楊 波 李勝澤 馬 玲 郭蘇陽 劉紅麗 劉 健 邵均均

(蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院婦瘤科，蚌埠233004)

miR-132靶向調(diào)控Ezrin抑制卵巢癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡的實驗研究

楊 波 李勝澤 馬 玲 郭蘇陽 劉紅麗 劉 健 邵均均

(蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院婦瘤科，蚌埠233004)

目的：探討微小核糖核酸分子(miRNA)-132在卵巢癌中生物學(xué)作用和作用靶點。方法：收集22例卵巢癌及癌旁非腫瘤組織標(biāo)本，RT-PCR檢測miR-132表達(dá)量；RT-PCR檢測人正常卵巢上皮細(xì)胞和卵巢癌細(xì)胞系中miR-132表達(dá)量；選擇miR-132表達(dá)量最高或最低的卵巢癌細(xì)胞株，分別轉(zhuǎn)染陰性對照質(zhì)粒(NC)和miR-132 mimic質(zhì)粒，RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染后miR-132表達(dá)量；CCK-8法檢測細(xì)胞增殖，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡，Western blot檢測Ezrin蛋白表達(dá)。結(jié)果：卵巢癌組織中miR-132表達(dá)量顯著低于癌旁非腫瘤組織，而卵巢癌細(xì)胞系中miR-132表達(dá)量顯著低于正常卵巢上皮細(xì)胞，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；選擇卵巢癌細(xì)胞株中miR-132表達(dá)量最低卵巢癌SKOV3細(xì)胞株進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染，與轉(zhuǎn)染陰性對照質(zhì)粒相比，轉(zhuǎn)染miR-132 mimic質(zhì)粒后miR-132表達(dá)量顯著上升，細(xì)胞增殖顯著降低，細(xì)胞凋亡顯著增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；Western blot結(jié)果顯示，上調(diào)miR-132表達(dá)后，卵巢癌SKOV3細(xì)胞株中Ezrin蛋白表達(dá)顯著上升(P<0.05)。結(jié)論：在卵巢癌中，miR-132可能作為一種抑癌基因通過靶向調(diào)控Ezrin抑制卵巢癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡。

miR-132；卵巢癌；增殖；凋亡；埃茲蛋白

卵巢癌在婦科腫瘤中發(fā)病率排第三，病死率第一。卵巢癌病死率居高不下的原因是由于早期篩查和診斷困難，患者就診時大部分已經(jīng)處于中晚期，加上卵巢癌對化療的耐藥以及復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[1]。而提高卵巢癌的早期診斷和有效治療方法是目前臨床亟待解決的問題。

埃茲蛋白(Ezrin) 是ERM家族成員之一，是一種膜細(xì)胞骨架連接蛋白，能夠?qū)?xì)胞的形態(tài)、黏附和運動造成影響。Ezrin能夠?qū)⑥D(zhuǎn)移信號轉(zhuǎn)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)，在細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)方面具有重要作用[2]。Ezrin主要表達(dá)與上皮細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)，在大多數(shù)的組織中均有表達(dá)，具有廣泛的生理功能。Ezrin能夠調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞表明的黏附分子，對腫瘤細(xì)胞的生長、分化等具有重要的調(diào)節(jié)作用[3]。研究認(rèn)為，Ezrin低表達(dá)與卵巢癌的惡性程度、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移、預(yù)后等密切相關(guān)[4，5]。

染色體重塑、組蛋白修飾、DNA甲基化以及非編碼RNA調(diào)控等表觀遺傳學(xué)方面是近年來腫瘤發(fā)病機(jī)制研究的重點。其中非編碼RNA調(diào)控作為一種新穎的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制備受關(guān)注。微小核糖核酸分子(MicroRNA)是常見的非編碼單鏈RNA，廣泛參與了基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控，在炎癥發(fā)生，細(xì)胞生長、分化、增殖、凋亡，腫瘤發(fā)生，組織器官形成和信號通路調(diào)控中扮演著重要的角色。研究已經(jīng)證實，多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展與miRNA密切相關(guān)[6-8]。

miR-132定位在人類染色體17p13，與中樞神經(jīng)系統(tǒng)、腫瘤、炎癥、和血管生長密切相關(guān)。已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌、大腸癌、肝癌、非小細(xì)胞肺癌等多種人類腫瘤中miR-132低表達(dá)，發(fā)揮抑癌基因作用[9-12]。miR-132在卵巢癌中的作用并不明確，本研究旨在探討miR-132在卵巢癌中生物學(xué)作用和作用靶點，以期尋找到有效的卵巢癌診斷標(biāo)志物和治療靶點，改善患者預(yù)后。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織標(biāo)本和細(xì)胞系 收集醫(yī)院2014年8月～2016年2月手術(shù)切除的22例卵巢癌及癌旁非腫瘤組織標(biāo)本，標(biāo)本獲取后30 min內(nèi)液態(tài)氮速凍，并在-80℃條件下保存。所有患者均經(jīng)病理診斷確診，術(shù)前均未進(jìn)行放療或化療。22例患者中年齡28～62歲，平均年齡(46.65±15.48)歲。人正常卵巢上皮細(xì)胞(IOSE80)和卵巢癌細(xì)胞系(OVCAR3、A2780、SKOV3、ES2)均購自長沙贏潤生物科技有限公司，置于5%CO2、飽和濕度、37℃的胎牛血清培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)，穩(wěn)定傳代2～3次后選取對數(shù)期生長的細(xì)胞進(jìn)行實驗。

1.1.2 試劑和材料 anti-β-actin、anti-Ezrin均由美國Sigma公司提供；電泳儀、PCR儀購自美國Bio-Rad公司，CO2培養(yǎng)箱購自美國Thermo公司；流式細(xì)胞儀由美國BECKMANCOULTER公司提供。PCR引物及miR-132類似物(mimic)由上海吉瑪生物公司提供；脂質(zhì)體LipofectamineTM2000、miRNeasy mini Kit試劑盒、RT-PCR試劑盒、TRIzol試劑盒均購自德國Qiagen公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清由美國GeneCopoeia公司提供。CCK-8試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒購自日本Dojindo公司。

1.2 方法

1.2.1 RT-PCR檢測組織和細(xì)胞中miR-132表達(dá) 病理組織切2～4薄片約100 mg，室溫裂解后加入三氯甲烷，離心后靜置，隨機(jī)選取12個樣品，每個樣品取2 μl。采用TRIzol試劑盒提取組織樣品和細(xì)胞中總RNA。制作逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，并合成修飾后的miRNA cDNA。以cDNA作為模板，制作RT-PCR的反應(yīng)體系，PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性10 min，95℃變性10 s，60℃退火20 s，72℃延伸10 min，擴(kuò)增40個循環(huán)。根據(jù)融解曲線計算循環(huán)數(shù)Ct值，Ct值越小，參與反應(yīng)的起始模板量越多，以U6作為內(nèi)參基因，計算△Ct=CtmiR-132-CtU6，miR-132的相對表達(dá)量=2-△△Ct。

1.2.2 基因轉(zhuǎn)染 構(gòu)建慢病毒感染的陰性對照質(zhì)粒(NC)和miR-132 mimic質(zhì)粒。用含1%的雙抗和5%滅活的胎牛血清培養(yǎng)基培養(yǎng)卵巢癌細(xì)胞系(選擇其中一種表達(dá)量最低或最高的)，細(xì)胞起始濃度為2×106個/孔。細(xì)胞密度達(dá)到75%時將對數(shù)期生長的細(xì)胞分為兩組(NC組和miR-132 mimic)，分別加入NC和miR-132 mimic病毒懸浮液，以新鮮培養(yǎng)基更換舊的培養(yǎng)基。RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染后miR-132表達(dá)量。

1.2.3 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖 取NC組和miR-132 mimic組分別轉(zhuǎn)染了24、48、72、96、120 h的對數(shù)生長期細(xì)胞，胰酶消化后以2×106個/孔加入到96孔板中，常規(guī)培養(yǎng)孵育3 h后加入CCK-8溶液10 μl，孵育2 h后酶標(biāo)儀測定吸光度(OD)值，繪制增殖曲線。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡 將轉(zhuǎn)染48 h后的兩組細(xì)胞用PBS清洗，胰酶消化后制成細(xì)胞懸液，離心棄上清液，PBS清洗后加入Binding buffer清洗和重懸細(xì)胞，加入碘化丙啶和Annexin V-FITC，孵育20 min制成1×105個/ml的細(xì)胞懸液，尼龍網(wǎng)過濾后上流式細(xì)胞儀測定。

1.2.5 Western blot檢測Ezrin蛋白表達(dá) 按照試劑盒說明提取細(xì)胞中的總蛋白，變性。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白含量，酶標(biāo)儀測定OD值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。配置與蛋白大小相符的分離膠和濃縮膠，蛋白上樣后濃縮膠電泳加壓。脫脂奶粉封閉，加入1∶1 000稀釋的Ezrin和1∶5 000稀釋的β-actin一抗；孵育1 h后加入1∶5 000通用二抗。孵育0.5 h后漂洗、顯影、曝光，圖像處理軟件分析Ezrin蛋白相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 卵巢癌組織和細(xì)胞中miR-132表達(dá)量 與癌旁組織比較(0.993±0.054)相比，22例卵巢癌組織中miR-132表達(dá)量(0.503±0.219)顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.302,P<0.05)(圖1A)。4種卵巢癌細(xì)胞中miR-132表達(dá)量均顯著低于卵巢正常上皮細(xì)胞株IOSE80(P<0.05)，其中SKOV3細(xì)胞株中miR-132表達(dá)量最低(圖1B)，作為后續(xù)實驗的細(xì)胞株。

2.2 轉(zhuǎn)染miR-132 mimic后SKOV3細(xì)胞株miR-132表達(dá)量上升 采用miR-132 mimic轉(zhuǎn)染SKOV3細(xì)胞株，miR-132表達(dá)量顯著上升(7.749±1.035)，與NC組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

圖1 卵巢癌組織和細(xì)胞中miR-132表達(dá)量Fig.1 miR-132 expression in ovarian cancer tissue and cell volumeNote: *.P<0.05.

圖2 轉(zhuǎn)染miR-132 mimic后SKOV3細(xì)胞株miR-132表達(dá)量上升Fig.2 Expression of miR-132 increased after transfection miR-132 mimic in SKOV3 cell linesNote: *.P<0.05.

2.3 過表達(dá)miR-132對卵巢癌細(xì)胞增殖的影響 采用轉(zhuǎn)染miR-132 mimic上調(diào)卵巢癌SKOV3細(xì)胞株miR-132表達(dá)量，CCK-8檢測各組細(xì)胞增殖情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，自72 h開始，miR-132 mimic組細(xì)胞增殖顯著降低，與NC組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

2.4 過表達(dá)miR-132對卵巢癌細(xì)胞凋亡的影響 采用轉(zhuǎn)染miR-132 mimic上調(diào)卵巢癌SKOV3細(xì)胞株miR-132表達(dá)量，流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-132 mimic組細(xì)胞凋亡顯著增加，與NC組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖4。

圖3 過表達(dá)miR-132抑制卵巢癌細(xì)胞增殖Fig.3 Overexpression of miR-132 inhibits proliferation of ovarian cancer cellNote: *.P<0.05.

圖4 過表達(dá)miR-132促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞凋亡Fig.4 Overexpression of miR-132 promotes apoptosis of ovarian cancer cellNote: *.P<0.05.

圖5 過表達(dá)miR-132促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞中Ezrin蛋白表達(dá)Fig.5 Overexpression of miR-132 promotes expression of Ezrin in ovarian cancer cellNote: *.P<0.05.

2.5 Ezrin是miR-132下游靶基因 Western blot結(jié)果顯示，上調(diào)miR-132表達(dá)后，卵巢癌SKOV3細(xì)胞株中Ezrin蛋白表達(dá)顯著上升(P<0.05)，推測Ezrin是miR-132下游靶基因。見圖5。

3 討論

卵巢癌是臨床常見的婦科生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，具有惡性程度高、病死率高以及極易出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移、預(yù)后差等特點。由于缺乏早期特異性癥狀和有效的篩查方法，卵巢癌早期不易被發(fā)現(xiàn)，而多數(shù)患者因出現(xiàn)臨床癥狀就診時已經(jīng)到了中晚期。手術(shù)+化療等綜合治療方式雖然可以取得一定的效果，但卵巢癌患者的5年生存率仍然不到30%。了解卵巢癌細(xì)胞發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，發(fā)掘差異性表達(dá)的預(yù)測分子標(biāo)志物并對其生物學(xué)功能進(jìn)行深入研究，將有助于提高卵巢癌診斷和治療水平，具有重要的臨床意義。

miRNA因其新穎的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制近年來備受關(guān)注，miRNA不編碼蛋白，通過結(jié)合下游靶基因3′-UTR影響mRNA。目前關(guān)于miRNA與卵巢癌的報道較多，Liu等[13]發(fā)現(xiàn)卵巢癌中MiR-214顯著降低。Chen等[14]通過對卵巢癌預(yù)后的研究發(fā)現(xiàn)，miR-21和附睪蛋白4(HE4)均在卵巢癌組織中高表達(dá)，兩者呈顯著正相關(guān)，復(fù)發(fā)患者miR-21和HE4表達(dá)量高于未復(fù)發(fā)患者，認(rèn)為miR-21和HE4與卵巢癌的預(yù)后有關(guān)。本研究采用RT-PCR技術(shù)，首先檢測了22例卵巢癌組織和癌旁非腫瘤組織中miR-132表達(dá)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)卵巢癌組織miR-132表達(dá)量顯著低于癌旁組織；進(jìn)一步對比了卵巢癌細(xì)胞系和正常卵巢上皮細(xì)胞中miR-132表達(dá)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，卵巢癌細(xì)胞系miR-132表達(dá)量顯著低于正常卵巢上皮細(xì)胞。說明miR-132在卵巢癌中低表達(dá)，可能作為抑制抑癌基因參與卵巢癌的發(fā)生和發(fā)展。

增殖增加和凋亡減少是腫瘤細(xì)胞最常見的兩個生物學(xué)特點，也是腫瘤形成和發(fā)展的生物學(xué)基礎(chǔ)[15]。為了研究miR-132在卵巢癌細(xì)胞中的生物學(xué)作用，本研究采用過表達(dá)質(zhì)粒miR-132 mimic轉(zhuǎn)染卵巢癌細(xì)胞SKOV3，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-132表達(dá)量顯著上升；上調(diào)miR-132表達(dá)后卵巢癌細(xì)胞的增殖受到了顯著的抑制，凋亡明顯增加。結(jié)果表明，miR-132有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制增殖的作用，與Tian等[16]結(jié)果類似。

關(guān)于miR-132相關(guān)分子信號機(jī)制存在較大差異，例如Lei等[17]研究發(fā)現(xiàn)miR-132通過調(diào)控YAP抑制肝癌細(xì)胞增殖。在垂體腫瘤的研究中，Ren等[18]發(fā)現(xiàn)，miR-132在垂體腫瘤中低表達(dá)，上調(diào)miR-132表達(dá)可以降低Sox5表達(dá)并抑制腫瘤細(xì)胞生長、侵襲和轉(zhuǎn)移。以往研究認(rèn)為，Ezrin低表達(dá)與卵巢癌的惡性程度、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移、預(yù)后等密切相關(guān)[4，5]。利用生物信息學(xué)檢索工具可以發(fā)現(xiàn)Ezrin是miR-132下游靶點之一，具有miR-132的特異性結(jié)合序列。因此，本研究進(jìn)一步檢測了上調(diào)miR-132表達(dá)后Ezrin蛋白表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Ezrin蛋白表達(dá)顯著上升。結(jié)果表明miR-132可能靶向調(diào)控Ezrin抑制卵巢癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡。

總而言之，本研究發(fā)現(xiàn)卵巢癌中miR-132低表達(dá)，miR-132可能作為一種抑癌基因，靶向調(diào)控Ezrin抑制卵巢癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡，為進(jìn)一步的分子機(jī)制研究提供了新的思路。本研究的不足之處主要有：首先臨床樣本量不足，研究結(jié)果可能存在偏倚；此外，本研究為體外細(xì)胞研究，體內(nèi)研究結(jié)果仍需要后續(xù)開展以進(jìn)一步驗證。

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[收稿2016-08-15 修回2016-10-14]

(編輯 許四平)

Experimental research of miR-132 inhibits proliferation and induces apoptosis of ovarian cancer via Ezrin

YANGBo,LISheng-Ze,MALing,GUOSu-Yang,LIUHong-Li,LIUJian,SHAOJun-Jun.

DepartmentofGynecology,theFirstAffiliatedHospitalofBengbuMedicalCollege,Bengbu233004,China

Objective:To explore the biological function of miR-132 in ovarian cancer and the target.Methods: 22 cases ovarian cancer tissue and non-tumor tissue adjacent were collected,the expression of miR-132 in tumor tissue and non-tumor tissue,normal ovarian epithelial cells and ovarian cancer cell were detected by RT-PCR.The normal ovarian epithelial cells which the expression of miR-132 maximum or minimum were chosen,and they were divided into two groups,respectively with transfection of negative control plasmid (NC) and miR-132 mimic plasmid.The expression of miR-132 after transfection was detected by RT-PCR,the cell proliferation and cell apoptosis were detected by CCK-8 method and flow cytometry instrument respectively,the expression of Ezrin protein was detected by Western blot.Results: The expression of miR-132 in tumor tissue was significantly lower than the tumor tissue adjacent,the expression of miR-132 in ovarian cancer cell lines was significantly lower than normal ovarian epithelial cells,the differences were statistically significant (P<0.05).The SKOV3 cell lines was chosed for gene transfection,compared with NC group,transfection with miR-132 mimic plasmid could significantly reduce cell proliferation,increase cell apoptosis,the difference had statistical significance (P<0.05).Western blot results showed that up-regulation miR-132 significantly increased the Ezrin protein expression in ovarian cancer SKOV3 cells (P<0.05).Conclusion: In ovarian cancer,miR-132；inhibits proliferation and induces apoptosis of ovarian cancer via Ezrin,it may be a tumor suppressor gene.

miR-132;Ovarian cancer;Proliferation;Apoptosis;Ezrin

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.01.014

楊 波(1978年-)，男，醫(yī)學(xué)碩士，副主任醫(yī)師，主要從事婦科惡性腫瘤的基礎(chǔ)和臨床方面的研究，E-mail：yangbo4836@163.com。

R737.31

A

1000-484X(2017)01-0072-05