滕 月,賀 芳,張 鍵,張 燕△

1.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科(西安 710061)，西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心 (西安 710061)

·基礎(chǔ)研究·

EG00229對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖侵襲的作用及機(jī)制*

滕 月1,賀 芳2,張 鍵2,張 燕2△

1.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科(西安 710061)，西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心 (西安 710061)

目的： 初步探討EG00229對(duì)卵巢癌細(xì)胞侵襲、增殖的作用及其分子機(jī)制。 方法：采用鋪Matrigel 基質(zhì)膠Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的侵襲能力；采用細(xì)胞計(jì)數(shù)方法檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力；采用Western blotting檢測(cè)下游信號(hào)分子的表達(dá)變化。結(jié)果：EG00229顯著抑制SKOV3卵巢癌細(xì)胞的侵襲、增殖，EG00229發(fā)揮作用的機(jī)制是通過抑制VEGFR2磷酸化和抑制ERK MAPK信號(hào)通路而抑制卵巢癌細(xì)胞增殖、侵襲。結(jié)論：EG00229可以作為一個(gè)潛在的卵巢癌治療藥物。

上皮性卵巢癌(Epithelial ovarian cancer, EOC)發(fā)病率占全部女性生殖道惡性腫瘤的四分之一，同時(shí)也是惡性程度和致死率最高的婦科腫瘤[1-2]。雖然近年來卵巢癌的診斷和治療技術(shù)有了明顯的提高,但其5年生存率仍低于30%，目前腫瘤轉(zhuǎn)移已經(jīng)成為導(dǎo)致卵巢癌病例死亡的主要原因之一[3-4]。Nrp1是一種單次跨膜受體,起初在非洲爪蟾神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)[5-6 ]。Nrp1識(shí)別的配體是semaphorin 3和VEGF[7],在多種類型的腫瘤中發(fā)揮重要作用。據(jù)報(bào)道,Nrp1參與自分泌VEGF165依賴的信號(hào)途徑促進(jìn)乳腺癌轉(zhuǎn)移[8]；Nrp1促進(jìn)肺癌細(xì)胞和腎癌細(xì)胞發(fā)生增殖、遷移、侵襲[9]；Nrp1還促進(jìn)人腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞的增殖、侵襲[10]。以上研究結(jié)果提示Nrp1可能是一個(gè)卵巢癌有效的治療靶點(diǎn)。EG00229是David研究小組設(shè)計(jì)并開發(fā)的針對(duì)Nrp1的特異性抑制劑[11]。EG00229可以與Nrp1 b1結(jié)構(gòu)域末端的loops結(jié)合,封閉Nrp1的VEGF165結(jié)合位點(diǎn),阻斷Nrp1與VEGF的結(jié)合。EG00229可以同時(shí)靶向于血管生成和腫瘤生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移,可能作為一個(gè)有效的候選卵巢癌治療策略。在本研究中,我們?cè)噲D初步研究EG00229對(duì)于卵巢癌細(xì)胞增殖、侵襲的作用。

材料與方法

1 材 料 卵巢癌細(xì)胞系SKOV3為本實(shí)驗(yàn)室保存；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；EG00229購(gòu)自美國(guó)MCE公司；Matrigel基質(zhì)膠購(gòu)自美國(guó)BD公司；Western blot發(fā)光底物Super Signal Fem to Substrate Kit購(gòu)自美國(guó)Pierce公司；兔抗Nrp1抗體、兔抗VEGFR2、兔抗P-VEGFR2購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。

2 方 法 ①細(xì)胞培養(yǎng)：SKOV3細(xì)胞使用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37 ℃、5% CO2，每隔2 d傳代1次為對(duì)照組。EG00229處理組中細(xì)胞培養(yǎng)液中加入終濃度為20 μmol/L的 EG00229,其他培養(yǎng)條件同對(duì)照組。②細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)：將凍存于-80℃的Matrigel基質(zhì)膠置于4 ℃過夜液化,用無血清培養(yǎng)基以1∶5的比例進(jìn)行稀釋(以上操作均在4 ℃冰上進(jìn)行)。Transwell置于24孔板中,上室加500 μl Matrigel稀釋液,置于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育2 h直至Matrigel固化。消化細(xì)胞后計(jì)數(shù),每室加3×105個(gè)細(xì)胞,下室加800 μl 20%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基,37 ℃培養(yǎng)48 h。取出Transwell小室,PBS清洗2遍后,用棉簽小心擦去內(nèi)室細(xì)胞,5%戊二醛固定10 min,姬姆薩染料染色30 min。倒置顯微鏡下觀察小室外側(cè)細(xì)胞,每個(gè)樣本隨機(jī)計(jì)數(shù)10個(gè)視野取平均值。③細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)：將對(duì)照細(xì)胞和EG00229處理細(xì)胞分別種入96孔板中,每孔5×103個(gè),設(shè)5個(gè)復(fù)孔。每隔24 h消化細(xì)胞,用Countess細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù),連續(xù)計(jì)數(shù)5 d。④Western blotting：細(xì)胞經(jīng)PBS漂洗后加入預(yù)冷的細(xì)胞裂解液,用細(xì)胞刮刀將細(xì)胞刮下來,冰浴30 min讓細(xì)胞充分裂解,離心后取上清。BCA法定量后進(jìn)行SDS-PAGE,結(jié)束后將膠從電泳槽取出,與NC膜一起放在轉(zhuǎn)移緩沖液浸泡10 min,按順序?qū)V紙、膠、NC膜放入轉(zhuǎn)移夾子中安裝入槽,轉(zhuǎn)移3 h后取出NC膜，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h,用適當(dāng)比例Nrp一抗或GAPDH一抗4 ℃孵育過夜,TBST洗膜3次后用適當(dāng)比例二抗室溫孵育1 h,洗膜3次后化學(xué)發(fā)光。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用GraphPad軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)分析，P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 Nrp1促進(jìn)SKOV3卵巢癌細(xì)胞侵襲 見圖1。過表達(dá)Nrp1的SKOV3細(xì)胞的小室外側(cè)細(xì)胞數(shù)目明顯多于對(duì)照細(xì)胞，隨機(jī)取10個(gè)視野進(jìn)行定量分析，過表達(dá)Nrp1細(xì)胞的數(shù)目約是對(duì)照細(xì)胞的4.5倍，約增多了3.5倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。以上結(jié)果表明：與對(duì)照SKOV3細(xì)胞相比，過表達(dá)Nrp1的SKOV3細(xì)胞的侵襲能力明顯增強(qiáng)，Nrp1促進(jìn)SKOV3卵巢癌細(xì)胞侵襲。

圖1 不同Nrp1表達(dá)水平的SKOV3卵巢癌細(xì)胞侵襲能力比較(姬姆薩染色×20倍)

2 EG00229抑制SKOV3卵巢癌細(xì)胞侵襲 見圖2。明確了Nrp1的作用后，我們采用Nrp1的特異性抑制劑EG00229處理SKOV3，通過EG00229封閉Nrp1的功能，然后利用細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)比較對(duì)照細(xì)胞與經(jīng)EG00229處理的SKOV3細(xì)胞的侵襲能力的差異。處理組細(xì)胞的培養(yǎng)基中添加了20 μmol/L的 EG00229(上、下室均添加，其他條件同前)，48 h后倒置顯微鏡下觀察小室外側(cè)細(xì)胞數(shù)目。經(jīng)EG00229處理的SKOV3細(xì)胞的小室外側(cè)細(xì)胞數(shù)目明顯少于對(duì)照細(xì)胞，隨機(jī)取10個(gè)視野進(jìn)行定量分析，EG00229處理細(xì)胞的數(shù)目約是對(duì)照細(xì)胞的1/3，約減少了60%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。以上結(jié)果表明：與對(duì)照細(xì)胞相比，EG00229處理細(xì)胞的侵襲能力明顯降低，EG00229抑制SKOV3卵巢癌細(xì)胞侵襲。

圖2 對(duì)照組與EG00229處理組SKOV3卵巢癌細(xì)胞侵襲能力比較(姬姆薩染色×20倍)

3 EG00229抑制SKOV3卵巢癌細(xì)胞增殖 見圖3。為了檢測(cè)EG00229對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖能力的影響，我們用EG00229處理細(xì)胞(培養(yǎng)基中添加了20 μmol/L的 EG00229，每2 d換液一次,其他條件同前)，對(duì)培養(yǎng)不同天數(shù)的細(xì)胞分別進(jìn)行了計(jì)數(shù)，通過細(xì)胞數(shù)目評(píng)價(jià)細(xì)胞增殖能力。與未經(jīng)任何處理的SKOV3對(duì)照細(xì)胞相比，經(jīng)EG00229處理的SKOV3卵巢癌細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)目在第2天時(shí)便有所減少，第3天及以后約減少50%左右，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。以上結(jié)果表明：與對(duì)照細(xì)胞相比，EG00229處理細(xì)胞的增殖能力明顯降低，EG00229抑制SKOV3卵巢癌細(xì)胞增殖。

圖3 對(duì)照組與EG00229處理組SKOV3卵巢癌細(xì)胞增殖能力比較

4 EG00229抑制VEGF下游活化信號(hào) 見圖4。EG00229的作用原理是封閉Nrp1 b1結(jié)構(gòu)域，使其不能與配體VEGF結(jié)合，進(jìn)而影響VEGF(血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子)下游信號(hào)通路。因此我們檢測(cè)了不同處理組細(xì)胞VEGFR和ERK MAPK的磷酸化，檢測(cè)EG00229處理對(duì)其的影響。與未經(jīng)任何處理的SKOV3對(duì)照細(xì)胞相比，經(jīng)EG00229處理的SKOV3卵巢癌細(xì)胞的VEGFR2的磷酸化明顯下降，ERK MAPK的磷酸化也明顯下降，而其蛋白總量維持不變。以上結(jié)果表明： EG00229可能通過抑制抑制VEGFR2和ERK MAPK的磷酸化來抑制SKOV3卵巢癌細(xì)胞的增殖和侵襲。

圖4 對(duì)照組與EG00229處理組SKOV3卵巢癌細(xì)胞相關(guān)分子表達(dá)情況

討 論

Nrp1是一種多功能單次跨膜受體，參與調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞導(dǎo)向和軸突生長(zhǎng)[5]、內(nèi)皮細(xì)胞活化增殖和遷移[5]。近期研究發(fā)現(xiàn),Nrp1介導(dǎo)獨(dú)立的信號(hào)通路在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起關(guān)鍵作用[8-10]。Nrp1既分布于腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞上,也直接分布于腫瘤細(xì)胞上,在這兩個(gè)部位分別發(fā)生作用[6]。 因此，以Nrp1為靶點(diǎn)設(shè)計(jì)的小分子藥物能更好的發(fā)揮抑制腫瘤的作用。

Nrp1的胞外結(jié)構(gòu)區(qū)含900多氨基酸殘基,由5個(gè)模塊化結(jié)構(gòu)域組成,分別是a1、a2、b1、b2和c結(jié)構(gòu)域[5]。b1和b2結(jié)構(gòu)域同源于凝血因子FV和FVIII的c1和c2盤狀結(jié)構(gòu)域，是VEGF的結(jié)合結(jié)構(gòu)域[5]。根據(jù)b1結(jié)構(gòu)域的X-線晶體結(jié)構(gòu)信息,David課題組利用VEGF165的C末端短肽的結(jié)構(gòu)為起始點(diǎn)設(shè)計(jì)發(fā)現(xiàn)了一種小分子EG00229，它能阻止VEGFA-Nrp1結(jié)合，降低肺癌細(xì)胞A549的生存能力，還能增加細(xì)胞毒藥物(如5-氟尿嘧啶、紫杉醇、順鉑)對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷效力[11]。但EG00229對(duì)卵巢癌細(xì)胞的作用尚未見到報(bào)道。

在本研究中，我們初步探索了EG00229對(duì)于卵巢癌細(xì)胞SKOV3的增殖、侵襲的作用，發(fā)現(xiàn)EG00229可以有效的抑制SKOV3細(xì)胞的增殖和侵襲，且通過抑制VEGFR2的磷酸化和ERK MAPK的活化發(fā)揮作用。本研究明確了Nrp1特異性抑制劑EG00229對(duì)于卵巢癌的抑制作用，初步揭示了EG00229作為臨床上治療卵巢癌候選藥物的可行性。

[1] 楊念念,嚴(yán)亞瓊,龔 潔,等.中國(guó)2003-2007年卵巢癌發(fā)病與死亡分析[J].中國(guó)腫瘤, 2012, 21(6)：401-405.

[2] 崔 婧.卵巢癌中Micro RNAs的研究進(jìn)展[J].陜西醫(yī)學(xué)雜志, 2011,40(9)：1233-1236.

[3] Suh DH, Kim JW, Kang S,etal. Major clinical research advances in gynecologic cancer in 2013 [J]. J Gynecol Oncol, 2014, 25(3)：236-248.

[4] 王 靜,陶 鍵，衰 超.卵巢癌患者聯(lián)合檢測(cè)血清TK1、CA125的臨床價(jià)值 [J].中華全科醫(yī)學(xué)，2014，12(6)：975-976.

[5] Prud'homme GJ, Glinka Y. Neuropilins are multifunctional coreceptors involved in tumor initiation, growth, metastasis and immunity [J]. Oncotarget, 2012, 3(9)：921-939.

[6] Raimondi C, Ruhrberg C. Neuropilin signalling in vessels, neurons and tumours [J]. Semin Cell Dev Biol, 2013, 24(3):172-178.

[7] Koch S. Neuropilin signalling in angiogenesis [J]. Biochem Soc Trans, 2012, 40(1)：20-25.

[8] Vintonenko N, Pelaez-Garavito I, Buteau-Lozano H,etal. Overexpression of VEGF189 in breast cancer cells induces apoptosis via NRP1 under stress conditions[J].Cell Adh Migr, 2011, 5(4)：332-343.

[9] Lai WY, Wang WY, Chang YC,etal. Synergistic inhibition of lung cancer cell invasion, tumor growth and angiogenesis using aptamer-siRNA chimeras [J]. Biomaterials, 2014, 35(9):2905-2914.

[10] Hamerlik P, Lathia JD, Rasmussen R,etal.Autocrine VEGF-VEGFR2-Neuropilin-1 signaling promotes glioma stem-like cell viability and tumor growth [J]. J Exp Med, 2012, 209(3)：507-520.

[11] Jarvis A,Allerston CK,Jia H,etal. Small molecule inhibitors of the neuropilin-1 vascular endothelial growth factor A (VEGF-A) interaction [J]. J Med Chem, 2010,53(5)：2215-2226.

(收稿：2016-07-01)

The effects and mechanism of EG00229 on the proliferation and invasion of ovarian cancer cells

Teng Yue,He Fang,Zhang Jian,et al.

Department of Obstetrics and Gynecology,The First Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University (Xi’an 710061)

Objective: To investigate the effects and mechanism of EG00229 on the proliferation and invasion of ovarian cancer cells. Methods: Transwell assays were employed to examine the invasion abilities of ovarian cancer cells. Cell number counting assays were performed to detect the cell proliferation. Western blotting was performed to detect the expression of downstream signaling molecules. Results: EG00229 significantly inhibited the proliferation and invasion of SKOV3 cells via suppressing the phosphorylation of VEGFR2 and activation of ERK MAPK.Conclusion: EG00229 can be exploited as a potential drug in the treatment of ovarian cancer.

Ovarian neoplasms Cell proliferation Gene expression regulation, neoplastic @EG00229

*國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81670806，81300716) 教育部高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金項(xiàng)目(20120201120089)

陜西省衛(wèi)生廳科研基金項(xiàng)目(2012D59)

卵巢腫瘤 細(xì)胞增殖 基因表達(dá)調(diào)控,腫瘤 @EG00229

R737.31

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.02.001

△通訊作者