阮文斌，董迎輝，高曉艷，劉晨珊，林德海，林志華*

(1. 浙江萬里學(xué)院 水產(chǎn)種質(zhì)資源高效利用技術(shù)研究浙江省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 寧波 315100；2.上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306)

文蛤亮氨酸氨肽酶LAP3的基因克隆及其在幼體不同發(fā)育時期、成體不同組織的表達(dá)分析

阮文斌1,2，董迎輝1，高曉艷1，劉晨珊1，林德海1，林志華1*

(1. 浙江萬里學(xué)院 水產(chǎn)種質(zhì)資源高效利用技術(shù)研究浙江省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 寧波 315100；2.上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306)

為探索貝類LAP3基因的結(jié)構(gòu)和功能特征以及在生長發(fā)育過程中的作用，利用cDNA末端快速擴(kuò)增(RACE)法獲得文蛤LAP3(Mm-LAP3)基因的cDNA全長序列，并對其生物信息學(xué)、組織及發(fā)育時期表達(dá)特征進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示，Mm-LAP3基因cDNA全長2 037 bp，ORF區(qū)1 254 bp，編碼417個氨基酸；Mm-LAP3蛋白由Peptidase_M17超家族序列的N-端結(jié)構(gòu)域和Peptidase_M17催化結(jié)構(gòu)域組成。熒光實(shí)時定量PCR結(jié)果表明，Mm-LAP3基因在文蛤成體6個組織和幼體10個發(fā)育時期中均有表達(dá)，其中在斧足中的表達(dá)量顯著高于其他組織(P<0.05)，這與斧足蛋白含量豐富、代謝旺盛相關(guān)；在幼體10個發(fā)育時期中的表達(dá)量呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢，在D形幼蟲時期達(dá)到最高，隨后又有所降低，推測Mm-LAP3基因在早期發(fā)育時期參與了某些組織器官的形成。

文蛤；亮氨酸氨肽酶(LAP3)；基因克?。槐磉_(dá)分析

1 引言

亮氨酸氨肽酶 (Leucine aminopeptidase 3，LAP3)，是一種蛋白水解酶，能夠促進(jìn)和延長亮氨酸水解，把蛋白質(zhì)或肽鏈的N端選擇性切割成氨基酸殘基，具有促進(jìn)多肽分解、細(xì)胞增殖、細(xì)胞生長、調(diào)節(jié)傷害防御等重要功能[1—3]。它主要是在蛋白質(zhì)水解后期將各種內(nèi)肽酶降解產(chǎn)物進(jìn)一步分解，可使亮氨酸從多肽鏈的N-末端順序逐個地游離出來，產(chǎn)生氨基酸和小肽，以實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化和細(xì)胞的動態(tài)平衡[1—2]。亮氨酸是動物必須的氨基酸，主要在骨骼肌進(jìn)行代謝，可以抑制蛋白質(zhì)降解和促進(jìn)機(jī)體蛋白合成，這可能和亮氨酸代謝的關(guān)鍵酶(支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶和脫氨酶)主要分布在骨骼肌上有關(guān)，亮氨酸的缺乏可以引起生長的阻滯[4]。在小鼠上的研究結(jié)果表明，高濃度的亮氨酸可以促進(jìn)小鼠骨骼肌的蛋白質(zhì)的合成[5]；在草魚飼料中，適宜添加亮氨酸可以提高其采食量和飼料轉(zhuǎn)化效率，促進(jìn)其生長[6]；在育肥豬的飼料中添加亮氨酸可顯著提高最長肌中的脂肪含量[7]。LAP3基因在動物中已被證實(shí)，對細(xì)胞生長和機(jī)體發(fā)育具有重要的研究意義，但在海洋貝類中，有關(guān)該基因的研究相對較少，已見Wharam等[8]研究了太平洋牡蠣(Crassostreagigas)單基因序列突變(SNP)對亮氨酸氨肽酶結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性的影響；Donald等[9]通過熒光實(shí)時定量PCR(Q-RT-PCR)技術(shù)檢測了在太平洋牡蠣胚胎早期發(fā)育過程中亮氨酸氨肽酶的活性；Michael等[10]發(fā)現(xiàn)紫貽貝(Mytilusedulis)亮氨酸氨肽酶在調(diào)節(jié)鹽度方面發(fā)揮著重要作用；董迎輝[11]分析了泥蚶(Tegillarcagranosa)LAP3基因的基因結(jié)構(gòu)和時空表達(dá)特征。

文蛤(Meretrixmeretrix)是我國四大傳統(tǒng)養(yǎng)殖貝類之一，具有豐富的營養(yǎng)價值和較高的經(jīng)濟(jì)價值[12]。目前對文蛤功能基因的研究報道已有一些，主要集中在生長和免疫相關(guān)基因，生長相關(guān)基因方面有鐵蛋白亞基基因(ferritin)[13]、組織蛋白酶B(cathepsinB)[14]、生長因子受體結(jié)合蛋白2(GRB2)[15]等，免疫相關(guān)基因有熱休克蛋白70(hsp70)[16]、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)[17]、C-型凝集素(CTL)[18]，但對LAP3基因的研究卻未見報道。本實(shí)驗(yàn)克隆獲得Mm-LAP3基因的cDNA全長，并利用Q-RT-PCR技術(shù)分析了該基因在成體6個組織和幼體10個發(fā)育時期的表達(dá)量差異，以期為探索該基因在文蛤生長、發(fā)育中的作用機(jī)理奠定基礎(chǔ)，為文蛤優(yōu)良品種選育提供一定的借鑒作用。

2 材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用文蛤材料取自寧波市鄞州區(qū)丹艷水產(chǎn)養(yǎng)殖基地。解剖文蛤成貝，取其閉殼肌、內(nèi)臟團(tuán)、外套膜、斧足、水管、鰓6個組織，液氮速凍，-80℃保存?zhèn)溆谩?014年7月，通過隔離產(chǎn)卵和人工授精獲得同步發(fā)育的未受精卵、受精卵、4細(xì)胞胚胎、囊胚、原腸胚、擔(dān)輪幼蟲、D 形幼蟲、殼頂幼蟲、眼點(diǎn)幼蟲和稚貝10個發(fā)育時期樣品，液氮速凍，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 Mm-LAP3基因的cDNA全長克隆

利用Trizol法提取文蛤斧足總RNA，SMARTTMRACE cDNA Amplication試劑盒(Clontech)反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA第一鏈，作為快速擴(kuò)增的模板。根據(jù)Mm-LAP3基因的454轉(zhuǎn)錄組文庫注釋信息，利用Contig序列分別設(shè)計3′和5′端RACE特異性引物GSP1和GSP2(表1)，用Advantage 2 Polymerase 試劑盒(Clontech)擴(kuò)增Mm-LAP3基因的cDNA全長。Touch down PCR進(jìn)行3′-和5′-RACE擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳檢測，割膠回收，回收產(chǎn)物按說明書要求連接到pEASY-T1(全式金)載體，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞(全式金)中進(jìn)行克隆，菌液PCR后通過檢測，選取陽性克隆送公司測序。

表1 實(shí)驗(yàn)所用引物匯總

2.2.2 Mm-LAP3基因的序列及進(jìn)化分析

將測得的序列對比拼接，用NCBI(National Center for Biotechnology Information，NCBI)的BLAST工具驗(yàn)證Mm-LAP3基因cDNA全長的正確性；ORF Finder軟件搜索開放閱讀框；DNAMAN軟件預(yù)測其氨基酸序列；ExPASy和ExPASy Protscale軟件分別進(jìn)行蛋白質(zhì)理化性質(zhì)和疏水性分析；SignalP和TMHMM分別進(jìn)行蛋白質(zhì)信號肽和跨膜分析；SMART4.0和Swiss Model軟件分別對蛋白質(zhì)功能域和高級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測；Jpred軟件預(yù)測活性位點(diǎn)；MEGA6.0軟件進(jìn)行氨基酸相似性比對和構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2.2.3Mm-LAP3基因在不同組織和不同發(fā)育時期的表達(dá)差異分析

取上述文蛤成體6個組織和幼體10個發(fā)育時期樣品，Trizol法提取總RNA，按照Promega反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明合成cDNA第一鏈，用于Q-RT-PCR的模板，Real-L-F和Real-L-R(表1)為特異性引物，以18SrRNA(表1)基因?yàn)閮?nèi)參[15]，利用ABI 7500 FAST熒光定量PCR儀進(jìn)行Mm-LAP3基因在幼體不同發(fā)育時期及成體不同組織的定量表達(dá)分析，每個樣品設(shè)3個平行，數(shù)據(jù)采用相對值2-ΔΔCt對基因的相對表達(dá)水平進(jìn)行分析，SPSS19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

3 結(jié)果

3.1 Mm-LAP3基因cDNA全長克隆

Mm-LAP3基因的cDNA全長2 037 bp(GenBank登錄號：KU678388)，開放閱讀框1 254 bp，編碼417個氨基酸，5′非編碼區(qū)(5′UTR)351 bp，3′非編碼區(qū)(3′UTR)432 bp，3′UTR包含一個加尾信號 ATTAAA及27 bp的poly A尾(圖1)。

3.2 Mm-LAP3基因序列分析

利用ExPASy Compute推導(dǎo)出Mm-LAP3蛋白的理論分子量為45.64 kDa，理論等電點(diǎn)值6.77。ExPASy Protscale軟件預(yù)測顯示，該蛋白在氨基酸組成上極性氨基酸所占比例較高，表現(xiàn)為親水性；Signal P軟件預(yù)測表明，該蛋白沒有明顯的信號肽；TMHMM軟件在線預(yù)測，該蛋白不存在跨膜區(qū)；利用Jpred軟件在Mm-LAP3蛋白中找到兩個Zn2+結(jié)合活性位點(diǎn)。

利用SMART軟件對Mm-LAP3蛋白進(jìn)行功能域預(yù)測(圖2)，結(jié)果表明，該蛋白含有2個功能域，即Peptidase_M17超家族序列的N-端結(jié)構(gòu)域(2-88aa)和Peptidase_M17催化結(jié)構(gòu)域(96-407aa)。Swiss model軟件預(yù)測顯示，Mm-LAP3蛋白的二級結(jié)構(gòu)由283個H鍵、14個α-螺旋、16個β-折疊和38 個轉(zhuǎn)角組成，N-端結(jié)構(gòu)域主要存在α-螺旋，Peptidase_M17催化結(jié)構(gòu)域主要存在α-螺旋和β-折疊(圖3)。

3.3 Mm-LAP3相似性及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

利用MEGA 6.0軟件，對文蛤和其他14個物種進(jìn)行氨基酸序列比對，比對結(jié)果表明，文蛤(Meretrixmeretrix，KU678388)與泥蚶(Tegillarcagranosa，AFP57676.1)的相似性最高為62.2%，與文昌魚(Branchiostomafloridae，XP_002588073)、熱帶爪蟾(Xenopustropicalis，NP_001011124.1)、馬(Equuscaballus，NP_001296147.1)、褐家鼠(Rattusnorvegicus，NP_001011910.1)、倭黑猩猩(Panpaniscus，XP_003846029.1)、人(Homosapiens，BAG51065.1)等的相似性為55.8%～61.3%。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示，文蛤先與泥蚶、太平洋牡蠣、加州雙斑蛸(Octopusbimaculoides)等軟體動物聚成一支，然后與文昌魚和鱟(Limuluspolyphemus)聚在一起，最后與脊椎動物中的魚綱、爬行綱、兩棲綱、鳥綱和哺乳綱聚成一大支(圖4)。

3.4Mm-LAP3在文蛤不同組織和不同發(fā)育時期的差異分析

利用Q-RT-PCR技術(shù)，檢測Mm-LAP3基因在成體6個組織和幼體10個發(fā)育時期的時空表達(dá)特征。文蛤成體6個組織在自然狀態(tài)下Mm-LAP3基因在mRNA水平的表達(dá)狀況見圖5(各組織的LAP3基因表達(dá)量是相對于水管LAP3基因的表達(dá)量)，結(jié)果表明，在文蛤不同組織中均有表達(dá)，其中斧足中的表達(dá)量最高，并與其他組織之間存在顯著性差異(P<0.05)。幼體不同發(fā)育時期表達(dá)結(jié)果表明，Mm-LAP3基因在D形幼蟲期表達(dá)量最高，極顯著地高于其他發(fā)育時期(P<0.01)，而在擔(dān)輪幼蟲的表達(dá)量顯著高于除D形幼蟲期以外其他時期的表達(dá)量，其他時期之間則無顯著性差異(P>0.05)(圖6)。

4 討論

亮氨酸氨肽酶3是M1或M17家族的一類蛋白水解酶，在植物和動物中廣泛分布，其主要功能是在蛋白質(zhì)水解后期將各種內(nèi)肽酶降解產(chǎn)物進(jìn)一步分解[1—2]。M1和M17的C端均有1個催化結(jié)構(gòu)域，但有著不同的催化機(jī)制和結(jié)構(gòu)[19]。M17肽酶是由6個單體組成且不含有金屬肽酶模體HEXXH鋅結(jié)合體motif[20]。本實(shí)驗(yàn)獲得的Mm-LAP3基因cDNA全長2 037 bp，經(jīng)結(jié)構(gòu)域與功能域預(yù)測，編碼417個氨基酸，包括Peptidase_M17超家族序列的N-端結(jié)構(gòu)域(2-88aa)和Peptidase_M17催化結(jié)構(gòu)域(96-407aa)，并且缺失HEXXH鋅結(jié)合體motif，這說明Mm-LAP3蛋白屬于M17肽酶家族成員。至今發(fā)現(xiàn)的氨肽酶中有60%都屬于金屬酶，其中最多的結(jié)合離子是Zn2+[21]，本研究通過對Mm-LAP3蛋白高級結(jié)構(gòu)的預(yù)測，發(fā)現(xiàn)了2個Zn2+結(jié)合活性位點(diǎn)，這是M17家族成員的共同特點(diǎn)，在LAP3結(jié)合底物并發(fā)生催化反應(yīng)時具有重要作用[22]。

圖1 Mm-LAP3基因全長cDNA序列及其氨基酸序列推測Fig.1 The full-length of cDNA sequence of LAP3 gene and deduced amino acid sequence in M. meretrix加框部分分別代表起始密碼子、終止密碼子和加尾信號，* 代表蛋白翻譯結(jié)束，斜體加粗的是胞漿氨肽酶位點(diǎn)，灰色陰影部分為N-端結(jié)構(gòu)域，下劃線的部分代表Peptidase_M17催化結(jié)構(gòu)域，雙下劃線是polyA尾巴The letters boxes are the start codon, the stop codon and the polyadenylation signal sequence, the * represents the end of the protein translation, the bold italics is arylaminopeptidase site, the grey shaded part is the functional domains of N-terminal, the underlined part is the functional do-mains of Peptidase_M17, the double underlined part is polyA

圖2 用SMART軟件預(yù)測的Mm-LAP3蛋白的功能域Fig.2 Prediction of protein functional domains of Mm-LAP3 using the SMART software

圖3 Mm-LAP3蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig. 3 The prediction of Mm-LAP3 protein secondary structure 紅色為α-螺旋；黃色為β-折疊；藍(lán)色為轉(zhuǎn)角；白色為其他殘基Red represents the alpha-helix, yellow represents the beta sheet, blue represents the turn, other residues are white

圖4 基于NJ法構(gòu)建的LAP3氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.4 Neighbor-joining phylogenetic tree of LAP3 amino acid sequences

圖5 Mm-LAP3基因在文蛤成體6個組織中的表達(dá)差異分析(n=3)Fig.5 Analysis of expression difference of Mm-LAP3 gene in six tissues of adult M. meretrix(n=3)1.外套膜，2.鰓，3.內(nèi)臟團(tuán)，4.閉殼肌，5.斧足，6.水管, P<0.05 1.mantle, 2.gill, 3. digestive gland, 4. adductor muscle, 5. foot, 6.siphon, P<0.05

圖6 Mm-LAP3基因在文蛤幼體10個發(fā)育時期的表達(dá)差異分析(n>500)Fig.6 Analysis of expression of Mm-LAP3 gene in ten developmental stages of larvae in M. meretrix(n>500)1.未受精卵，2.受精卵，3.4細(xì)胞，4.囊胚，5.原腸胚，6.擔(dān)輪幼蟲，7.D形幼蟲，8.殼頂幼蟲，9.眼點(diǎn)幼蟲，10.稚貝，**代表極顯著差異，P<0.011.unfertilized mature eggs, 2.fertilized eggs, 3.four cells, 4.blastula, 5.gastrulae, 6.trochophore, 7.D-shaped larva, 8.umbo-larvae, 9.eyebot larva,10.juvenile clams, **represents very significant differences, P<0.01

LAP3作為一種氨肽酶，通過將肽鏈分解成氨基酸來實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化和新陳代謝平衡。植物L(fēng)AP3在調(diào)節(jié)傷害防御[23]、生長素受體的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)[24]、減數(shù)分裂[25]中具有重要的作用；在哺乳動物中，LAP3具有指示胎盤功能及胎兒成熟度[26]、參與生物活性肽的形成[1-2]、參與血壓調(diào)節(jié)[27]等生理功能。本實(shí)驗(yàn)對Mm-LAP3基因在6個組織中的表達(dá)情況進(jìn)行了檢測，結(jié)果表明該基因在各組織中均有表達(dá)，這與在泥蚶中的研究結(jié)果相類似[11]，說明Mm-LAP3在文蛤體內(nèi)多個生命活動中都發(fā)揮著重要功能；但不同組織間依然存在一定的差異性，其表達(dá)量由高到低依次為：斧足、閉殼肌、內(nèi)臟團(tuán)、鰓、外套膜、水管，其中在斧足和閉殼肌中表達(dá)量相對較高，而斧足和閉殼肌是文蛤肌肉最發(fā)達(dá)、蛋白含量最高的部位，由此推測Mm-LAP3可能參與蛋白代謝且與肌肉生長關(guān)系密切。內(nèi)臟團(tuán)作為主要的消化器官來實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的合成與代謝，因此表達(dá)量也相對較高。有研究結(jié)果表明，亮氨酸可以通過提高mRNA的翻譯速度而促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成[28]，本實(shí)驗(yàn)中Mm-LAP3在斧足中表達(dá)量最高，正是由于斧足是文蛤肌肉最發(fā)達(dá)的部位，需要大量的蛋白質(zhì)，LAP3通過促進(jìn)和延長亮氨酸水解來提高機(jī)體中亮氨酸的含量來促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成。

在胚胎發(fā)育過程中，蛋白質(zhì)代謝能夠促使機(jī)體發(fā)育發(fā)生特殊變化[29]。有體外實(shí)驗(yàn)研究表明，亮氨酸是細(xì)胞增殖所必需的[30]。Yang等[31]在非洲爪蟾(Xenopuslaevis)胚胎中檢測發(fā)現(xiàn)氨肽酶從原腸早期出現(xiàn)并在整個胚胎發(fā)育期間廣泛存在；馮軍廠等[32]在草魚(Ctenopharyngodonidellus)中發(fā)現(xiàn)氨肽酶參與了包括細(xì)胞生長和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種生理生化過程；Donald等[9]對太平洋牡蠣不同發(fā)育時期的氨肽酶活性和其基因轉(zhuǎn)錄量的變化趨勢進(jìn)行研究，結(jié)果表明，LAP基因在浮游幼蟲期表達(dá)量急劇升高，這可能是貝類為適應(yīng)環(huán)境所做出的生理反應(yīng)，通過調(diào)節(jié)LAP蛋白質(zhì)代謝來加強(qiáng)對外界環(huán)境的適應(yīng)能力。本研究分析了Mm-LAP3在文蛤幼體10個發(fā)育時期的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)D形幼蟲時期的表達(dá)量顯著高于其他時期，原因可能是D形幼蟲是浮游幼蟲的重要時期，該期幼蟲肌肉快速生長、細(xì)胞分裂加速、生命旺盛，且對外界環(huán)境的適應(yīng)能力亟待加強(qiáng)，因此需要更多LAP3蛋白表達(dá)；擔(dān)輪幼蟲時期LAP3表達(dá)量也較高，可能與文蛤幼蟲的肌肉(前閉殼肌和3條幼蟲收縮肌)首先出現(xiàn)在擔(dān)輪幼蟲期有關(guān)[33—34]。殼頂幼蟲時期表達(dá)量又有所下降，到稚貝表達(dá)量降到最低，這說明在文蛤早期發(fā)育過程中，LAP3表達(dá)量升高是為了完成發(fā)育變態(tài)過程，這也與LAP3具有實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)代謝和轉(zhuǎn)化有關(guān)。

5 結(jié)論

(1)Mm-LAP3基因包含M17家族特有的Pepti-dase_M17超家族序列的N-端結(jié)構(gòu)域和Peptidase_M17催化結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)2個Zn2+結(jié)合活性位點(diǎn)，氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)與其他動物具有很高的相似性，說明其序列具有較高的保守性。

(2)對Mm-LAP3基因在成體6個組織中的表達(dá)情況進(jìn)行檢測，結(jié)果表明該基因在各組織中均有表達(dá)，說明Mm-LAP3在文蛤體內(nèi)多個生命活動中都發(fā)揮著重要功能，能夠促進(jìn)和延長亮氨酸水解，其中在斧足中的表達(dá)量顯著高于其他組織，推測Mm-LAP3可能參與蛋白水解且與肌肉生長關(guān)系密切。

(3)對Mm-LAP3基因在幼體10個組織中的表達(dá)情況進(jìn)行檢測，結(jié)果表明該基因在D形幼蟲時期的表達(dá)量顯著高于其他時期，推測Mm-LAP3在早期發(fā)育時期表達(dá)量升高是為了完成發(fā)育變態(tài)過程，促使其肌肉快速生長、細(xì)胞分裂加速。

[1] Taylor A. Aminopeptidases: structure and function[J]. The FASEB Journal, 1993, 7(2): 290-298.

[2] Taylor A. Aminopeptidases: towards a mechanism of action[J]. Trends in Biochemical Sciences, 1993, 18(5): 167-171.

[3] Gonzales T, Robert-Baudouy J. Bacterial aminopeptidases: properties and functions[J]. FEMS Microbiology Reviews, 1996, 18(4): 319-344.

[4] Coloso R M, Cruz L J. Preliminary studies in some aspects of amino acid biosynthesis in juveniles ofPenaeusmonodonFabricius: I. Incorporation of 14C from (U-14C) acetate into amino acids to precipitable proteins[J]. Bulletin of the Philippine Biochemistry Society, 1980, 3(1/2): 12-22.

[5] Anthony J C, Yoshizawa F, Anthony T G, et al. Leucine stimulates translation initiation in skeletal muscle of postabsorptive rats via a rapamycin-sensitive pathway[J]. Journal of Nutrition, 2000, 130(10): 2413-2419.

[6] 鄧玉平. 亮氨酸對生長中期草魚生長、肌肉品質(zhì)和腸道免疫的影響研究[D]. 雅安: 四川農(nóng)業(yè)大學(xué), 2014.

Deng Yuping. Effects of graded levels of dietary leucine on growth, flesh quality, intestinal immunity and antioxidant statusin young grass carp (Ctenopharyngodonidella)[D]. Ya’an: Sichuan Agricultural University, 2014.

[7] Hyun Y, Ellis M, Mckeith F K, et al. Effect of dietary leucine level on growth performance, and carcass and meat quality in finishing pigs[J]. Canadian Journal of Animal Science, 2003, 83(2): 315-318.

[8] Wharam S D, Wardill T J, Goddard V, et al. A Leucine aminopeptidase gene of the Pacific oysterCrassostreagigasexhibits an unusually high level of sequence variation, predicted to affect structure, and hence activity, of the enzyme[J]. Journal of Shellfish Research, 2008, 27(5): 1143-1154.

[9] Donald K M, Day A J, Smerdon G R, et al. Quantification of gene transcription and enzyme activity for functionally important proteolytic enzymes during early development in the Pacific OysterCrassostreagigas[J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology, 2003, 136(3): 383-392.

[10] Michael N M, Richard K K, Brian L B. Leucine aminopeptidase (aminopeptidase-I), N-acetyl-β-hexosaminidase and lysosomes in the mussel,MytilusedulisL., in response to salinity changes[J]. Journal of Experimental Zoology, 1980, 214(3): 239-249.

[11] 董迎輝. 泥蚶高通量轉(zhuǎn)錄組分析及生長相關(guān)基因的克隆與表達(dá)研究[D]. 青島: 中國海洋大學(xué), 2012.

Dong Yinghui. Transcriptome analysis using 454 pyrosequencing and cloning and expression of growth-related genes for the blood clamTegillarcagranosa(Linnaeus, 1758)[D]. Qingdao: Ocean University of China, 2012.

[12] 張安國, 李太武, 蘇秀榕, 等. 不同地理種群文蛤的營養(yǎng)成分研究[J]. 水產(chǎn)科學(xué), 2006, 26(2): 79-81.

Zhang Anguo, Li Taiwu, Su Xiurong. The nutritive contents in various populations of clamMeretrixmeretrix[J]. Fisheries Science, 2006, 25(2): 79-81.

[13] Wang Xiaomei, Liu Baozhong, Xiang Jianhai. Cloning, characterization and expression of ferritin subunit from clamMeretrixmeretrixin different larval stages[J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology, 2009, 154(1): 12-16.

[14] Yao Xueliang, Zhang Jiquan, Sun Jinsheng, et al. Recombinant expression, characterization and expressional analysis of clamMeretrixmeretrixcathepsinB, an enzyme involved in nutrient digestion[J]. Molecular Biology Reports, 2011, 38(3): 1861-1868.

[15] 高曉艷, 董迎輝, 施沈佳, 等. 文蛤生長因子受體結(jié)合蛋白2(GRB2)基因克隆、時空表達(dá)及SNP位點(diǎn)篩查[J]. 水產(chǎn)學(xué)報, 2015, 39(9): 1324-1332.

Gao Xiaoyan, Dong Yinghui, Shi Shenjia, et al. Cloning, spatiotemporal expression and SNPs identification ofGRB2 gene in hard clamMeretrixmeretrix[J]. Journal of Fisheries of China, 2015, 39(9): 1324-1332.

[16] Yue Xin, Liu Baozhong, Sun Li, et al. Cloning and characterization of ahsp70 gene from Asiatic hard clamMeretrixmeretrixwhich is involved in the immune response against bacterial infection[J]. Fish & Shellfish Immunology, 2011, 30(3): 791-799.

[17] Li Hongjun, Yang Qing, Gao Xianggang, et al. Identification and expression of a putative LPS-inducedTNF-αfactor from Asiatic hard clamMeretrixmeretrix[J]. Molecular Biology Reports, 2012, 39(2): 865-871.

[18] 李猛, 周素明, 劉璐, 等. 文蛤(Meretrixmeretrix)C-型凝集素基因的分子克隆及表達(dá)分析[J]. 海洋與湖沼, 2015, 46(5): 1186-1192.

Li Meng, Zhou Suming, Liu Lu, et al. Molecular clone and expression of C-typle lectin inMeretrixmeretrix[J]. Oceanologia et Limnologia Sinica, 2015, 46(5): 1186-1192.

[19] Albiston A L, Ye Siying, Chai S Y. Membrane bound members of the M1 family: more than aminopeptidases[J]. Protein & Peptide Letters, 2004, 11(5): 491-500.

[20] Rawlings N D, Barrett A J, Bateman A. MEROPS: the peptidase database[J]. Nucleic Acids Research, 2010, 38(S1): D227-D233.

[21] Chen Guanjing, Edwards T, D’souz V M, et al. Mechanistic studies on the aminopeptidase fromAeromonasproteolytica: a two-metal ion mechanism for peptide hydrolysis[J]. Biochemistry, 1997, 36(14): 4278-4286.

[22] Guenet C, Lepage P, Harris B A. Isolation of the leucine aminopeptidase gene fromAeromonasproteolytica: evidence for an enzyme precursor[J]. Journal of Biological Chemistry, 1992, 267(12): 8390-8395.

[23] Chao W S, Gu Yongqiang, Pautot V V, et al. Leucine aminopeptidase RNAs, proteins, and activities increase in response to water deficit, salinity, and the wound signals systemin, methyl jasmonate, and abscisic acid[J]. Plant Physiology, 1999, 120(4): 979-992.

[24] Murphy A, Peer W A, Taiz L. Regulation of auxin transport by aminopeptidases and endogenous flavonoids[J]. Planta, 2000, 211(3): 315-324.

[25] Ishizaki T, Tosaka A, Nara T, et al. Leucine aminopeptidase during meiotic development[J]. European Journal of Biochemistry, 2002, 269(3): 826-832.

[26] Yamahara N, Nomura S, Suzuki T, et al. Placental leucine aminopeptidase/oxytocinase in maternal serum and placenta during normal pregnancy[J]. Life Sciences, 2000, 66(15): 1401-1410.

[27] 高應(yīng)東. 亮氨酸氨肽酶的種類及臨床應(yīng)用[J]. 國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志, 2010, 31(12): 1408-1410.

Gao Yingdong. The types and clinical application of leucine amino peptide[J]. International Journal of Laboratory Medicine, 2010, 31(12): 1408-1410.

[28] Yoshizawa F. Regulation of protein synthesis by branched-chain amino acidsinvivo[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2004, 313(2): 417-422.

[29] 王志新, 梁海鷹, 杜曉東, 等. 蛋白質(zhì)組學(xué)在貝類研究中的應(yīng)用[J]. 生命科學(xué)研究, 2014, 18(2): 184-188.

Wang Zhixin, Liang Haiying, Du Xiaodong, et al. Application of proteomic techniques to molluscs research[J]. Life Science Research, 2014, 18(2): 184-188.

[30] Chuang J C, Yu C L, Wang S R. Modulation of human lymphocyte proliferation by amino acids[J]. Clinical & Experimental Immunology, 1990, 81(1): 173-176.

[31] Yang Qiutan, Lv Xiaoyan, Kong Qinghua, et al. Dynamic expression of the LAP family of genes during early development ofXenopustropicalis[J]. Science China Life Sciences, 2011, 54(10): 897-903.

[32] 馮軍廠, 聶國興, 劉臻, 等. 草魚APN基因的克隆及表達(dá)特征[J]. 水產(chǎn)學(xué)報, 2012, 36(6): 859-867.

Feng Junchang, Nie Guoxing, Liu Zhen, et al. Clone of aminopeptidase N gene and its expression analysis inCtenopharyngodonidellustissues[J]. Journal of Fisheries of China, 2012, 36(6): 859-867.

[33] Degnan B M, Degnan S M, Morse D E. Muscle-specific regulation of tropomyosin gene expression and myofibrillogenesis differs among muscle systems examined at metamorphosis of the gastropodHaliotisrufescens[J]. Development Genes and Evolution, 1997, 206(7): 464-471.

[34] Page L R. Larval shell muscles in the abaloneHaliotiskamtschatkana[J]. The Biological Bulletin, 1997, 193(1): 30-46.

Gene cloning and expression analysis of leucine aminopeptidase LAP3 gene in different development stages of larvae and different tissues of adult of Meretrix meretrix

Ruan Wenbin1, 2, Dong Yinghui1, Gao Xiaoyan1, Liu Chenshan1, Lin Dehai1, Lin Zhihua1

(1.KeyLaboratoryofAquaticGermplasmResourcesofZhejiang,ZhejiangWanliUniversity,Ningbo315100,China; 2.CollegeofFisheriesandLifeSciences,ShanghaiOceanUniversity,Shanghai201306,China)

To explore the molecular structure and functional characteristics ofLAP3 gene and its role in the process of growth and development, full length cDNA ofLAP3 inMeretrixmeretrix(Mm-LAP3)was cloned by rapid amplification of cDNA ends technique(RACE), then the bioinformatics and expression profiles in different adult tissues and developmental stages of larvae were analyzed. The results showed that the full length cDNA ofMm-LAP3 gene was 2 037 bp, containing a complete 1 254 bp ORF encoding 417 amino acids. There were two functional domains of Mm-LAP3 protein (Peptidase_M17 and N-terminal). The result of Q-RT-PCR indicated thatMm-LAP3 expressed in six tissues and ten developmental stages, but the expression of foot was significantly higher than other tissues. The expression ofMm-LAP3 gradually increased with the process of the development, and showed the highest in D-shaped larvae stage, and then the expression decreased, which suggested thatMm-LAP3 may be involved in the formation of certain organs in early developmental stages.

Meretrixmeretrix; leucine aminopeptidase; gene cloning; expression analysis

10.3969/j.issn.0253-4193.2017.02.009

2016-04-27；

2016-11-24。

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31372527)；國家現(xiàn)代貝類產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目(CARS-48)；國家水產(chǎn)種質(zhì)資源平臺運(yùn)行服務(wù)項(xiàng)目(2015DKA30470)；蘇北科技專項(xiàng)(BN2015059)。

阮文斌(1990—)，男，浙江省寧波市人，主要從事海洋貝類分子遺傳育種研究。E-mail：wbruan@163.com

*通信作者：林志華，男，研究員，主要從事貝類遺傳育種研究。E-mail:zhihua9988@126.com

Q785

A

0253-4193(2017)02-0096-09

阮文斌，董迎輝，高曉艷，等. 文蛤亮氨酸氨肽酶LAP3的基因克隆及其在幼體不同發(fā)育時期、成體不同組織的表達(dá)分析[J].海洋學(xué)報，2017，39(2)：96—104,

Ruan Wenbin, Dong Yinghui, Gao Xiaoyan, et al. Gene cloning and expression analysis of leucine aminopeptidase LAP3 gene in different development stages of larvae and different tissues of adult ofMeretrixmeretrix[J]. Haiyang Xuebao，2017，39(2)：96—104, doi:10.3969/j.issn.0253-4193.2017.02.009