邢艷麗,高 瀟△,張 立,樊宇婷，夏 夢(mèng)，卜亞龍

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001； 2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

調(diào)制中頻脈沖電刺激SUI大鼠會(huì)陰穴對(duì)盆底組織LOX的影響及治療機(jī)制的研究*

邢艷麗1,高 瀟1△,張 立1,樊宇婷2，夏 夢(mèng)2，卜亞龍2

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001； 2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

目的：應(yīng)用調(diào)制中頻脈沖電刺激壓力性尿失禁(SUI)大鼠會(huì)陰穴，觀察其對(duì)盆底組織中賴氨酰氧化酶(LOX)的影響及治療機(jī)制的研究。方法：采用陰道擴(kuò)張壓迫、摘除雙側(cè)卵巢術(shù)制備SUI大鼠模型。將80只雌性SD大鼠，隨機(jī)分為空白組、模型組、電針組和中頻組，每組20只。各組大鼠在治療前及治療第7天、第14天隨機(jī)選取10只大鼠進(jìn)行最大膀胱容量測(cè)定(MBC)，并處死取材，應(yīng)用酶聯(lián)免疫法觀察恥骨肌中LOX的表達(dá)及尿道下陰道壁、恥骨尿道韌帶和尿道周圍結(jié)蹄組織Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白含量以及Ⅰ/Ⅲ比值的變化。結(jié)果：與模型組相比中頻組、電針組的MBC、恥骨肌中LOX的含量、盆底支持組織中Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白含量以及Ⅰ/Ⅲ比值較模型組均明顯提高(P<0.05)，且中頻組優(yōu)于電針組(P<0.05)。 結(jié)論：中頻脈沖電刺激會(huì)陰穴能有效的增大SUI大鼠的MBC，改善臨床癥狀；中頻脈沖電刺激會(huì)陰穴能有效促進(jìn)恥骨肌中LOX的表達(dá)，進(jìn)而增加盆底結(jié)蹄組織的Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白含量以及Ⅰ/Ⅲ比值。

壓力性尿失禁；會(huì)陰穴；脈沖調(diào)制中頻電療法；賴氨酰氧化酶；膠原蛋白

壓力性尿失禁(Stress urinary incontinence，SUI)是婦產(chǎn)科常見病，是指在腹壓增加時(shí)(如咳嗽、噴嚏、大笑、提重物或體位改變等)引起的不自主尿液漏出。大量的調(diào)查報(bào)告顯示SUI的發(fā)病率約15%～65%，多發(fā)生于老年人，其中45～49歲年齡段的婦女達(dá)到高峰即65%[1]。而且許多患者對(duì)本病認(rèn)識(shí)不足或由于害羞而難于啟齒，大約只有1.5%～6%的女性尿失禁患者尋求正確的治療[2]。膠原作為具有抗拉伸作用的盆底支持組織，在控尿方面起重要作用，其含量、強(qiáng)度和網(wǎng)狀排列是維持其功能的重要影響因素，而賴氨酰氧化酶(Lysyl oxidase,LOX)是膠原和彈性纖維交聯(lián)的關(guān)鍵酶，它能夠促進(jìn)其發(fā)育成熟，維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，其活性下降會(huì)導(dǎo)致蛋白交聯(lián)強(qiáng)度下降，使盆底結(jié)構(gòu)出現(xiàn)生物力學(xué)改變。人體組織是由大量的水分、無(wú)機(jī)鹽以及各種帶電膠體組成的電解質(zhì)導(dǎo)體，脈沖調(diào)制中頻電治療儀將低頻正弦調(diào)制的具有快速最大功能性電刺激中頻脈沖電流導(dǎo)入人體產(chǎn)生刺激，使作用部位的離子濃度和分布發(fā)生顯著變化，從而影響人體組織功能[3]。本研究旨在通過(guò)應(yīng)用調(diào)制中頻脈沖電刺激SUI大鼠會(huì)陰穴，來(lái)觀察此法對(duì)SUI大鼠盆底組織LOX，Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白含量以及Ⅰ/Ⅲ比值的影響，探討該法治療壓力性尿失禁的有效性及治療機(jī)制，為臨床推廣應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

選用12周齡SPF級(jí)健康SD大鼠80只(由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)，體質(zhì)量(280±20)g。采用隨機(jī)數(shù)字法將大鼠分為空白組、模型組、電針組及中頻組，每組20只。

1.2 動(dòng)物造模

1.2.1 模型制備 本實(shí)驗(yàn)?zāi)M產(chǎn)程延長(zhǎng)加絕經(jīng)后壓力性尿失禁大鼠模型。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)入實(shí)驗(yàn)。將大鼠麻醉，仰臥位固定后排空膀胱，把F8球?qū)Ч芮岸诵藜艄饣?，插入大鼠陰? cm左右，注水?dāng)U張陰道，并對(duì)陰道口“8”字縫合，再將大鼠俯臥位固定，恥骨聯(lián)合與桌沿相切，導(dǎo)管下端懸掛100 g重物，持續(xù)壓迫6 h后撤除。陰道壓迫1周后行雙側(cè)卵巢摘除術(shù)：從大鼠背部正中做一約3 cm縱形切口，剪開背部皮膚，找到包裹在脂肪內(nèi)的粉色卵巢，結(jié)扎卵巢血管，并摘除卵巢，將組織送回腹腔內(nèi)縫合肌肉。

1.2.2 檢測(cè)模型是否成功 ①最大膀胱容量(MBC)測(cè)定:大鼠麻醉后仰臥位固定。將涂有液態(tài)石蠟的留置針前端透明套管經(jīng)尿道插入膀胱內(nèi)，見黃色尿液排出證實(shí)導(dǎo)管位于膀胱內(nèi)，排空膀胱。用無(wú)菌生理鹽水注滿留置針延長(zhǎng)管并排空管內(nèi)空氣，其白色帽端的接口與20 ml無(wú)菌注射器相連，用注射器以36 ml/h的速度向膀胱注入藍(lán)色的美蘭溶液，以尿道口溢出第一滴藍(lán)色液體所注入的美蘭體積為最大膀胱容量。②噴嚏實(shí)驗(yàn):先排空大鼠膀胱，向膀胱注入混有美蘭的生理鹽水，注入量為所測(cè)得MBC的一半，剪一段鼠須刺激大鼠鼻孔至其打噴嚏，觀察尿道口是否有藍(lán)色液體流出，如有則造模成功。

1.3 主要試劑與儀器

多功能酶標(biāo)儀(瑞士TECAN M200 PRO)；MTZ-M多功能脈沖調(diào)制中頻(北京御健康復(fù)醫(yī)療儀器有限公司)；長(zhǎng)城牌KWD-808I脈沖電療儀(江蘇武進(jìn)醫(yī)療器械廠)；0.35×50 mm華佗牌針灸針(蘇州醫(yī)療用品廠)；極片(購(gòu)置于哈爾濱昌泰大藥房)。

1.4 治療方法

空白組與模型組大鼠置于普通籠中飼養(yǎng)，均不予任何治療。中頻組大鼠采用多功能脈沖調(diào)制中頻電療機(jī)(MTZ-M型)治療，將改良極片的負(fù)極貼于大鼠會(huì)陰穴、正極貼于中極穴。啟動(dòng)開關(guān)，設(shè)置處方輸出為2 Hz，刺激量以大鼠耐受為宜(大鼠不產(chǎn)生掙扎)，每日1次，每次治療20 min，持續(xù)治療14天。電針組大鼠治療方案參照全國(guó)中醫(yī)藥行業(yè)高等教育“十二五”規(guī)劃教材(第9版)的《針灸治療學(xué)》中治療尿失禁的處方針刺，取曲骨穴、關(guān)元穴、膀胱俞、腎俞、三陰交，曲骨穴與關(guān)元穴接電針，用疏密波刺激20 min，每日1次，持續(xù)治療14天。

1.5 取材、檢測(cè)指標(biāo)及方法

最大膀胱容量測(cè)定方法同前。

1.5.1 取材 在治療前、治療第7天、第14天結(jié)束后，從各組中隨機(jī)各選取10只大鼠進(jìn)行MBC測(cè)定,測(cè)定后處死大鼠，取恥骨聯(lián)合和尾骨之間走形的恥骨肌和尿道下陰道壁、恥骨尿道韌帶和尿道周圍結(jié)締組織為標(biāo)本，標(biāo)本用生理鹽水沖洗干凈后，用液氮研磨碎、裂解液裂解，勻漿處理后冰上孵育30 min，不時(shí)用槍頭吹打勻漿液，確保組織與裂解液充分接觸，裂解后離心，取上清液，置于-80℃冰箱低溫保存?zhèn)溆?，?jì)算出上樣體積后行酶聯(lián)免疫法檢測(cè)。

1.5.2 酶聯(lián)免疫法檢測(cè) ①將已稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品加樣50 μg于酶標(biāo)板上，再加入待測(cè)樣品；②用封板膜封板后置于37℃電熱恒溫干燥箱內(nèi)，溫育30 min；③揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿用蒸餾水稀釋30倍的洗滌液，靜置30 s棄去，如此重復(fù)5次，拍干；④每孔加入酶標(biāo)試劑50 μl，空白孔除外，再次溫育、洗滌；⑤每孔加入顯色劑A 50 μl，再加入顯色劑B 50 μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色10 min；⑥每孔加終止液50 μl；⑦以空白孔調(diào)零，450 nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度(OD值)，測(cè)定在加終止液15 min內(nèi)進(jìn)行。

1.6 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果

2.1 最大膀胱容量的變化

見表1。不同時(shí)間點(diǎn)：空白組：第7天、第14天組內(nèi)比較P>0.05。模型組、電針組、中頻組：第14天與第7天、治療前比較P<0.05；第7天與治療前比較P<0.05；模型組結(jié)果說(shuō)明SUI大鼠的排尿功能在未干預(yù)的情況下有所好轉(zhuǎn)。

同一時(shí)間點(diǎn)：治療前：模型組、電針組、中頻組與空白組比較P<0.05；模型組、電針組、中頻組組間比較P>0.05。第7天：模型組、電針組、中頻組與空白組比較P<0.05；電針組、中頻組與模型組比較P<0.05；電針組與中頻組比較P>0.05。第14天：模型組、電針組、中頻組與空白組比較P<0.05；電針組、中頻組與模型組比較P<0.05；中頻組與電針組比較P<0.05。說(shuō)明中頻組的持續(xù)作用較電針組強(qiáng)。

表1 治療前后各組大鼠膀胱最大容量測(cè)定結(jié)果(±s,V/ml)

注：與模型組比較，①P<0.05；與電針組比較，②P<0.05

2.2 盆底組織LOX的表達(dá)

見表2。不同時(shí)間點(diǎn)：空白組：第7天、第14天比較P>0.05；模型組、電針組、中頻組：第14天與第7天比較P<0.05。

同一時(shí)間點(diǎn)：第7天、第14天：空白組、電針組、中頻組與模型組比較P<0.05；空白組與電針組、中頻組比較P<0.05；電針組與中頻組比較P<0.05。說(shuō)明電針及中頻電療法均能提高LOX的表達(dá)。

表2 各組大鼠盆底組織中LOX蛋白的測(cè)定結(jié)果(±s,ng/ml)

注：與模型組比較，①P<0.05；與電針組比較，②P<0.05

2.3 盆底組織Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白含量以及Ⅰ/Ⅲ比值的變化

見表3。Ⅲ型膠原蛋白：不同時(shí)間點(diǎn)：空白組、模型組：7天與14天比較P>0.05；電針組、中頻組：14天與7天比較P<0.05。同一時(shí)間點(diǎn)：7天：空白組、電針組、中頻組與模型組比較P<0.05；空白組與電針組、中頻組比較P<0.05；電針組與中頻組比較P>0.05。14天：空白組、電針組、中頻組與模型組比較P<0.05；中頻組與空白組、電針組比較P<0.05；空白組與電針組比較P>0.05。說(shuō)明中頻電的持續(xù)作用高于電針。

Ⅰ型膠原蛋白及Ⅰ/Ⅲ比值：不同時(shí)間點(diǎn)：空白組、模型組：7天與14天比較P>0.05；電針組、中頻組：14天與7天比較P<0.05。同一時(shí)間點(diǎn)：7天、14天：空白組、電針組、中頻組與模型組比較P<0.05；中頻組與電針組、空白組比較P<0.05；空白組與電針組比較P<0.05。

表3 各組大鼠盆底Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白含量(μg/L)以及Ⅰ/Ⅲ比值的測(cè)定結(jié)果(±s)

注：與模型組比較，①P<0.05；與電針組比較，③P<0.05，②P>0.05

3 討論

國(guó)際控尿協(xié)會(huì)(Intemational Continence Society,ICS)將壓力性尿失禁(SUI)定義為：腹壓突然增加時(shí)(如咳嗽、大笑、打噴嚏)導(dǎo)致尿液不自主流出，同時(shí)不伴逼尿肌的收縮。但其發(fā)病機(jī)制尚不明確，隨著吊床學(xué)說(shuō)及完整理論的提出,研究焦點(diǎn)從解剖改變逐漸轉(zhuǎn)移到形態(tài)學(xué)、超微結(jié)構(gòu)及生化功能方面。女性盆底是由封閉骨盆出口的多層肌肉和筋膜組成的,通過(guò)互相作用和支持，保持盆腔臟器的正常位置與功能。研究表明[4]，Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白是韌帶和筋膜這些支持結(jié)構(gòu)中的主要成分，其中Ⅰ型膠原直徑較粗，有很高的抗張強(qiáng)度及支持作用，Ⅲ型膠原直徑較細(xì)，與彈性有關(guān)。膠原蛋白通過(guò)廣泛共價(jià)交聯(lián)的纖連蛋白與蛋白聚糖連接交織構(gòu)成多層次、多方面、復(fù)雜的三維空間結(jié)構(gòu)，此結(jié)構(gòu)將膠原蛋白與彈性纖維緊密地連接起來(lái)，使它們不溶于水，同時(shí)具有強(qiáng)大的彈性與韌性，并能抵抗膠原酶的水解。大量的文獻(xiàn)證實(shí)膠原異常改變?yōu)镾UI發(fā)病的重要機(jī)制[5-8]。賴氨酰氧化酶(LOX)是膠原與彈性纖維通過(guò)共價(jià)交聯(lián)取得穩(wěn)定性和發(fā)育成熟的關(guān)鍵酶，它可氧化膠原纖維的賴氨酸殘基，從而啟動(dòng)交聯(lián)的形成，增加細(xì)胞外基質(zhì)的穩(wěn)定性。其活性下降或含量減少會(huì)引起膠原纖維共價(jià)交聯(lián)形成受阻，膠原發(fā)育障礙而使其易于遭受蛋白水解酶的溶解，使得筋膜韌帶這些盆底支持結(jié)構(gòu)失去應(yīng)有的生物力學(xué)性質(zhì)，從而導(dǎo)致盆底松弛和控尿基質(zhì)減弱，發(fā)生SUI。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為SUI屬于小便失禁，發(fā)病機(jī)制主要是腎氣虛衰、下焦失于固攝。本研究所選取的會(huì)陰穴，是沖、任、督脈從小腹下出體外之交匯處，主治泌尿、生殖之證。督脈為陽(yáng)脈之?？偠揭簧碇?yáng)氣，任脈為陰脈之?？?cè)稳碇帤猓瑳_脈為十二經(jīng)脈之海能調(diào)節(jié)十二經(jīng)氣血與五臟六腑，故會(huì)陰穴可調(diào)節(jié)全身氣血陰陽(yáng)及五臟六腑，使氣血充盈，臟腑調(diào)和，陰平陽(yáng)秘，從而升舉收攝、固攝下元。從解剖結(jié)構(gòu)上看，其深處為會(huì)陰中心腱，由會(huì)陰淺橫肌、肛門外括約肌和一對(duì)肛提肌以及筋膜匯合而成，當(dāng)選用低頻正弦調(diào)制的具有快速最大功能性電刺激中頻脈沖電流刺激會(huì)陰穴時(shí)，脈沖電流可刺激盆底肌肉以及陰部神經(jīng)，增加盆底肌肉的營(yíng)養(yǎng)及強(qiáng)度，從而加強(qiáng)對(duì)尿道鉗制作用和對(duì)膀胱頸的支撐，提高尿道的關(guān)閉合壓力，同時(shí)對(duì)陰部神經(jīng)的反射性刺激，可抑制逼尿肌的興奮，使膀胱底部松弛，增加逼尿肌的穩(wěn)定性。由此激發(fā)盆底肌的牽張反射，引起盆底肌的正性收縮。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，電針組與中頻組大鼠進(jìn)行治療后盆底組織中LOX表達(dá)明顯上調(diào)，筋膜與韌帶中Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白的含量明顯增加，最大膀胱容量得到顯著提高，且中頻組的療效優(yōu)于電針組。說(shuō)明脈沖調(diào)制中頻電較電針更多的誘導(dǎo)了LOX在盆底組織中的表達(dá)，由于LOX活性、數(shù)量增多，又促進(jìn)了Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白的合成發(fā)育，致使膠原纖維之間交聯(lián)的水平上升，物理機(jī)械性質(zhì)穩(wěn)定，增強(qiáng)了盆底支持和控尿結(jié)構(gòu)的抗張力，從而改善SUI大鼠的臨床癥狀。本課題組前期采用此方法治療女性SUI以及子宮脫垂等盆底功能障礙性疾病取得明顯療效[9-12]，本實(shí)驗(yàn)為中頻電療法治療女性SUI提供了客觀依據(jù)，因此應(yīng)用脈沖中頻電療法治療女性SUI值得在臨床大力推廣。

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黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目，編號(hào)：12541766。

邢艷麗(1958-)，女，主任醫(yī)師，主要從事腦卒中綜合康復(fù)的規(guī)范化臨床治療。

△通訊作者：高瀟(1983-)，男，主治醫(yī)師，主要從事臨床康復(fù)工作。

R246.1

A

1005-0779(2017)01-0053-03

2016-07-23