張蓉蓉++艾地云++張騰飛++羅青平++溫國元++王紅琳++汪宏才++邵華斌

摘要：以C型產(chǎn)氣莢膜梭菌中PCR擴(kuò)增出β1毒素基因，構(gòu)建了表達(dá)質(zhì)粒pGEXKG-β1，將構(gòu)建的KG-β1轉(zhuǎn)化受體菌BL21（DE3），得到重組菌株BL21/KG-β1。對重組菌株誘導(dǎo)的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行了SDS-PAGE分析，結(jié)果表明重組菌株可以高效表達(dá)毒素蛋白。

關(guān)鍵詞：產(chǎn)氣莢膜梭菌；β1毒素；克隆表達(dá)

中圖分類號：Q78 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1007-273X（2016）09-0007-02

產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens）在自然界中廣泛分布，是人和動物腸道內(nèi)的一種正常菌，能產(chǎn)生a、β、ε、ι四種主要毒素，根據(jù)產(chǎn)生這四種毒素種類的不同，可將產(chǎn)氣莢膜梭菌分為A、B、C、D、E五種類型[1]。該菌在家禽中主要是能引起壞死性腸炎，雞源產(chǎn)氣莢膜梭菌主要是A型，但也有C型，C型產(chǎn)氣莢膜梭菌主要產(chǎn)生a和β兩種毒素。其中β毒素具有細(xì)胞毒性和致死性的特點(diǎn)，是重要的致病因子[2]。課題組在前期進(jìn)行了雞源產(chǎn)氣莢膜梭菌a毒素的克隆表達(dá)及免疫原性研究[3]，本研究旨在進(jìn)一步對β毒素進(jìn)行克隆表達(dá)，為其診斷試劑和亞單位疫苗的研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與載體 C型產(chǎn)氣莢膜梭菌、受體菌大腸桿菌DH5a和BL21（DE3）和pGEX-KG載體由湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所保存。

1.1.2 主要試劑 限制性核酸內(nèi)切酶BamH I和Xho I、PCR試劑盒均購自寶生物工程（大連）有限公司；RNaseA、Taq DNA聚合酶均購自寶生物工程（大連）有限公司；細(xì)菌DNA提取試劑盒購自O(shè)MEGA公司。

1.2 方法

1.2.1 引物合成 參照NCBI中產(chǎn)氣莢膜梭菌β1毒素全基因組序列，設(shè)計(jì)1對β1毒素基因引物，上游引物CPb01： 5′-ACGGGATCCTTAGTTATAGTTAGTTCACTTT-3′，下游引物CPb02：5′-ACGCTCGAGCTAAATAGCTGTTACTTTATG-3′，目的片段大小為1 008 bp，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。上游引物和下游引物分別含有BamH I和Xho I酶切位點(diǎn)。

1.2.2 全基因組的提取 將產(chǎn)氣莢膜梭菌在厭氣肉肝湯中于37 ℃厭氧培養(yǎng)過夜離心后，將沉淀菌細(xì)胞重懸于含2 mg/mL溶菌酶的TE溶液中，混勻后30 ℃水浴10 min。按照OMEGE bacterial DNA Kit說明書進(jìn)行全基因組的提取。

1.2.3 PCR擴(kuò)增 50 μL PCR反應(yīng)體系為：10×Buffer緩沖液5.0 μL，MgCL2（25 mmol/L）4.0 μL，dNTPs（10 mmol/L）1.0 μL，模板5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各2 μL和Taq DNA聚合酶（25 U）1.0 μL，加滅菌雙蒸水補(bǔ)足至50 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。取5.0 μL PCR產(chǎn)物于1.0%瓊脂糖凝膠電泳，觀察結(jié)果。

1.2.4 PCR產(chǎn)物的回收、連接轉(zhuǎn)化及鑒定 PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳回收后，以DNA膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，按說明書操作。將回收純化的目的產(chǎn)物與pGEX-KG載體雙酶切后，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，以含有氨芐西林（Amp）抗性平板進(jìn)行篩選培養(yǎng)，挑取白色菌落于含Ampr的LB液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)過夜，以SDS堿裂解法提取重組質(zhì)粒，經(jīng)PCR鑒定及BamH I和Xho I雙酶切分析篩選陽性克隆。

1.2.5 陽性質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析 將構(gòu)建的陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)入受體菌BL21（DE3）經(jīng)37 ℃加IPTG誘導(dǎo)后，按文獻(xiàn)[4]報(bào)道的方法收集菌體變性處理后，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR鑒定結(jié)果

采用設(shè)計(jì)的特異性引物進(jìn)行β1毒素基因的PCR擴(kuò)增，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果表明，以產(chǎn)氣莢膜梭菌為模板擴(kuò)增出約1 000 bp的特異性條帶，與預(yù)期大小相符（圖1）。

2.2 重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定

將質(zhì)粒經(jīng)PCR鑒定后用限制性內(nèi)切酶BamH I和Xho I進(jìn)行酶切鑒定，結(jié)果見圖2。由圖2可見，經(jīng)雙酶切后可獲得大小約為5 000和1 000 bp的2條DNA條帶，即pGEX-KG載體和目的基因條帶，初步表明成功構(gòu)建產(chǎn)氣莢膜梭菌β1毒素克隆表達(dá)質(zhì)粒。

2.3 β1毒素基因表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE分析

將BL21（DE3）菌株作為表達(dá)的宿主菌，經(jīng)轉(zhuǎn)化挑取單個(gè)菌落培養(yǎng)誘導(dǎo)后，菌體經(jīng)超聲波處理，提取包涵體，上清經(jīng)80%飽和硫酸銨沉淀后得到濃縮，沉淀經(jīng)透析后，用SDS-PAGE分析（圖3），在相對分子質(zhì)量約為56 ku處出現(xiàn)特異性蛋白條帶，結(jié)果表明β1毒素可在宿主菌種得以表達(dá)，并且β1毒素蛋白多以包涵體的形式存在表達(dá)。

3 討論

產(chǎn)氣莢膜梭菌能產(chǎn)生多種具有致病性的外毒素，其中β毒素不僅能引起家禽壞死性腸炎及仔豬腸毒血癥，也能引起嬰幼兒的壞死性腸炎[5]，危害極其嚴(yán)重。本研究利用PCR技術(shù)，設(shè)計(jì)特異性引物成功地從C型產(chǎn)氣莢膜梭菌中擴(kuò)增出目的片段β1，并構(gòu)建了成功表達(dá)β1毒素的重組菌株，表達(dá)的蛋白以包涵體形式存在，純度高。β1毒素的表達(dá)為產(chǎn)氣莢膜梭菌的臨床診斷和基因工程疫苗提供了前提。

參考文獻(xiàn)：

[1] SPARK S G， CARMAN R J， SARKER M R，et al. Genotyping of enterotoxigenic Clostridium perfringens fecal isolates associated with antibiotic-associated diarrhea and food poisoning in North America[J]. J Clin Microbiol， 2001， 39（3）：883-888；

[2] TIMBERMONT L， LANEKRIET A， PASMANS F，et.al. Intra-species growth- inhibition by Clostridium perfringens is a possible virulence trait in necrotic enteritis in broilers[J]. Veterinary Microbiology， 2009（12）：l-4.

[3] 張蓉蓉，艾地云，張騰飛，等. 雞源產(chǎn)氣莢膜梭菌a毒素基因克隆表達(dá)及免疫原性的初步研究[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，54（20）：5152-5154.

[4] 梁宋平.生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程[M].北京：高等教育出版社，2003.

[5] GRANUM P E. Clostridium perfringens toxin involved in food poisoning[J]. Int J Food Microbiol，1990，10：101-111.