許黎明,成春燕,盧漢浪,莫祺暉,韋星明

(廣西科學院生物研究所，南寧 530007)

木薯渣堆肥的生物酶活性與有機組分降解的關系

許黎明,成春燕,盧漢浪,莫祺暉,韋星明

(廣西科學院生物研究所，南寧 530007)

木薯渣堆肥過程中，起始物料采用接種微生物菌劑與人工翻堆相結合的模式進行堆肥，經過多種生物和生物化學過程而被轉化。通過兩個實驗處理測定了堆肥過程各階段溫度，纖維素酶、蛋白酶、淀粉酶的活性和淀粉、纖維素、半纖維素、木質素、N-N、N-N-N的含量，并進行了相關性分析。結果表明，接種菌劑可使堆體快速升溫，且提高堆肥過程中的最高溫度，延長了高溫期的持續(xù)時間，達到堆肥無害化處理的目的；纖維素酶、蛋白酶和淀粉酶活性的最高值出現(xiàn)在堆肥的高溫期。生物酶活性與堆肥有機組分的含量呈顯著負相關，說明生物酶活性可以表征木薯渣堆肥中有機組分降解的狀況，指示木薯渣堆肥的發(fā)酵腐熟進程。

堆肥；木薯渣；微生物菌劑；有機組分；酶活性

木薯是廣西的重要經濟作物，木薯渣是木薯加工的主要固體廢棄物，其中粗蛋白和脂肪含量低，木質粗纖維含量較高，主要成分是纖維素、半纖維素和木質素，富含氮、磷、鉀、碳、鈣、鎂、硫、鋅、錳、銅、鐵和鈉等礦物質[1]。木薯渣作為原料在工業(yè)上可用于制取乙醇，生物酶和有機酸等，在農業(yè)上可用于食用菌栽培和動物飼料，另外，木薯渣還可以發(fā)酵生產甲烷等[2]。實際上由于木薯渣在上述應用中的消耗有限，若沒有得到及時有效的處理而大量囤積，將會對環(huán)境造成污染，給人和動物的健康埋下隱患[3-4]。高溫好氧堆肥是資源化處理利用有機固體廢棄物的有效途徑，經濟和技術的可行性高[5]，而且生物有機肥已經被廣泛證明具有減少或代替部分化肥、農藥的使用[6-7]，增強作物抗逆性[8]，改善作物品質[9]，改良土壤等優(yōu)勢[10]。因此，通過堆肥方式快速發(fā)酵腐熟木薯渣，可以將大量木薯渣制成無污染且富含有益微生物和礦質元素的生物有機肥，建立有機循環(huán)產業(yè)鏈，有效緩解環(huán)境壓力。

木薯渣堆肥發(fā)酵腐熟是由微生物主導的溫度變化過程，前期以中溫型微生物菌群為主，中后期則高溫型微生物菌群占優(yōu)勢[11]，微生物分泌的酶是其中主要因素，因而對堆肥過程中微生物及其酶活性變化進行研究，有利于了解堆肥的生化過程和腐解機制[12-13]。農業(yè)行業(yè)標準《NY 609—2002有機物料腐熟劑》也將纖維素酶、淀粉酶和蛋白酶的活性作為有機物料腐熟菌劑的產品技術指標。目前，國內對木薯渣發(fā)酵過程中生物酶的研究多集中在酶活含量的測定上[13-16]，而對于發(fā)酵過程中生物酶活性和木薯渣的理化因子間關系的研究很少。本文通過對木薯渣接種復合微生物菌劑的堆肥化過程中上述3種酶的酶活性動態(tài)變化與堆肥理化因子變化之間的相關性進行研究，以期掌握木薯渣堆肥中主要生物酶活性變化趨勢，建立堆肥生物酶活性變化與堆肥有機組分的降解過程、堆肥腐熟進程間的聯(lián)系，發(fā)掘堆肥發(fā)酵腐熟過程的生物學指標，為木薯渣堆肥生產的工藝控制提供指導。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

圖1 木薯渣堆肥過程中溫度變化Figure 1 Change of the temperature during cassava dregs composting

木薯渣堆肥混合料以木薯渣為主要原料，添加適量豆粕調節(jié)碳氮比(C/N)至30左右，麥麩作為疏松劑，調節(jié)含水率為65%，得到木薯渣發(fā)酵混合料。木薯渣取自南寧市明陽淀粉廠，其相關成分質量分數為：纖維素32.47%，半纖維素11.03%，木質素8.33%，淀粉43.46%，粗蛋白2.83%。豆粕為飼料級，購于市場，粗蛋白成分質量分數為43.21%。

接種所用的外源微生物菌劑為本實驗室篩選的復合微生物菌劑，主要包含枯草芽孢桿菌(Bacillus s ubtilis)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、嗜熱側孢霉(Sporotrichum thermophile)和放線菌(Actinomycetes)等，有效活菌數不低于5×108CFU·g-1。

1.2 試驗設計

實驗設2個處理，不接種微生物菌劑(處理1)；堆肥前期按液料質量比8‰噴施接種復合微生物菌劑(處理2)。堆肥過程中進行人工翻堆。

1.3 樣品采集

在堆肥的第 0、3、5、7、10、15、20、25、30、35、40、50 d取樣，每次分別從堆體的上、中、下層分散取樣，樣品混合均勻后，部分低溫保存，部分用于相關指標的測定。

1.4 測定內容與方法

溫度用SATOSK-110TRH-II型數顯溫度計測定。N-N用靛酚藍比色法測定，N-N-N用紫外分光光度法測定。半纖維素、纖維素、木質素用ANKOM A2000i型纖維素分析儀進行測定。纖維素酶酶活采用DNS比色法進行測定，蛋白酶酶活采用福林法進行測定，淀粉酶酶活采用I2-KI分光光度法進行測定，具體測定方法參見《NY 609—2002有機物料腐熟劑》和《QB/T 1803—1993工業(yè)酶制劑通用實驗方法》。

1.5 數據處理

采用Microsoft Office Excel和SPSS軟件進行數據處理和分析。

2 結果與分析

2.1 堆肥過程的溫度變化

木薯渣堆肥溫度變化見圖1。堆肥過程可分為升溫期、高溫期、降溫期和低溫穩(wěn)定期4個階段。處理2在第4 d堆體溫度升至62℃，進入高溫分解階段，第8 d達到最大值71℃；高溫期持續(xù)約15 d，在第25 d堆體溫度逐漸下降，到第35 d溫度接近室溫，木薯渣堆肥進入腐熟階段。處理1的堆體溫度在第7 d升至60℃，第13 d達到70℃，第20 d開始下降，此后溫度繼續(xù)下降，到第35 d接近室溫。

對比木薯渣堆肥方式的不同處理，處理2比處理1升溫快，進入高溫期早，且高溫期持續(xù)時間長。但無論是處理2還是處理1，其55℃以上堆體溫度的持續(xù)時間均達到15 d以上，可以有效殺滅致病菌而達到堆肥無害化目的。

2.2 堆肥水解酶活性和理化因子間的關系

2.2.1 堆肥纖維素酶活性變化和纖維素、半纖維素、木質素含量變化

圖2 木薯渣堆肥過程中纖維素酶活性以及纖維素、半纖維素和木質素的變化Figure 2 Change of cellulase activity，cellulose，hemicellulose and lignin during cassava dregs composting

纖維素是堆肥微生物的能源物質和碳源，而纖維素酶則是參與纖維素水解的關鍵酶。如圖2A所示，處理2在0～10 d期間，纖維素酶活力逐漸升高，當堆肥溫度升至60℃以上時，纖維素酶維持在較高的酶活水平，在第25 d后，纖維素酶活力逐漸下降。處理1在堆肥初期酶活力略有下降，在第7 d后酶活上升，在第30 d達到峰值之后酶活逐漸下降，并趨于平緩，直至堆肥結束。

堆肥腐熟的關鍵是木質纖維素這類難分解物質的快速分解[17]。

堆肥纖維素含量變化見圖2B。處理1和處理2的纖維素含量在堆肥過程中均呈下降趨勢。堆肥初始，堆體中纖維素含量為(31.37±0.46)%。處理2在第15 d其纖維素含量為(14.06±0.37)%，堆肥結束時堆體中纖維素含量為(11.79±0.39)%，處理2纖維素的降解主要集中于堆肥的前15 d，而在堆肥第35 d后，纖維素的分解緩慢；處理1在第25 d堆體中纖維素含量為(18.79±0.41)%，堆肥結束時纖維素含量為(17.53±0.48)%，處理1纖維素的分解主要集中于堆肥的前25 d，而在堆肥第25 d后，纖維素的分解緩慢。以上數據表明，木薯渣堆肥化過程中，纖維素的降解集中于堆肥高溫期，纖維素降解相對較快，之后降解速度逐漸趨于平穩(wěn)。

堆肥半纖維素含量變化見圖2C。木薯渣堆肥半纖維素初始含量為(10.66±0.22)%，處理2在第15 d其半纖維素含量為(3.35±0.33)%，堆肥結束時為(1.85±00.32)%；處理1在第25 d其半纖維素含量為(5.09±0.42)%，堆肥結束時為(2.01±0.26)%。半纖維素相對于纖維素較容易降解，其分解也集中于堆肥過程中的高溫期，在堆肥后期，半纖維素含量在堆肥中比較穩(wěn)定。

堆肥木質素含量變化見圖2D。木質素一直是自然界中極難分解的物質之一，本研究中無論是處理1還是處理2，木質素的降解都非常低。

2.2.2 堆肥淀粉酶活力變化和淀粉含量變化

木薯渣堆肥淀粉酶活力變化如圖3A。處理2在第10 d時淀粉酶活力達到最大值，在第10～30 d，淀粉酶活力逐漸下降；處理1在第15 d淀粉酶活力達到最大值，之后酶活力逐漸下降。

堆肥淀粉含量變化見圖3B。處理1和處理2的淀粉含量在堆肥過程中均呈下降趨勢。堆肥初始，堆體中淀粉的含量較高，為(41.99±0.52)%。處理2在第15 d其淀粉含量為(8.55±0.49)%，堆肥結束時堆體中的淀粉含量為(3.2±0.53)%；處理1在第25 d其淀粉含量為(10.25±0.52)%，堆肥結束時堆體中的淀粉含量為(5.71±0.45)%。以上數據表明，木薯渣堆肥化過程中，淀粉的降解集中于堆肥高溫期，淀粉降解相對較快，之后降解速度逐漸趨于平穩(wěn)。

圖3 木薯渣堆肥過程中淀粉酶活性和淀粉的變化Figure 3 Change of amylase activity and starch during cassava dregs composting

木薯渣堆肥蛋白酶活力變化如圖4A所示。蛋白酶酶活性在堆肥初期達到最大值，隨后快速降低，第10 d后趨于平穩(wěn)，整體變化較為平緩。

圖4 木薯渣堆肥過程中蛋白酶活性、N-N-N和N-N的變化Figure 4 Change of protease activity，nitrate nitrogen(N-N-N)andammonia nitrogen(N-N)during cassava dregs composting

2.2.4 纖維素酶活性與纖維素、半纖維素和木質素的相關性分析

由表1可見，木薯渣堆肥處理1的纖維素酶活性變化與纖維素含量為極顯著負相關(r=-0.801)，與半纖維素含量為顯著負相關(r=-0.696)，處理2的纖維素酶活性變化與堆肥中的纖維素含量為顯著負相關(r=-0.612)，說明木薯渣堆肥纖維素酶活性變化與纖維素的降解顯著相關。

表1 纖維素酶活性與纖維素、半纖維素、木質素的相關關系Table 1 Simple correlation between cellulose，hemicelluloses，lignin and the cellulase activity

2.2.6 淀粉酶活性與淀粉含量的相關性分析

木薯渣堆肥處理1的淀粉酶活性變化與淀粉含量為顯著負相關(r=-0.584)，處理2的淀粉酶活性變化與淀粉含量顯著負相關(r=-0.676)，說明木薯渣堆肥淀粉酶活性變化與淀粉的降解顯著相關(表3)。

表2 蛋白酶活性與N-N-N、N-N的相關關系Table 2 Simple correlation between nitrate nitrogen(N-N-N)，ammonia nitrogen(N-N)and the protease activity

表2 蛋白酶活性與N-N-N、N-N的相關關系Table 2 Simple correlation between nitrate nitrogen(N-N-N)，ammonia nitrogen(N-N)and the protease activity

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表3 淀粉酶活性與淀粉含量的相關關系Table 3 Simple correlation between starch and the amylase activity

3 討論

本研究結果表明，木薯渣堆肥的纖維素酶、淀粉酶和蛋白酶活性與堆肥物料特性相關，堆肥前期物料中較豐富的有機組分和適宜的溫度促進了微生物的生長和產酶活力。經微生物的發(fā)酵作用，堆肥物料迅速分解，放熱升溫，第4 d就能迅速升溫至62℃，纖維素酶、淀粉酶和蛋白酶的酶活性也隨之升高，隨著堆肥微生態(tài)改變，適溫微生物富集繁殖，菌群生長代謝旺盛，消耗了大量纖維素、淀粉和蛋白質等有機組分，大量放熱，堆肥維持高溫階段15 d左右，纖維素酶和淀粉酶也隨之維持一段時期的高酶活性狀態(tài)，之后有機組分因大量消耗而匱乏，微生物生長代謝活動趨于平緩，溫度逐漸降至氣溫，在30 d后進入低溫腐熟期，完成堆肥化過程。這與侯憲文等[19]的研究一致。木薯渣堆肥中蛋白酶的酶活性前期變化短促，其原因是木薯渣自身蛋白質含量低，堆料中添加了有機氮源，在堆肥初期促進了產蛋白酶微生物的繁殖，蛋白酶活性快速上升，之后堆肥過程因大量含氮有機組分被消耗，蛋白酶活性也隨之迅速降低。木薯渣堆肥2個處理間進行比較，處理2的發(fā)酵周期比處理1的周期短，并且堆肥纖維素、半纖維素的分解效率，以及N-N-N的生成效率都有所提高，說明接種微生物菌劑堆肥發(fā)酵木薯渣可以達到比較好的效果。

木薯渣堆肥過程中纖維素酶、淀粉酶和蛋白酶的最高活性出現(xiàn)在堆肥的高溫期，酶活變化基本上呈前期小幅緩慢調整，然后迅速上升，逐步緩慢下降，最后達到穩(wěn)定的趨勢，與堆肥過程中微生物生長分解代謝有機物質的特征有關[20-21]。堆肥中的酶活主要與物料中的微生物相關，來源于微生物的新陳代謝過程，木薯渣堆肥中有機物料發(fā)酵是在微生物菌群產生的各種酶的參與下進行的。

本研究中木薯渣堆肥淀粉酶酶活性與淀粉的含量呈顯著負相關，說明木薯渣堆肥中淀粉酶主導了淀粉類物質的降解。

對木質纖維素的降解研究發(fā)現(xiàn)，纖維素酶和半纖維素酶同時破壞木質纖維素的不同結構有利于木質纖維素的酶解[22]。本研究中纖維素酶酶活性與纖維素的含量呈顯著負相關，在木薯渣堆肥纖維素降解中起重要作用，而纖維素酶酶活性與半纖維素含量的關系在處理1中呈顯著負相關，處理2則無顯著相關性。分析其原因可能是處理2接種了外源微生物菌劑，整個堆肥發(fā)酵過程中的纖維素酶活性顯著高于作為對照的處理1，而纖維素酶與半纖維素酶復合酶解木質纖維素是在一定范圍內具有協(xié)同作用，其酶解率隨著復合酶含量的增加而相應增加，一旦超出了范圍，酶解率隨著復合酶含量的持續(xù)增加其增加幅度下降[23]。由于木質素相比纖維素和半纖維素更難于分解，在本研究中木薯渣堆肥的纖維素酶活性與木質素含量之間無顯著相關性。

堆肥氮素礦化是微生物驅動的生物化學過程，本研究中微生物蛋白酶參與堆肥中含氮有機組分的轉化，其酶活性變化與堆肥N-N-N含量呈顯著正相關，但與N-N的含量無顯著相關性。其原因可能是堆肥前期高溫條件，以及強烈的蛋白酶作用和氨化作用將有機氮快速礦化分解，促進了NH3/N-N平衡向生成NH3方向移動，再加上頻繁的人工翻堆通氣散熱，加速了堆體中NH3的流失，且翻堆后堆體會維持一定時間的低溫狀態(tài)，有利于硝化作用的進行，推動N-N向N-N-N的轉化。這些因素都造成了堆肥中N-N含量的下降和N-N-N含量的累積。堆肥中后期含氮有機質因前期的大量消耗而匱乏，微生物蛋白酶活性下降，溫度下降，硝化作用占主導，堆肥中的N-N進一步轉化為NO-2和N-N[19，24-26]。另外，堆肥中后期溫度下降，翻堆頻次降低，堆體通風狀況不暢，形成局部厭氧環(huán)境，反硝化作用促使N-N-N生成N2O和N2，兩方面原因造成了堆肥中后期N-N-N總體累積放緩的趨勢。

由此可見，本研究中堆肥材料和堆肥工藝影響了堆肥生物酶酶活性變化與堆肥有機組分降解。堆肥過程中的多種生物酶活性與C、N等基礎物質的代謝密切相關[13-14，27]，可在一定程度上反映堆肥腐熟度。本研究中堆肥纖維素酶、淀粉酶分別與纖維素、淀粉的發(fā)酵降解呈顯著負相關，說明纖維素酶和淀粉酶參與堆肥碳素循環(huán)，分別主導了木薯渣堆肥中纖維素和淀粉的降解，故生物酶可以表征木薯渣堆肥中有機組分的分解狀況[28-29]。另外，蛋白酶活性與氮素狀況有極其重要的關系[30]，堆肥中蛋白酶與N-N-N的含量呈顯著正相關，說明蛋白酶參與了木薯渣堆肥氮素循環(huán)，表征堆肥N-N-N的積累，而N-N-N含量可以作為堆肥穩(wěn)定性和腐熟度評價的指標。原因是在堆肥過程中，前期的氨化作用占優(yōu)，N-N-N含量較低，進入中后期硝化作用得到強化，部分N-N被轉化為N-N-N而使其含量迅速提高[19，24]并趨于穩(wěn)定，可以認為當堆肥中N-N-N含量趨于穩(wěn)定時即表明堆肥的狀態(tài)已達穩(wěn)定。因此，纖維素酶、淀粉酶和蛋白酶等生物酶的活性變化趨勢可以表征木薯渣堆肥發(fā)酵腐熟的進程，在木薯渣堆肥中可以據此建立關鍵的生物酶活性指標產品品質監(jiān)控節(jié)點，控制木薯渣堆肥的生產和評價堆肥的腐熟度。

4 結論

本研究木薯渣堆肥中纖維素、淀粉和蛋白質等有機組分的降解主要集中在堆肥的高溫期，其中接種微生物菌劑的木薯渣堆肥發(fā)酵處理方式效率較高；木薯渣堆肥過程中的生物酶活性與有機組分的降解呈顯著或極顯著相關關系，其中纖維素酶、淀粉酶和蛋白酶的活性變化趨勢分別指示纖維素、淀粉的降解和N-N-N的生成積累，說明生物酶活性可以共同表征木薯渣堆肥的發(fā)酵腐熟進程，可作為木薯渣堆肥發(fā)酵的生物活性質控指標。

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Relationship between bioenzyme activities and degradation of organic substances during cassava dregs composting process

XU Li-ming,CHENG Chun-yan,LU Han-lang,MO Qi-hui,WEI Xing-ming
(Biology Institute,Guangxi Academy of Sciences,Nanning 530007,China)

With additional microbial inoculants and manual turning in the cassava dregs composting,the starting material will be well transformed through a variety of biological and biochemical processes.In this study,the temperature of different phases of composting was measured,as well as the activities of cellulase,protease,and amylase;further,the concentration of starch,cellulose,hemicelluloses,lignin,nitrate nitrogen(N-N-N)，ammonia nitrogen(N-N)were also analyzed.Then the correlation of all the traits investigated above was analyzed.The results showed that,in comparison to the control,the compost with additional microbial inoculants had a sharper increasing of the temperature,and maintained a longer time of a higher maximum temperature phase during composting,resulting the harmless composting production.The activities of cellulase,protease,and amylase appeared coincidently with the highest temperature period.There were a significantly negative correlation between organic substances content and bioenzyme activities,indicating that the degradation of organic substances could be characterized by bioenzymes.Thus,the activity of biological enzyme could be used as index for cassava dregs decomposition process.

compost;cassava dregs;microbial inoculum;organic substances;enzymatic activity

X712

A

1672-2043(2017)01-0198-07

10.11654/jaes.2016-0908

2016-07-11

許黎明(1979—)，男，助理研究員，碩士，主要從事微生物生物技術方向的研究。E-mail：mufiest@sina.com

廣西自然科學基金項目(2015GXNSFAA139087，2013GXNSFBA019113)；廣西科學院基本科研業(yè)務費資助項目(12YJ25SWS23)

Project supported：The Natural Science Foundation of Guangxi Province,China(2015GXNSFAA139087,2013GXNSFBA019113)；The Basic Scientific Research Foundation of the Guangxi Academy of Sciences,China(12YJ25SWS23)

許黎明，成春燕，盧漢浪，等.木薯渣堆肥的生物酶活性與有機組分降解的關系[J].農業(yè)環(huán)境科學學報,2017,36(1)：198-204.

XU Li-ming,CHENG Chun-yan,LU Han-lang,et al.Relationship between bioenzyme activities and degradation of organic substances during cassava dregs composting process[J].Journal of Agro-Environment Science,2017,36(1)：198-204.