杜雄偉，冮 潔，李 焱，唐文彥，耿亞娟，王佳碩

(大連民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，遼寧 大連 116605)

豬源沙門氏菌的耐藥性檢測與分析

杜雄偉，冮 潔，李 焱，唐文彥，耿亞娟，王佳碩

(大連民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，遼寧 大連 116605)

采集遼寧省大連市鮮豬肉78份，選擇性培養(yǎng)基分離沙門氏菌，劃線純化后，通過invA 序列對菌株進行鑒定，采用紙片瓊脂擴散法(K-B法)檢測沙門氏菌對12種抗生素的耐藥性。結(jié)果共得到15株沙門氏菌，檢出率為19.23 %。沙門氏菌對各種抗生素的耐藥率在0 %～73.3 %，其中對硫酸慶大霉素的耐藥率最高，為73.3 %；對其他抗菌藥物的耐藥率依次是鹽酸諾氟沙星(60 %)、氟苯尼考、鹽酸環(huán)丙沙星(53.3 %)>阿莫西林(13.3 %)>頭孢噻吩、頭孢噻肟、氨芐西林(6.7 %)>頭孢曲松、頭孢他啶、氨曲南、亞胺培南(0 %)，共產(chǎn)生10種耐藥譜。由此表明，目前大連市開發(fā)區(qū)的超市和農(nóng)貿(mào)市場受沙門氏菌污染率較高，并且沙門氏菌對各類抗生素表現(xiàn)出了多重耐藥譜，應(yīng)該給予足夠的重視。

大連市；豬肉；沙門氏菌；耐藥性

在畜禽養(yǎng)殖過程中，抗生素不僅用于控制治療疾病，還常作為提高動物抗病力，促進生長的飼料添加劑使用[1]，但是有些養(yǎng)殖戶大量使用甚至濫用抗菌藥物，導(dǎo)致出現(xiàn)耐藥菌和沙門氏菌多重耐藥現(xiàn)象，其耐藥譜也越來越廣。因此，通過耐藥性試驗，掌握沙門氏菌的耐藥譜，從而為臨床醫(yī)學(xué)治療中抗生素的合理使用提供科學(xué)依據(jù)，對食品安全具有重要意義。

孫曉林等[2]對蘭州市肉與肉制品微生物污染狀況研究結(jié)果表明，肉樣沙門氏菌檢出率為14 %。楊保偉[3]等檢測陜西部分地區(qū)食品中沙門氏菌污染情況，結(jié)果表明沙門氏菌在豬肉中檢出率為19.4 %。洪文展等[4]發(fā)現(xiàn)深圳市售肉品沙門氏菌污染率為 26.2%。本研究對遼寧省大連市豬源性沙門氏菌進行分離、鑒定及對12種抗生素進行藥敏性分析,旨在更好的了解沙門氏菌耐藥情況,為確保食品安全提供可信數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

2015年10月至2016年5月期間，采集遼寧省大連市開發(fā)區(qū)金瑪、金發(fā)地等超市和大型農(nóng)貿(mào)市場的新鮮豬肉樣品68份，從這些樣品中共分離15株沙門氏菌。對照菌株為E.coilATCC25922。

1.1.2 培養(yǎng)基及試劑

SS瓊脂培養(yǎng)基、水解酪蛋白(mueller-hinton,MH)液、固培養(yǎng)基(北京奧特星生物有限公司)；瓊脂糖、Taq DNA 聚合酶、dNTP 及分子質(zhì)量標準DL2000(大連寶生物公司)；藥敏紙片(杭州濱河微生物試劑有限公司)。

1.1.3 藥敏紙片

β-內(nèi)酰胺類：頭孢曲松(CRO,30 μg·片-1)，頭孢噻吩(KF,30 μg·片-1)，頭孢噻肟(CTX，30 μg·片-1)，頭孢他啶(CAE，30 μg·片-1)，氨芐西林(AMP，10 μg·片-1)，氨曲南(ATM,35 μg·片-1)，亞胺培南(IPM，10 μg·片-1)，阿莫西林(AMO，10 μg·片-1)。

氯霉素類：氟苯尼考(FLO，30 μg·片-1)。

氨基糖苷類：硫酸慶大霉素(GEN，10 μg·片-1)。

喹諾酮類：鹽酸諾氟沙星(NIA，5 μg·片-1)，鹽酸環(huán)丙沙星(CH，5 μg·片-1)。

以上共有12種藥敏紙片。

1.2 方法

1.2.1 采樣

每個采集點采集少量新鮮豬肉，無菌封好后放置于保鮮袋內(nèi)帶回實驗室，在無菌條件下，按編號用經(jīng)酒精燈消毒的鑷子和手術(shù)刀取樣少量，剪碎后移入裝有營養(yǎng)肉湯的試管內(nèi)，置于搖床中37 ℃培養(yǎng)18～24 h。

1.2.2 選擇性培養(yǎng)與增菌

經(jīng)過液體培養(yǎng)后的樣品前增菌液經(jīng)過平板劃線接種于SS瓊脂培養(yǎng)基，置于36±1 ℃下倒置培養(yǎng)18～24 h[5]。根據(jù)菌落形態(tài)，挑取沙門氏菌可疑菌落。將實驗待檢測菌株與陽性菌株劃線接種于SS斜面培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h；再從培養(yǎng)基上用滅菌的接種環(huán)挑取一環(huán)菌落在營養(yǎng)瓊脂平板上進行劃線，37 ℃恒溫條件培養(yǎng)24 h以分離單菌落。

1.2.3 PCR方法

將純化的單菌落接種于裝有滅菌營養(yǎng)肉湯的1 mL Ep管中，37 ℃恒溫培養(yǎng)18～24 h，12 000 r·min-1離心3 min，收集菌體，用移液槍吸取200 μL無菌水于EP管內(nèi),清洗2次。清洗后再加入200 μL無菌水。在水浴鍋內(nèi)煮10 min,然后在冰塊里冷卻5 min,最后在10 000 r·min-1條件下離心5 min。取上清液1 mL 于EP管中。參照文獻[6]中的引物序列(由大連寶生物公司合成)，擴增基因為invA基因，擴增片段長度為284 bp。PCR擴增體系25 μL, ExTaq酶(5 U ·μL-1)0.25 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，上、下游引物各0.5 uL，dNTPMixture(各2.5 mM)2 μL，模板DNA溶液2.5 μL，ddH2O加至25 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR反應(yīng)完成后，進行電泳實驗。

1.2.4 藥敏試驗

采用紙片瓊脂擴散法(K-B法)，參考文獻[7]所述方法,從平板上挑取單個菌落接種于3 mL MHB，35 ℃培養(yǎng)6～8 h,用生理鹽水(0.89 % NaCl)校正濃度至0.5麥氏比濁，用無菌拭子蘸取菌液，涂布MHA平板，平板在室溫下干燥5 min，無菌鑷子將含藥紙片緊貼瓊脂表面，35 ℃培養(yǎng)16～18 h,量取抑菌圈直徑。大腸埃希氏菌ATCC25922作為質(zhì)控菌株，參照M100-S20[8]標準判斷敏感(S)、中介(I)和耐藥(R)，根據(jù)藥敏實驗結(jié)果，分析病原菌的耐藥譜。

2 結(jié)果與討論

2.1 鮮豬肉樣品沙門氏菌PCR檢測

從常規(guī)PCR電泳圖中明顯可見約284 bp大小的片段，測序結(jié)果與預(yù)期大小一致，與GenBank中沙門氏菌invA基因序列同源性為100 %，如圖1。

注：M為DL2000 Marker ；1，2，3，5，8，9為陽性菌株擴增產(chǎn)物；4，6，7，10，11為陰性菌株擴增產(chǎn)物

圖1 invA基因PCR擴增電泳圖

2.2 鮮豬肉樣品沙門氏菌的分離鑒定

不同來源樣品中沙門氏菌的分離情況見表1。由表1可知，所采集的鮮豬肉樣品共分離15株沙門氏菌，可見大連市開發(fā)區(qū)的超市和農(nóng)貿(mào)市場受沙門氏菌污染率較高，為19.23 %。

表1 不同來源樣品中沙門氏菌的分離情況

2.3 豬源沙門氏菌的耐藥性

豬源沙門氏菌耐藥率見表2。由表2可知，15株沙門氏菌對各種抗生素的耐藥率為0 %～73.3 %。其中對GEN的耐藥率最高，為73.3 %；對其他抗菌藥物的耐藥率大小依次是NIA(60 %)>PLO、CH(53.3 %)>AMO(13.3 %)>KF、CTX、AMP(6.7 %)；對KF、CTX、AMP的耐藥率均為6.7 %，敏感性達到70 %以上；對CRO、CAE、ATM、IPM的耐藥性均為0，敏感性達到90 %以上，這些藥物對沙門氏菌都有極強的抗菌作用。從抗生素大類來看，耐藥率依次是氨基糖苷類(73.3 %)>喹諾酮類(53.3 %～60 %)>氯霉素類(53.3 %)>β-內(nèi)酰胺類(0 %～13.3 %)。鄒立扣[9]研究表明，豬源沙門氏菌對CRO、CAE的耐藥率0 %，與本實驗相似。

表2 豬源沙門氏菌耐藥率

2.4 豬源沙門氏菌多重耐藥譜

本檢測分離得到的15株沙門氏菌的耐藥性情況見表3。15株沙門氏菌產(chǎn)生了10種耐藥譜，15株沙門氏菌中14株具有耐藥性，其中11株至少耐受2種抗生素，8株至少耐受3種抗生素。個別菌株可耐受4種以上抗生素。狄文婷[10]等對12株豬源沙門氏菌進行了藥敏試驗，結(jié)果有11株(83.3 %)至少可以耐受1種抗菌藥物，其中9株(75 %)至少耐受4種抗生素。馬孟根等[11]對30 株豬源致病性沙門氏菌進行了藥敏實驗，結(jié)果有28 株菌(93.3 %)至少對一種藥物有耐藥性。李郁[12]對合肥市屠宰生豬沙門氏菌耐藥性檢測發(fā)現(xiàn)74.3 %的沙門氏菌對至少一種抗生素產(chǎn)生耐藥性，64.7%的菌株為多重耐藥。

綜上所述，多重耐藥豬源沙門氏菌的出現(xiàn)已經(jīng)成為普遍現(xiàn)象[13-16],應(yīng)引起足夠重視，以降低此類菌感染人類的風(fēng)險，進而保證人類的健康。

表3 沙門氏菌的耐藥譜

3 結(jié) 語

本次采集鮮豬肉樣品共78份，獲得沙門氏菌15株，檢出率為19.23 %。研究結(jié)果表明，大連地區(qū)鮮豬肉污染較為嚴重，沙門氏菌檢出率較高，應(yīng)對市場流通的鮮肉產(chǎn)品引起足夠的重視，加強豬肉屠宰、運輸、加工、貯存及銷售等環(huán)節(jié)的管理，防止病原菌污染。

豬源沙門氏菌表現(xiàn)出一定的耐藥性，對各種抗生素的耐藥率在0 %～73.3 %，其中對GEN、NIA、PLO、CH、AMO耐藥率最高，依次是73.3 %、60 %、53.3 %、53.3 %、13.3 %，共產(chǎn)生10種耐藥譜。本研究的四大類抗生素中，沙門氏菌對β-內(nèi)酰胺類具有很高的敏感性，可以得到這些藥物對沙門氏菌都有極強的抗菌作用，為臨床醫(yī)學(xué)治療中抗生素的合理使用提供科學(xué)依據(jù)。

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(責(zé)任編輯 鄒永紅)

Antimicrobial Susceptibility Testing of Salmonella in Fresh Pork

DU Xiong-wei, GANG Jie, LI Yan, TANG Wen-yan,GENG Ya-juan, WANG Jia-shuo

(School of life sciences, Dalian Minzu University, Dalian Liaoning 116605, China)

Seventy-eight pork samples were collected in Dalian city Liaoning province.Salmonellawere isolated using selective medium. The isolates were identified by invA sequence analysis. The drug resistance ofSalmonellato 12 kinds of antibiotics was detected by the standard disk diffusion method (K-B). The results show that 15Salmonellawere obtained with detection frequency of 19.23%. The drug resistance rate ofSalmonellato antibiotics was 0 to 73.3%, 73.3% of 15Salmonellaisolates were resistant to GEN. The resistance frequency to other antibiotics decreased in the following order: NIA(60%)>FLO、CH(53.3%)>AMO(13.3%)>KF、CTX、AMP(6.7%)>CRO、CAE、ATM、IPM(0%). There were 10 resistance profiles. City supermarkets and farmers′ markets in Dalian Development Zone is affected by higher rate ofSalmonellacontamination, and theSalmonellashowed multiple resistance to antibiotics. The multi-drug resistant spectrum should be given sufficient attention.

Dalian city；pork；Salmonella；drug resistance

2016-07-11；最后

2016-09-11

“十二五”國家科技支撐計劃項目(2012BAD38B05)；大連市科技計劃項目(2014B11NC094)；大連金州新區(qū)科技計劃項目(KJCX-ZTPY-2014-0013)；中央高校基本科研業(yè)務(wù)費專項資金資助項目(DC2015010020401)。

杜雄偉(1978-)，男，山西長治人，講師，博士，主要從事動物源性食品安全研究。

2096-1383(2017)01-0032-04

S855.3

A