯著升高。結(jié)果提示，H2O2刺激人黑素細胞抑制Nrf2/KEAP1信號通路,10 μmol/L的姜黃素可通過上調(diào)Nrf2蛋白及其下游基因表達，從而啟動Nrf2/KEAP1信號通路，保護細胞正常生理功能。

至今,白癜風(fēng)并沒有完全治愈的特效方法，氧化應(yīng)激作為參與白癜風(fēng)發(fā)病的重要因素，通過外源性增加抗氧化劑，防止細胞內(nèi)ROS的過度產(chǎn)生，對穩(wěn)定病情有重要意義。本研究證實姜黃素對H2O2誘導(dǎo)人黑素細胞損傷具有保護效應(yīng)，通過抗氧化作用實現(xiàn)，我們推測Nrf2/KEAP1信號通路在保護人黑素細胞抵抗外界氧化損傷中發(fā)揮重要作用。此外，白癜風(fēng)患者的黑素細胞中Nrf2/KEAP1信號通路也可能存在異常，使得其對氧化應(yīng)激較為敏感。隨著研究的不斷深入，對姜黃素如何激活Nrf2/KEAP1信號通路的進一步了解，將有助于更加全面理解姜黃素在人黑素細胞氧化還原平衡維持與調(diào)節(jié)中的作用，為白癜風(fēng)抗氧化防治提供新思路。

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(收稿：2016-08-01)

Curcumin preprotect human melanocytes from oxidative stress induced by H2O2

Dong Yan,Zeng Weihui,Li Wenbin.

The Second Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University (Xi’an 710004)

Objective: To investigate the protective effects of curcumin on human melanocytes against oxidative stress induced by H2O2through activation of Nrf2. Methods: 24 h treatment with different concentrations of H2O2(50, 100, 200 μmol/L) on human melanoma cells to select the optimum in vitro induction concentration of H2O2. Moreover, the optimum H2O2stimulation of 24 h was used under the pretreatment with 10 μmol/L curcumin for 2 h. MTT was used to detect the cell viability; intracellular reactive oxygen species(ROS) content was tested by flow cytometry; the expressions of Nrf2、Ho-1、Sod1、Cat mRNA were detected using Real-time PCR; Western blot was used to test the expression of NRF2. Results: Cell viability decreased significantly after treatment of 100 μmol/L H2O2for 24 h, while strengthened significantly after 10 μmol/L curcumin pretreatment for 2 h. The intracellular ROS content decreased significantly by detection of flow cytometry. Nrf2 increased by detection of Western blot. The Real-time PCR results suggest that Nrf2, Ho-1, Sod1 and Cat mRNA were significantly improved. Conclusion：Curcumin protect human melanoma cells against H2O2induced oxidative stress damage through activation of the Nrf2 signaling pathway. Nrf2 is suggested to be the key molecules in the pathogenesis of vitiligo oxidative stress, which provide a method to the treatment of vitiligo.

Curcumin Melanocytes Oxidative stress NF-E2-related factor 2

姜黃素 黑素細胞 氧化性應(yīng)激 NF-E2相關(guān)因子2

R758.41

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.02.006