律 澤,胡筱敏,安 婧,魏 煒

(1.東北大學資源與土木工程學院，沈陽 110819；2.中國科學院沈陽應用生態(tài)研究所污染生態(tài)與環(huán)境工程重點實驗室，沈陽110016；3.沈陽建筑大學市政與環(huán)境工程學院，沈陽 110168)

佳樂麝香與鎘復合污染對土壤微生物群落功能和豐度的影響

律 澤1,2,胡筱敏1*,安 婧2,魏 煒3

(1.東北大學資源與土木工程學院，沈陽 110819；2.中國科學院沈陽應用生態(tài)研究所污染生態(tài)與環(huán)境工程重點實驗室，沈陽110016；3.沈陽建筑大學市政與環(huán)境工程學院，沈陽 110168)

為考察佳樂麝香(HHCB)和鎘(Cd)復合污染對土壤微生物群落的影響，采用Biolog和qPCR技術對土壤微生物群落的功能多樣性和豐度進行研究。研究發(fā)現(xiàn)，HHCB及其與Cd復合污染提高了土壤微生物對碳源的利用能力，6大類碳源利用中以對酯類利用效率最高，對糖類和羧酸類利用效率較低。HHCB污染下，Shannon、Simpson和McIntosh指數(shù)沒有顯著性變化，500、1000 mg·kg-1HHCB與Cd復合污染下三種指數(shù)顯著提高。HHCB加入后，土壤微生物的種群豐富度提高，優(yōu)勢種群增加，種群間的均一性被打破。500、1000 mg·kg-1HHCB及其與Cd復合污染顯著促進了細菌生長，HHCB污染顯著抑制了放線菌生長。細菌的豐度隨HHCB濃度的增加而增加，真菌和放線菌的豐度則隨著HHCB濃度的增加而降低，放線菌受HHCB與Cd的影響比細菌和真菌更敏感。

佳樂麝香；鎘；復合污染；土壤微生物群落；功能和豐度

人工合成麝香作為香味添加劑已被廣泛應用于洗滌劑、化妝品和個人護理品中[1]。毒理學實驗研究表明，這類化合物具有潛在的發(fā)育毒性和內分泌干擾效應[2-3]。合成麝香能夠在人體組織積累，然后出現(xiàn)在母乳中，而且容易通過胎盤屏障進入胚胎和胎兒體內[4]。麝香酮可增加對致癌物的敏感性，在動物實驗中發(fā)現(xiàn)麝香會致使睪丸萎縮[5]。多環(huán)麝香化合物對出生24 h的青鳉魚均表現(xiàn)為高毒，96 h半致死濃度佳樂麝香高于吐納麝香和薩利麝香[6]。在有害物質控制方案中，美國EPA將人工合成麝香中典型代表佳樂麝香(HHCB)列為大產(chǎn)量物質予以重點關注[7]。HHCB已成為藥物和個人護理品類污染物(PPCPs)的重要組成部分，環(huán)境工作者越來越多地關注其在環(huán)境中的存在、分布、遷移轉化及潛在的毒性效應[8-9]。

環(huán)境污染多具伴生性和綜合性，用單一污染的作用機理常常無法解釋環(huán)境中普遍存在的復合污染現(xiàn)象，過去依賴單一效應制定的有關評價標準無法真實反映環(huán)境質量要求[10]，關于復合污染的研究已經(jīng)成為當前環(huán)境領域的研究熱點之一[11-13]。土壤是生態(tài)環(huán)境的重要組成部分，也承載著多種環(huán)境污染物。HHCB是多環(huán)麝香中使用量最多的化合物之一，和吐納麝香一起共占多環(huán)麝香使用量的95%[14]。HHCB能夠通過污水灌溉和污泥農(nóng)田施用等多種途徑不斷輸入土壤中，從而提高其對土壤生物的污染暴露水平；并且由于HHCB具有較強的親脂性，其在土壤中可以長期存在[15]。鎘(Cd)是重金屬污染土壤中一種常見的污染元素，主要來源為污水灌溉、污泥利用、金屬采礦和冶煉等[16]，動植物的生長發(fā)育也受到Cd污染的影響，其在動植物體內有很強的積累性，還可以通過食物鏈危害人體健康[17]。多環(huán)麝香與重金屬Cd均來源于污水灌溉和污泥利用，二者共存于土壤環(huán)境中[18]，易對土壤環(huán)境造成復合污染。有研究表明，HHCB通過擾亂細胞防御系統(tǒng)來提高其他毒物的毒性效應，且HHCB和Cd復合污染可以增強單一污染對動物和植物的毒性[18-19]，因而已成為一種新型復合污染物并且在環(huán)境中具有潛在危害。

土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)中非常重要的一部分，在有機質分解、養(yǎng)分循環(huán)和植物養(yǎng)分利用過程中起著重要作用[20]。土壤生態(tài)學中把土壤微生物群落結構和功能的研究作為熱點研究。土壤中微生物群落代謝功能的不同可以通過土壤微生物對Biolog微平板中各類碳源的利用情況的差異來反應[21]。特定類群微生物的數(shù)量能被定量PCR(qPCR)準確定量，高于1～ 10個拷貝的質粒DNA以及100 cfu·mL-1的微生物量均可以被檢測到[22]，qPCR被廣泛用于檢測環(huán)境樣品是因為其具有靈敏度高、精確性好、特異性強和安全快速等優(yōu)點。為了探討HHCB和Cd復合污染對土壤微生物群落功能和豐度的影響，采用Biolog和qPCR相結合的方法，建立復合污染生態(tài)毒理診斷指標，提供基礎數(shù)據(jù)及理論基礎用于風險評價和修復基準。

1 材料與方法

1.1 供試土壤

采集地點：遼寧省沈陽市石佛寺灌渠渠首(42° 08.606′N，123°20.712′E)，農(nóng)田土壤表層(0～20 cm)樣品，過2 mm篩備用。土壤理化性質見表1。

1.2 供試藥品

HHCB購于SIGMA-ALORICH公司，純度為50%[液體試劑，稀釋劑為鄰苯二甲酸二乙酯(DEP)]，其分子式均為C18H26O，于實驗室用丙酮配制為20 g· L-1HHCB溶液。

1.3 試驗方法

1.3.1 土壤培養(yǎng)

本試驗采用微宇宙試驗。土壤預培養(yǎng)：用500 mL的塑料燒杯稱取土壤200 g(相當于烘干土)，調節(jié)含水量至田間最大持水量的60%左右，為防止水分過量蒸發(fā)和空氣中的菌體進入，采用具有透氣作用的薄膜封口，25℃恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)7 d。土壤染毒：設置HHCB實驗濃度為0、100、500、1000 mg·kg-1，分別抽取0、1、5、10 mL配制好的20 g·L-1HHCB溶液加到200 g土壤中并混合均勻，待丙酮揮發(fā)干凈后，加入1 g·L-1的CdCl2溶液，使最終濃度為0、10 mg·kg-1，且2種污染物均勻分布在土壤中。實驗組合方案如表2，共8個處理，每個處理重復3次。調節(jié)土壤含水量為田間最大含水量的60%，每2～3 d調一次水量，25℃恒溫恒水量避光培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10周。選取第2周土壤樣品用于土壤微生物群落功能多樣性試驗，第10周土壤樣品用于測定微生物群落豐度試驗。

表1 土壤理化性質Table 1 The soil physical and chemical properties

表2 實驗組合方案設計Table 2 Experimental design combination

1.3.2 土壤微生物群落功能多樣性

分析采用Biolog微生物自動分析系統(tǒng)(Biolog，Hayward，CA，USA)。配制45 mL 0.145 mol·L-1的無菌生理鹽水，加入5 g新鮮土樣，180 r·min-1振蕩30 min，然后在超凈臺上用無菌生理鹽水稀釋1000倍，分別添加150 μL稀釋后的懸液于Biolog板孔中，3個土壤重復，28℃恒溫培養(yǎng)，在第24、48、72、96、120、144、168、192、216、240 h測定各孔在590 nm波長下的光吸收值。

1.3.3 土壤微生物數(shù)量-qPCR技術

樣品DNA的提取采用Fast DNA-SPIN KitFor Soil(MP Biomedicals，Santa Ana，CA)試劑盒，從0.5 g土壤中提取土壤基因組DNA，溶于50 μL水中，置于-20℃保存。

采用熒光qPCR測定細菌16S rRNA、真菌18S rRNA和放線菌特異基因的拷貝數(shù)。細菌擴增引物為341F/758R(341F：CCTACGGGAGGCAGCAG，758R：CTACCAGGGTATCTAATCC)[23]，418 bp，退火溫度為55℃；真菌擴增引物為 FR1/FF390(FF390：CGATAACGAACGAGACCT，F(xiàn)R1：AICCATTCAATCGGTAIT)[24]，390 bp，退火溫度為50℃；放線菌擴增引物為243F/513R(243F：5′GGATGAGCCCGCGGCCTA 3′，513R：5′CGGCCGCGGCTGCTGGCACGTA 3′)[25]，271 bp，退火溫度為56℃。2×SYBR Premix Ex TaqⅡ(TaKaRa)12.5 μL；前引物和后引物(10 pmol·μL)各為1 μL；50×ROX Reference Dye(TaKaRa)0.5 μL；DNA模板1 μL；水9 μL；反應體系25 μL。

制作標準曲線，樣品中的基因拷貝數(shù)要據(jù)所得標準曲線計算，然后換算成每克干土的基因拷貝數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

式中：Ai為第i孔在590 nm處的吸光度值；A0為對照孔在590 nm處的吸光度值。

三種指數(shù)的計算公式分別為：

式中：Pi為第i孔的相對吸光值與整個平板相對吸光值總和的比率；ni為第i孔的相對吸光值。

菌種的拷貝數(shù)經(jīng)對數(shù)轉換后再進行分析和作圖，選取Biolog Eco微平板培養(yǎng)72 h的數(shù)據(jù)進行指數(shù)和碳源分析。采用SPSS 20.0進行實驗數(shù)據(jù)處理，結果以平均值±標準差表示，利用單因素方差分析中的LSD多重比較檢驗不同處理間的結果差異顯著性，處理間差異顯著性用不同小寫字母表示，顯著性水平設為0.05。實驗作圖采用軟件Origin 8.0。

2 結果與討論

2.1 HHCB與Cd污染對土壤微生物總體活性的影響

平均顏色變化率(AWCD)是反映土壤微生物代謝活性的重要指標，微生物對碳源的利用率高低可以通過AWCD值的高低來表征。AWCD值越大，表明細菌密度越大、活性越高，反之則細菌密度越小、活性越低[26]。在培養(yǎng)第2周，HHCB單一污染條件下(圖1A)，AWCD值隨濃度變化趨勢是HHCB1000>HHCB500> HHCB100>CK。HHCB和Cd復合污染條件下(圖1B)：96 h之前 HHCB1000+Cd10>HHCB500+Cd10> HHCB100+Cd10>Cd10；96～168h之間HHCB500+Cd10> HHCB1000+Cd10>HHCB100+Cd10>Cd10；168h之后HHCB500+Cd10>HHCB100+Cd10>HHCB1000+Cd10> Cd10。HHCB單一和HHCB與Cd復合污染土壤微生物群落的AWCD值均高于對照組CK，表明加入HHCB提高了土壤微生物對碳源的利用能力。AWCD值均隨著培養(yǎng)時間的延長而增加，表明微生物利用碳源的總量隨時間的延長呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢，其代謝能力增強。

2.2 HHCB與Cd污染對土壤微生物功能多樣性指數(shù)的影響

2.2.1 對Shannon豐富度指數(shù)的影響

Shannon指數(shù)是研究群落物種及其個體數(shù)和分布均勻程度的綜合指標[27]。用于Biolog Eco微平板時，Shannon指數(shù)越高說明可供土壤微生物利用的碳源種類就越多，物種豐富度就越高。HHCB單一污染條件下(圖2A)，與對照組CK相比差異都不顯著(P> 0.05)。HHCB和Cd復合污染條件下(圖2B)，HHCB100+ Cd10、HHCB500+Cd10和HHCB1000+Cd10分別顯著高于對照組 Cd10 10.51%、24.37%和 17.35%(P< 0.05)，表明HHCB的加入提高了復合污染土壤微生物代謝功能，增加了種群的豐富度。這可能是由于某些快速生長的菌種，能利用提供的單一碳源，加快其自身的生長、繁殖。

2.2.2 對Simpson優(yōu)勢度指數(shù)的影響

Simpson優(yōu)勢度指數(shù)反映了各物種種群數(shù)量的變化情況，指數(shù)越大，說明群落內物種數(shù)量分布越不均勻，優(yōu)勢種的地位越突出[28]。HHCB單一污染條件下(圖3A)，與對照組CK相比差異都不顯著(P>0.05)。HHCB和Cd復合污染條件下(圖3B)，與對照組Cd10相比，HHCB100+Cd10差異不顯著(P>0.05)，而HHCB500+Cd10和HHCB1000+Cd10則分別顯著高于對照組Cd10 96.60%和67.23%(P<0.05)，表明500 mg·kg-1和1000 mg·kg-1的HHCB加入顯著增加了復合污染土壤中優(yōu)勢種群，群落內物種數(shù)量分布不均勻。這可能是由于某些菌種能夠充分利用單一碳源快速生長而成為表征菌種，并且可能發(fā)展成為土壤的優(yōu)勢種群。

2.2.3 對McIntosh均一性指數(shù)的影響

圖1 HHCB與Cd單一、復合污染下土壤微生物AWCD變化情況Figure 1 The AWCD variation of soil microbial under the single and joint stress of HHCB and Cd

圖2 HHCB與Cd單一、復合污染對Shannon指數(shù)的影響Figure 2 Effect of the single and joint stress of HHCB and Cd on Shannon index

McIntosh多樣性指數(shù)是群落物種均一性的度量，是依據(jù)土壤微生物群落物種多維空間上Euclidian距離的多樣性指數(shù)。HHCB單一污染條件下(圖4A)，與對照組CK相比差異都不顯著(P>0.05)。HHCB和Cd復合污染條件下(圖4B)，與對照組Cd10相比，HHCB100+Cd10差異不顯著(P>0.05)；HHCB500+ Cd10和HHCB1000+Cd10分別顯著高于對照組Cd10 120.59%和160.75%(P<0.05)。500、1000 mg·kg-1的HHCB加入使McIntosh指數(shù)升高，表明種群間的均一性被打破。

HHCB單一污染條件下，與對照組CK相比，不同濃度的三種指數(shù)沒有顯著性變化；HHCB和Cd復合污染條件下，與對照組Cd10相比，500、1000 mg· kg-1HHCB與Cd復合下的三種指數(shù)顯著提高。

2.3 HHCB與Cd污染條件下土壤微生物對不同類型碳源利用強度的影響

Biolog Eco微平板上含有31種碳源，要據(jù)碳源官能團不同將其分為6類，主要包括：單糖、糖苷、聚合糖類，氨基酸類，酯類，醇類，胺類和羧酸類。HHCB單一污染條件下(圖5A)，與對照組CK相比，只有HHCB500和HHCB1000處理的糖類和羧酸類利用顯著提高(P<0.05)，其余處理的碳源利用差異都不顯著(P>0.05)。HHCB和Cd復合污染條件下(圖5B)，與對照組Cd10相比，HHCB500+Cd10和HHCB1000+Cd10處理下酯類、醇類和羧酸類利用顯著提高，HHCB1000+Cd10處理下胺類的利用顯著提高，其余處理的碳源利用差異均不顯著。500、1000 mg·kg-1的HHCB與Cd復合污染提高了某些碳源的利用率?？傮w上，土壤微生物對6大類碳源的利用強度有所差異，其中對酯類的利用效率最高，對糖類和羧酸類碳源的利用強度較低。

2.4 HHCB與Cd污染條件下對土壤微生物豐度的影響

qPCR技術是一種核酸定量分析方法。相對定量是指不僅能測定目的基因，而且還能測定某一內參基因，基因拷貝數(shù)的比較主要通過該內參基因表達[29]。HHCB單一污染條件下(圖6A)，與對照組CK相比，HHCB100處理細菌的豐度差異不顯著(P>0.05)；HHCB500和HHCB1000處理分別顯著高于對照組CK 1.79%和1.94%(P<0.05)。HHCB和Cd復合污染條件下(圖6B)，與對照組Cd10相比，HHCB100+ Cd10處理下細菌的豐度差異不顯著；HHCB500+ Cd10和HHCB1000+Cd10處理分別顯著高于對照組Cd10 2.14%和2.45%；HHCB單一及其與Cd復合處理，細菌的豐度隨著HHCB濃度的增加而增加。可見某些細菌可能利用HHCB作為碳源，促進其自身快速的生長、繁殖。

圖3 HHCB與Cd單一、復合污染對Simpson指數(shù)的影響Figure 3 Effect of the single and joint stress of HHCB and Cd on Simpson index

圖4 HHCB與Cd單一、復合污染對McIntosh指數(shù)的影響Figure 4 Effect of the single and joint stress of HHCB and Cd on McIntosh index

圖5 HHCB與Cd單一、復合污染對土壤微生物碳源利用強度的影響Figure 5 Utilization of carbon substrates by soil microbial community under the single and joint stress of HHCB and Cd

HHCB單一污染條件下(圖7A)，與對照組CK相比，不同濃度的HHCB處理真菌的豐度差異不顯著(P> 0.05)；HHCB和Cd復合污染條件下(圖7B)，HHCB1000+ Cd10處理下真菌的豐度顯著低于對照組Cd10 4.91% (P<0.05)。與對照組CK相比，不同濃度的HHCB與Cd復合處理真菌的豐度均沒有顯著差異(P>0.05)。HHCB的單一及其與Cd復合處理的真菌與對照組CK相比均未受到顯著影響，真菌的豐度隨著HHCB濃度的增加而降低。

圖6 HHCB與Cd單一、復合污染對細菌豐度的影響Figure 6 Effect of the single and joint stress of HHCB and Cd on the bacteria abundance

圖7 HHCB與Cd單一、復合污染對真菌豐度的影響Figure 7 Effect of the single and joint stress of HHCB and Cd on the fungi abundance

HHCB單一污染條件下(圖8A)，HHCB100、HHCB500和HHCB1000處理放線菌的豐度顯著低于對照組CK 0.86%、6.31%和6.90%(P<0.05)，可見HHCB顯著抑制了放線菌生長。HHCB和Cd復合污染條件下(圖8B)，HHCB100+Cd10和HHCB500+Cd10處理放線菌的豐度分別顯著高于對照組Cd10 7.21%和2.89%；HHCB1000+Cd10處理顯著低于對照組Cd10 5.72%；HHCB500+Cd10和HHCB1000+Cd10處理顯著低于對照組CK 4.49%和12.48%。HHCB的單一及其與Cd復合處理，與對照組CK相比，不同濃度處理的放線菌均受到抑制(HHCB100+Cd10除外)，其豐度隨著HHCB濃度的增加而降低，放線菌對HHCB和Cd的抑制作用比細菌和真菌更為敏感。本課題組用平板菌落計數(shù)的方法研究HHCB和Cd單一、復合污染對細菌、真菌和放線菌的影響中也有類似的結果，放線菌受到顯著抑制作用[30-31]。

3 討論

圖8 HHCB與Cd單一、復合污染對放線菌豐度的影響Figure 8 Effect of the single and joint stress of HHCB and Cd on the actinomycetes abundance

本研究中HHCB單一及其與Cd復合污染對土壤微生物功能和豐度的影響明顯不同，其原因可能是：(1)作用污染物不同，在單因子污染脅迫下，其本身的理化性質基本決定了污染物對生物的毒害效應，受暴露濃度水平的影響也極為重要，在多元復合污染條件下，污染物理化性質的作用除外，起至關重要的作用是污染物的濃度組合[32]；(2)復合污染的聯(lián)合毒性機理與單一污染致毒機理明顯不同，有機物與重金屬的聯(lián)合毒性效應產(chǎn)生機理研究包括競爭結合位點、螯合或絡合作用及沉淀作用、影響酶的活性、影響生物細胞結構、干擾生物生理活動和功能、干擾生物大分子的結構和功能等幾方面[33]。

Biolog試驗結果表明，HHCB單一及其與Cd復合污染土壤微生物群落的AWCD值均高于對照組CK，表明加入HHCB提高了土壤微生物對碳源的利用能力。一些有機污染物能夠提高微生物的代謝活性，提高對碳源的利用能力。如張雯雯等[34]和吳小虎[35]研究表明，芐嘧磺隆施用初期及使用高濃度氟磺胺草醚處理粉砂質壤土和黑土時，處理組的AWCD值高于對照組，都提高了微生物的碳源利用能力。

HHCB和Cd復合污染條件下，與對照組Cd10相比，500、1000 mg·kg-1HHCB與Cd復合的三種指數(shù)顯著提高。表明加入HHCB后，復合污染土壤的種群豐富度顯著提高，復合污染土壤中優(yōu)勢種群得到顯著增加，種群間的均一性被打破。可能由于HHCB的加入提高了復合污染土壤微生物代謝功能多樣性和碳源利用種類數(shù)，某些快速增長的菌種，能利用提供的單一碳源，促進其自身快速的生長、繁殖，充分利用單一碳源快速生長的表征菌種，可能發(fā)展成為土壤的優(yōu)勢種群，破壞種群的均一性。另外一種可能性推測是土壤中可能存在降解HHCB的微生物，HHCB的生物降解作用已經(jīng)得到不少研究的支持和證實[36-38]，HHCB的存在會促進這些微生物的活性，從而導致其利用某些碳源的能力增加，三種指數(shù)也相應得到提高。

細菌、真菌和放線菌在HHCB和Cd復合污染中受到不同程度的影響，可能是由于三種菌在細胞結構和生理功能方面都存在較大差異，且不同污染物對土壤中的微生物毒害效應不一致而導致。500、1000 mg· kg-1HHCB單一及其與Cd復合污染顯著促進了細菌的生長，可能是由于HHCB污染土壤中產(chǎn)生HHCB降解菌，在高濃度組合和暴露條件下的復合污染生態(tài)毒理效應，可導致特異微生物物種(如耐受和降解菌)的大量繁殖富集或微生物為了“抵御”污染毒性作用而產(chǎn)生的基因突變[10]，多環(huán)麝香對細菌的基因毒害作用不明顯，但具有一定的誘導性[39]。因此，HHCB污染土壤中細菌數(shù)量得到提高。

與對照組CK比，不同濃度處理的放線菌均受到了抑制作用(HHCB100+Cd10除外)，其豐度隨著HHCB濃度的增加而降低。土壤放線菌對多種有機和重金屬污染物脅迫的反應敏感。沈國清等[40]和張慧等[41]的研究表明，多環(huán)芳烴與Cd的復合污染對放線菌生長的抑制率達40%左右；Luckenbach等[42]發(fā)現(xiàn)HHCB能夠抑制加利福尼亞貽貝對有毒物質的自然抵抗力，減少異生質轉運體的活性，使有害物質更容易累積于生物體。因此，HHCB存在有可能降低放線菌體內某種轉運體的活性，從而使有害物質累積量增多，抑制放線菌生長。

HHCB和Cd復合污染條件下，HHCB100+Cd10和HHCB500+Cd10處理下放線菌的豐度分別顯著高于對照組Cd10 7.21%和2.89%，其原因可能是：(1)細胞器結構功能的改變會影響復合污染物對生物體的毒性[33]。Moreau等[43]認為菲對Zn在生物體內蓄積的拮抗作用可能是因為菲改變了溶酶體膜的穩(wěn)定性及功能，從而影響了溶酶體解除Zn毒害的作用。Sikkema等[44]提出了毒作用麻醉假設，認為PAHs等脂溶性化合物可以同細胞膜上的脂溶性分子結合，從而影響細胞膜的結構和穿透性。HHCB同樣是脂溶性化合物，它也可能改變放線菌細胞膜的通透性，使Cd更不容易進入微生物細胞，降低Cd對微生物的毒性。(2)有機絡合劑與被絡合物可形成生物體幾乎不能吸收、蓄積的絡合物形式，這一點是減毒的重要機制[45]。HHCB生物降解過程中可能會出現(xiàn)有機酸，而有機酸又是一種很好的絡合劑，它能夠與具有配位能力的重金屬Cd產(chǎn)生絡合作用，形成較大絡合物，阻止其通過生物膜，從而拮抗Cd對生物的毒性。另外，Cd以二價離子態(tài)存在于土壤溶液中，易被靜電吸附，降低土壤表面負電荷，促進土壤對HHCB的吸附固定。這些作用都可能減弱Cd與HHCB的生物有效性。(3)與DNA生成化學加合物(或加成物)常被視作致毒的重要機理[46]。Donnelly等[47]發(fā)現(xiàn)，隨著三硝基甲苯加入量的增大，苯并芘的毒性逐漸降低，其原因在于前者干擾了后者與DNA的結合。本研究中HHCB100+Cd10和HHCB500+Cd10處理下放線菌豐度高于Cd單一污染的機理有待進一步研究。

4 結論

HHCB單一污染及其與Cd復合污染提高了土壤微生物對碳源的利用能力，對6大類碳源的利用強度有所差異，其中對酯類的利用效率最高，對糖類和羧酸類碳源的利用強度較低。

HHCB單一污染條件下，Shannon、Simpson和McIntosh指數(shù)沒有顯著性變化；HHCB和Cd復合污染下，500、1000 mg·kg-1HHCB與Cd復合污染的三種指數(shù)顯著提高，HHCB加入后，土壤微生物可以快速消耗單一的碳源，復合污染土壤的種群豐富度顯著提高，優(yōu)勢種群增加，種群間的均一性被打破。

500、1000 mg·kg-1HHCB的單一污染及其與Cd復合污染顯著促進了細菌的生長，HHCB單一污染及其與Cd復合污染與對照組CK相比真菌生長均未受到顯著影響，HHCB單一污染顯著抑制了放線菌生長。細菌的豐度隨著HHCB濃度的增加而增加，而真菌和放線菌的豐度隨著HHCB濃度的增加而降低。放線菌受到HHCB和Cd的影響時表現(xiàn)得比細菌和真菌更為敏感。

[1]Wang M,Peng C,Chen W,et al.Ecological risks of polycyclic musk in soils irrigated with reclaimed municipal wastewater[J].Ecotoxicology and Environmental Safety,2013,97：242-247.

[2]Api A M,Smith R L,Pipino S,et al.Evaluation of the oral subchronic toxicity of AHTN(7-Acetyl-1,1,3,4,4,6-hexamethyl-1,2,3,4-tetrahydronaphthalene)in the rat[J].Food and Chemical Toxicology,2004, 42(5)：791-801.

[3]Van der Burg B,Schreurs R,van der Linden S,et al.Endocrine effects of polycyclic musks：Do we smell a rat?[J].International Journal of Andrology,2008,31(2)：88-193.

[4]Lee S,Kim S,Park J,et al.Synthetic musk compounds and benzotriazole ultraviolet stabilizers in breast milk：Occurrence,time-course variation and infant health risk[J].Environmental Research,2015,140：466-473.

[5]Melmed S.Fertility and fragrance：Another cause of Kallmann syndrome [J].Journal of Clinical Investigation,2015,125(6)：2275-2278.

[6]Yamauchi R,Ishibashi H,Hirano M,et al.Effects of synthetic polycyclic musks on estrogen receptor,vitellogenin,pregnane X receptor,and cytochrome P450 3A gene expression in the livers of male medaka(Oryzias latipes)[J].Aquatic Toxicology,2008,90(4)：261-268.

[7]USEPA.High Production Volume List.Prevention,pesticides and toxic substances,pollution prevention and toxics[R].Washington,DC,2008.

[8]Schiavone A,Kannan K,Horii Y,et al.Polybrominated diphenyl ethers, polychlorinated naphthalenes and polycyclic musks in human fat from Italy：Comparison to polychlorinated biphenyls and organochlorine pesticides[J].Environmental Pollution,2010,158(2)：599-606.

[9]Sumner N R,Guitart C,Fuentes G,et al.Inputs and distributions of synthetic musk fragrances in an estuarine and coastal environment,a case study[J].Environmental Pollution,2010,158(1)：215-222.

[10]周啟星,孔繁翔,朱 琳.生態(tài)毒理學[M].北京：科學出版社,2004.

ZHOU Qi-xing,KONG Fan-xiang,ZHU Lin.Ecological toxicology[M]. Beijing：Science Press,2004.

[11]Chen C H,Zhou Q X,Cai Z.Effect of soil HHCB on cadmium accumulation and phytotoxicity in wheat seedlings[J].Ecotoxicology,2014,23 (10)：1996-2004.

[12]Hu S,Gu H,Cui C,et al.Toxicity of combined chromium(Ⅵ)and phenanthrene pollution on the seed germination,stem lengths,and fresh weights of higher plants[J].Environmental Science and Pollution Research,2016,23(15)：15227-15235.

[13]Wang D H,Zhang Q,Zheng Y,et al.Estimating the combined toxicity of flufenacet and imazaquin to sorghum with pore water herbicide concentration[J].Journal of Environmental Sciences,2016,41：154-161.

[14]徐慧琳,曾文爐,陳翠紅,等.鎘污染土壤中吐納麝香的生物有效性及其評價[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學學報,2016,35(6)：1021-1027.

XU Hui-lin,ZENG Wen-lu,CHEN Cui-hong,et al.Bioavailability of AHTN in cadmium-polluted soil and its assessment[J].Journal of A-gro-Environment Science,2016,35(6)：1021-1027.

[15]Litz N T,Müller J,B?hmer W.Occurrence of polycyclic musks in sewage sludge and their behaviour in soils and plants.Part 2：Investigation of polycyclic musks in soils and plants[J].Journal of Soils and Sediments,2007,7(1)：36-44.

[16]樊 霆,葉文玲,陳海燕,等.農(nóng)田土壤重金屬污染狀況及修復技術研究[J].生態(tài)環(huán)境學報,2013,22(10)：1727-1736.

FAN Ting,YE Wen-ling,CHEN Hai-yan,et al.Review on contamination and remediation technology of heavy metal in agricultural soil[J]. Ecology and Environmental Sciences,2013,22(10)：1727-1736.

[17]Smeets K,Opdenakker K,Remans T,et al.Oxidative stress-related responses at transcriptional and enzymatic levels after exposure to Cd or Cu in a multipollution context[J].Journal of Plant Physiology,2009, 166(18)：1982-1992

[18]陳翠紅,周啟星,張志能,等.土壤中佳樂麝香和鎘污染對苗期小麥生長及其污染物積累的影響[J].環(huán)境科學,2011,32(2)：567-573.

CHEN Cui-hong,ZHOU Qi-xing,ZHANG Zhi-neng,et al.Effects of soil HHCB and Cd contamination on the growth of wheat seedlings (Triticum aestivum)and the pollutants accumulation in plants[J].Environmental Science,2011,32(2)：567-573.

[19]陳 芳,周啟星.模擬城市徑流中加樂麝香和鎘對大型水蚤的毒性效應[J].中國環(huán)境科學,2009,29(1)：58-62.

CHEN Fang,ZHOU Qi-xing.Toxic efects of galaxolide and cadmium on Daphnia magna under polluting flow conditions containing soilwater interfaces from urban area[J].China Environmental Science, 2009,29(1)：58-62.

[20]Kirk J L,Beaudette L A,Hart M,et al.Methods of studying soil microbial diversity[J].Journal of Microbiological Methods,2004,58(2)：169-188.

[21]馬 驛,陳杖榴,曾振靈.恩諾沙星對土壤微生物群落功能多樣性的影響[J].生態(tài)學報,2007,27(8)：3400-3406.

MA Yi,CHEN Zhang-liu,ZENG Zhen-ling.Effects of enrofloxacin on functionaldiversityofsoilmicrobialcommunities[J].ActaEcologicaSinica,2007,27(8)：3400-3406.

[22]姚紅艷,趙雙宜,夏光敏.改良尿素-氯化鋰方法提取成熟小麥種子總RNA[J].中國生物工程雜志,2003,23(4)：86-88.

YAO Hong-yan,ZHAO Shuang-yi,XIA Guang-min.Improved urea-LiCl method for extracting total RNA from wheat mature seeds[J].ChinaBiotechnology,2003,23(4)：86-88.

[23]Lee S,Malone C,Kemp P.Use of multiple 16S ribosomal-RNA-targeted fluorescent-probes to increase signal strength and measure cellular RNA from natural planktonic bacteria[J].1993,101(1/2)：193-201.

[24]Vainio E J,Hantula J.Direct analysis of wood-inhabiting fungi using denaturing gradient gel electrophoresis of amplified ribosomal DNA[J]. Mycological Research,2000,104(8)：927-936.

[25]袁海平.鎘污染對放線菌生物活性和種群結構的影響及鎘生物吸附研究[D].杭州：浙江大學,2009：57-58.

YUAN Hai-ping.Studies on variation of microbial activity and actinomycete population under cadmium stress as well as cadmium bioadsorption[D].Hangzhou：Zhejiang University,2009：57-58.

[26]Haack S K,Garchow H,Klug M J,et al.Analysis of factors affecting the accuracy,reproducibility,and interpretation of microbial community carbon source utilization patterns[J].Applied and Environmental Microbiology,1995,61(4)：1458-1468.

[27]葉央芳.酰胺類除草劑苯噻草胺的微生物生態(tài)毒理研究及其降解[D].杭州：浙江大學,2004：57.

YE Yang-fang.Studies on microbial ecological and toxicological characteristics of acetanilide herbicide mefenacet and its degradation[D]. Hangzhou：Zhejiang University,2004：57.

[28]孟慶杰,許艷麗,李春杰,等.不同植被覆蓋對黑土微生物功能多樣性的影響[J].生態(tài)學雜志,2008,27(7)：1134-1140.

MENG Qing-jie,XU Yan-li,LI Chun-jie,et al.Effects of different vegetation coverage on microbial functional diversity in black soil[J]. Chinese Journal of Ecology,2008,27(7)：1134-1140.

[29]李 安,謝金文,魏加貴,等.熒光定量PCR技術在分子檢測上的研究進展[J].中國畜牧獸醫(yī),2009,36(4)：73-76.

LI An,XIE Jin-wen,WEI Jia-gui,et al.The research progress of fluorescence quantitative PCR technique on the molecular detection[J]. ChinaAnimal Husbandry&Veterinary Medicine,2009,36(4)：73-76.

[30]律 澤,胡筱敏,安 婧,等.佳樂麝香和鎘復合污染對土壤中放線菌數(shù)量的影響[J].生態(tài)學雜志,2014,33(6)：1501-1507.

Lü Ze,HU Xiao-min,AN Jing,et al.Joint effects of galaxolide and cadmium on actinomycetes quantities in soils[J].Chinese Journal of E-cology,2014,33(6)：1501-1507.

[31]律 澤,胡筱敏,魏 煒,等.佳樂麝香和鎘復合污染對土壤中細菌和真菌數(shù)量的影響[J].生態(tài)學雜志,2014,33(8)：2161-2167.

Lü Ze,HU Xiao-min,WEI Wei,et al.Joint effects of galaxolide and cadmium on bacteria and fungi quantities in soil[J].Chinese Journal of Ecology,2014,33(8)：2161-2167.

[32]周啟星,程 云,張倩茹,等.復合污染生態(tài)毒理效應的定量關系分析[J].中國科學(C輯：生命科學),2003,33(6)：566-573.

ZHOU Qi-xing,CHENG Yun,ZHANG Qian-ru,et al.The analysis of the quantitative relationship on compound pollution ecological toxicology effect[J].Science in China(Series C：Life Sciences),2003,33(6)：566-573.

[33]范 飛.土壤環(huán)境中人工合成麝香的生態(tài)行為及效應研究[D]：沈陽：中科院沈陽應用生態(tài)研究所,2008：21-24.

FAN Fei.Ecotoxical behavior and effects of synthetical musks in Burozem[D]：Shenyang：Institute of Applied Ecology,Chinese Academy of Sciences,2008：21-24.

[34]張雯雯,徐 軍,董豐收,等.芐嘧磺隆對水稻田土壤微生物群落功能多樣性的影響[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學學報,2014,33(9)：1749-1754.

ZHANG Wen-wen,XU Jun,DONG Feng-shou,et al.Responses of microbial community functional diversity to bensulfuron-methyl in paddy soil[J].Journal of Agro-Environment Science,2014,33(9)：1749-1754.

[35]吳小虎.氟磺胺草醚對土壤微生物多樣性的影響[D].北京：中國農(nóng)業(yè)科學院,2014：53-55.

WU Xiao-hu.Effects of fomesafen on the soil microbial diversity[D]. Beijing：Institute of Plant Protection,Chinese Academy of Agricultural Sciences,2014：53-55.

[36]Kuhlich P,Gostl R,Teichert P,et al.Transformations of polycyclic musks AHTN and HHCB upon disinfection with hypochlorite：Two new chlorinated disinfection by-products(CDBP)of AHTN and a possible source for HHCB-lactone[J].Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2011,399(10)：3579-3588.

[37]Bester K.Retention characteristics and balance assessment for two polycyclic musk fragrances(HHCB and AHTN)in a typical German sewage treatment plant[J].Chemosphere,2004,57(8)：863-870.

[38]張 珣,陳寶楠,孫麗娜.植物-微生物聯(lián)合修復佳樂麝香與鎘復合污染土壤的研究[J].沈陽農(nóng)業(yè)大學學報,2016,47(2)：166-172.

ZHANG Xun,SUN Bao-nan,SUN Li-na.Remediation of galaxolide and cadmium compound contaminated soil with plant-microbial combination[J].Journal of Shenyang Agricultural University,2016,47(2)：166-172.

[39]周啟星,王美娥,范 飛,等.人工合成麝香的環(huán)境污染、生態(tài)行為與毒理效應研究進展[J].環(huán)境科學學報,2008,28(1)：1-11.

ZHOU Qi-xing,WANG Mei-e,FAN Fei,et al.Research progress in environmental pollution,ecological behavior and toxicological effects of synthetic musks[J].ActaScientiae Circumstantiae,2008,28(1)：1-11.

[40]沈國清,陸貽通,洪靜波.重金屬和多環(huán)芳烴復合污染對土壤酶活性的影響及定量表征[J].應用與環(huán)境生物學報,2005,11(4)：479-482.

SHEN Guo-qing,LU Yi-tong,HONG Jing-bo.Quantitative expression and effect of combined pollution of heavy metals and polycyclic acromatic[J].Chinese Journal of Applied and Environmental Biology,2005, 11(4)：479-482.

[41]張 慧,黨 志,姚麗賢,等.鎘芘單一污染和復合污染對土壤微生物生態(tài)效應的影響[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學學報,2007,26(6)：2225-2230.

ZHANG Hui,DANG Zhi,YAO Li-xian,et al.Eco-toxicological effect of cadmium and pyrene combined and simplex pollution on soil microbe[J].Journal of Agro-Environment Science,2007,26(6)：2225-2230.

[42]Luckenbach T,Epel D.Nitromusk and polycyclic musk compounds as long-term inhibitors of cellular xenobiotic defense systems mediated by multidrug transporters[J].Environmental Health Perspectives,2004, 113(1)：17-24.

[43]Moreau C J,Klerks P L,Haas C N.Interaction between phenanthrene and zinc in their toxicity to the sheepshead minnow(Cyprinodon variegatus)[J].Arch Environ Contam Toxicol,1999,37(2)：251-257.

[44]Sikkema J,De Bont J,Poolman B.Interactions of cyclic hydrocarbons with biological membranes[J].Journal of Biological Chemistry,1994, 269(11)：8022-8028.

[45]鄭振華,周培疆,吳振斌.復合污染研究的新進展[J].應用生態(tài)學報,2001,12(3)：469-473.

ZHENG Zhen-hua,ZHOU Pei-jiang,WU Zhen-bin.New advances in research of combined pollution.[J].Chinese Journal of Applied Ecology, 2001,12(3)：469-473.

[46]龍耀庭.有毒化學物質對DNA的損傷：生成DNA加成物[J].環(huán)境科學進展,1993,1(4)：24-40.

LONG Yao-ting.The damage of DNA by toxic chemical：Formation of DNA adduct[J].Advances in Environmental Science,1993,1(4)：24-40.

[47]Donnelly K C,Claxton L D,Huebner H J,et al.Mutagenic interactions of model chemical mixtures[J].Chemosphere,1998,37(7)：1253-1261.

Joint effects of galaxolide and cadmium on soil microbial community function and abundance

Lü Ze1,2,HU Xiao-min1*,AN Jing2,WEI Wei3
(1.School of Resources and Civil Engineering,Northeastern University,Shenyang 110819,China;2.Key Laboratory of Pollution Ecology and Environmental Engineering,Institute of Applied Ecology,Chinese Academy of Sciences,Shenyang 110016,China;3.School of Municipal and Environmental Engineering,Shenyang Jianzhu University,Shenyang 110168,China)

In order to investigate the joint effects of galaxolide and cadmium on soil microbial community,soil microbial community function and abundance were studied by Biolog and qPCR methods in this paper.Results showed that the ability of utilizing carbon sources in soil microorganisms has been improved under HHCB and HHCB-Cd combined pollution,and the utilization efficiency of esters was the highest, while sugars and acids have lower utilization efficiency compared with others 6 kinds of carbon sources.There was no significant change in Shannon,Simpson and McIntosh indexes under HHCB pollution.While the indexes have significantly increased under the 500 and 1000 mg·kg-1HHCB-Cd combined pollution.The species richness and the dominant population were significantly promoted,and the homogeneity of the population was broken after HHCB addition in the combined pollution soil.It significantly promoted the growth of bacteria under 500 and 1000 mg·kg-1HHCB-Cd combined pollution,respectively.While HHCB has significantly inhibited the growth of actinomycetes.The abundance of bacteria was increased as the increasing of HHCB concentrations.However,the abundance of fungi and actinomycetes were decreased as the increasing of HHCB concentrations.In this study,actinomycetes were more sensitive than bacteria and fungi to the joint effects of HHCB and Cd.

galaxolide(HHCB);cadmium;combined pollution;soil microbial community；function and abundance

X171.5

A

1672-2043(2017)01-0066-10

10.11654/jaes.2016-1134

2016-09-02

律 澤(1982—)，女，遼寧錦州人，博士研究生，主要從事污染生態(tài)學和微生物生態(tài)研究。E-mail：lvze_2006@163.com

*通信作者：胡筱敏 E-mail：hxmin_jj@163.com

國家自然科學基金項目(21277150，31370523)

Project supported：T卜e National Natural Science Foundation of C卜ina(21277150，31370523)

律 澤，胡筱敏，安 婧，等.佳樂麝香與鎘復合污染對土壤微生物群落功能和豐度的影響[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學學報,2017,36(1)：66-75.

Lü Ze,HU Xiao-min,AN Jing,et al.Joint effects of galaxolide and cadmium on soil microbial community function and abundance[J].Journal of Agro-Environment Science,2017,36(1)：66-75.