袁少隆,李 蓉

(第三軍醫(yī)大學(xué)軍事預(yù)防醫(yī)學(xué)院防原醫(yī)學(xué)教研室/全軍復(fù)合傷研究所/創(chuàng)傷、燒傷與復(fù)合傷國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,重慶 400030)

6,7，4′-三羥基異黃酮(T2)水溶性衍生物的合成及其對(duì)宮頸癌細(xì)胞抑制作用的研究*

袁少隆,李 蓉△

(第三軍醫(yī)大學(xué)軍事預(yù)防醫(yī)學(xué)院防原醫(yī)學(xué)教研室/全軍復(fù)合傷研究所/創(chuàng)傷、燒傷與復(fù)合傷國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,重慶 400030)

目的 合成6,7,4′-三羥基異黃酮(6,7,4′-trihydroxyisoflavone，T2)水溶性衍生物，對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，并對(duì)其抗腫瘤活性進(jìn)行評(píng)價(jià)。方法 通過(guò)磺化反應(yīng)在原料B環(huán)中3＇位引入磺酸基(-SO3H)，進(jìn)一步濃氨水氨化后得到水溶性顯著提高的異黃酮衍生物，通過(guò)氫譜、碳譜、質(zhì)譜、元素分析等對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，CCK-8法及流式測(cè)定其殺傷宮頸癌細(xì)胞(Hela)的活性。結(jié)果 通過(guò)上述方法得到兩種水溶性異黃酮衍生物T2-SO3H·2H2O和T2-SO3(NH4)2，產(chǎn)率分別為：96%、75%，生物試驗(yàn)顯示其中T2-SO3(NH4)2抗腫瘤活性顯著增強(qiáng)。結(jié)論 與T2相比，其水溶性衍生物具有更高的生物相容性及抗腫瘤活性，有廣泛的生物應(yīng)用前景。

異黃酮類；宮頸腫瘤；異黃酮衍生物；水溶性；磺化反應(yīng)；抗腫瘤

宮頸癌是最常見的女性生殖道惡性腫瘤，發(fā)病率僅次于乳腺癌，故對(duì)宮頸癌治療的研究已成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的重點(diǎn)[1]。研究表明，大豆異黃酮(isoflavone，SI) 及其衍生物可明顯抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖，其機(jī)制多為誘導(dǎo)胞內(nèi)信號(hào)分子改變，細(xì)胞周期阻滯及促進(jìn)凋亡相關(guān)基因的表達(dá)[2-3]。然而，異黃酮及其衍生物存在水溶性及脂溶性差的弊端，體內(nèi)難以吸收，生物利用度低，限制了其生物應(yīng)用。鑒于此，在前期合成的6,7,4′-三羥基異黃酮(6,7,4′- trihydroxyisoflavone，T2)的基礎(chǔ)上[4]，化學(xué)合成了其水溶性衍生物T2-SO3(NH4)2，并研究了其對(duì)宮頸癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用，以期尋找到一種新型的抗宮頸癌藥物。

1 材料與方法

1.1 材料 T2來(lái)自于本實(shí)驗(yàn)室前期合成(生產(chǎn)批號(hào)：20140625)。人宮頸癌細(xì)胞Hela 購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，細(xì)胞在常規(guī)條件下培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于試驗(yàn)。

1.2 試劑與儀器 DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰酶購(gòu)于美國(guó)Gibco公司，批號(hào)分別為20150706、20150524、20150612；細(xì)胞增殖活性測(cè)定試劑盒(CCK-8)購(gòu)于日本Dojindo有限公司，批號(hào)20150815；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(FITC標(biāo)記了的膜聯(lián)蛋白-V/碘化丙啶，Annexin V-FITC/PI)購(gòu)于美國(guó)Bipec Biopharma公司；濃硫酸，濃氨水購(gòu)于中國(guó)科龍?jiān)噭┕?；二甲基亞?DMSO)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；多功能全自動(dòng)酶標(biāo)儀購(gòu)于美國(guó)Molecular Devices公司；流式細(xì)胞儀購(gòu)于美國(guó)BD公司；高速離心機(jī)購(gòu)于中國(guó)湖南湘儀公司；磁力攪拌器購(gòu)于德國(guó)IKA公司；隔膜泵購(gòu)于日本東京理化公司；真空干燥箱購(gòu)于中國(guó)上海一恒公司。

1.3 方法

1.3.1 3＇-磺酸基-6,7,4＇-三羥基異黃酮(3′-sulfonic-6,7,4′-Trihydroxyisoflavone,T2-SO3H·2H2O)的合成及表征 T2由本課題組前期合成[5]。取5.0 g T2于100 mL圓底燒瓶中，分別加入10、15、20、25、30或35 mL濃硫酸。超聲振蕩使原料溶解后，分別攪拌4、8、12、16或20 h，攪拌溫度分別為5、15、25、35、45、55 ℃。薄層色譜分析(thin layer chromatography，TLC)檢測(cè)反應(yīng)進(jìn)程，反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液滴加到0 ℃的水中，控溫?cái)嚢璺磻?yīng)30 min，于沙芯漏斗中抽濾反應(yīng)液。取50 mL乙腈攪洗得到的固體至中性，烘干。對(duì)得到的化合物進(jìn)行熔點(diǎn)(mp)、氫核磁共振(1H NMR，400 MH，溶劑為DMSO)、高分辨質(zhì)譜(ESI MS，水溶液)及碳核磁共振 (13C NMR，50MHz，溶劑為DMSO)分析測(cè)試。

1.3.2 3＇-磺酸氨-4＇-羥氨-6,7-二羥基異黃酮[ (3′-sulfoacid-4′-hydroxylamine-6,7,4′-Trihydroxyisoflavone,T2-SO3(NH4)2)]的合成及表征 取5.0 g T2-SO3H·2H2O置于50 mL圓底燒瓶中，加入30 mL濃氨水，避光磁力強(qiáng)烈攪拌反應(yīng)24 h后，向其中加入50 mL丙酮溶液后，布氏漏斗過(guò)濾，用丙酮洗滌至中性，去掉多余的氨水溶液。最后將產(chǎn)品置于真空干燥箱烘干。對(duì)得到的產(chǎn)品進(jìn)行ESI MS(水溶液)、元素含量分析、1H NMR(400 MH，溶劑為DMSO)及13C NMR(50 MHz，溶劑為DMSO)分析測(cè)試。

1.3.3 水溶性比較 分別取T2、T2-SO3H·2H2O、T2-SO3(NH4)2各0.2 g置于燒杯中，加水至剛好溶解澄清，觀察各化合物溶解度情況，并對(duì)各化合物水溶液的體系pH值進(jìn)行測(cè)定。

1.3.4 細(xì)胞增殖研究 將Hela細(xì)胞按2 000/孔接種于96孔板，每孔100 μL。37 ℃， 5%CO2增濕培養(yǎng)箱中孵育24 h后，各組細(xì)胞分別加入濃度為0、0.1、1.0、10.0、20.0 μmol/L的T2或T2-SO3(NH4)2，每組3個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)孵育48 h。每孔加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃避光孵育2 h，多功能酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處各孔吸光度(A)值，計(jì)算細(xì)胞增殖活性。

1.3.5 流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 Hela細(xì)胞按1×105/孔接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔1 mL，孵育箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。各組細(xì)胞分別加入濃度為0、1.0、10.0、20.0 μmol/L的T2或T2-SO3(NH4)2處理，繼續(xù)孵育48 h。胰酶消化法收集細(xì)胞，1 500 r/min離心5 min，棄去培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次。采用細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒測(cè)定細(xì)胞凋亡率，將細(xì)胞與Annexin V-FITC/PI室溫避光共孵育15 min，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1 T2-SO3H·2H2O的合成及表征 首先通過(guò)T2與濃硫酸的磺化反應(yīng)，對(duì)異黃酮骨架的芳環(huán)進(jìn)行選擇性活化，合成反應(yīng)路線及機(jī)理如圖1，最終生成化合物T2-SO3H·2H2O。本研究探討了濃硫酸用量、磺化反應(yīng)溫度及反應(yīng)時(shí)間對(duì)T2-SO3H·2H2O產(chǎn)率的影響。當(dāng)T2投料量為5.0 g時(shí)，其反應(yīng)產(chǎn)率隨著濃硫酸用量、反應(yīng)溫度及反應(yīng)時(shí)間的增加，呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)(圖2)。濃硫酸用量為25 mL，反應(yīng)溫度在25 ℃，反應(yīng)時(shí)間控制在12 h時(shí)產(chǎn)率最大(分別為88.2%、89.3%、84.6%)，反應(yīng)結(jié)果較理想。使用優(yōu)化后的反應(yīng)條件，T2投料5.0 g，得到T2-SO3H·2H2O共7.2 g，計(jì)算其產(chǎn)率96.0%。隨后對(duì)得到的T2-SO3H·2H2O進(jìn)行化學(xué)表征。mp測(cè)試結(jié)果大于300 ℃。1H NMR測(cè)試結(jié)果顯示氫原子出峰(包括相應(yīng)裂峰)位置δppm分別為8.268(1H,s,H-2)，7.690(1H,s,H-5)，7.370(2H,d,J=8.6Hz，H-2，H-6′)，6.912(1H,s,H-8)，6.820(1H,s,H-5′)。 ESI MS分析結(jié)果顯示主要離子峰為349(M-1)-。13C NMR分析結(jié)果顯示碳原子出峰位置δppm分別為174.345、152.975、152.727、152.209、150.947、144.614、131.555、130.469、127.707、122.825、122.284、116.610、116.214、108.131、102.823。

A：T2-SO3(NH4)2合成示意圖；B：芳環(huán)選擇活化的機(jī)理。

圖1 T2-SO3(NH4)2合成反應(yīng)路線及機(jī)理

A：濃硫酸用量；B：反應(yīng)溫度；C：反應(yīng)時(shí)間；D：20 mg/mL T2，T2-SO3H·2H2O,T2-SO3(NH4)2的水溶液照片。

圖2 T2磺化反應(yīng)條件試驗(yàn)

2.2 T2-SO3(NH4)2的合成及表征 進(jìn)一步通過(guò)T2-SO3H·2H2O與濃氨水的氨化反應(yīng)生成T2-SO3(NH4)2，其合成路線如圖1A。T2-SO3H·2H2O投料5.0 g，得到T2-SO3(NH4)2共3.8 g，計(jì)算其產(chǎn)率75.00%。ESI MS分析結(jié)果顯示主要離子峰為349(M-2NH4)+,進(jìn)一步的元素含量分析顯示其碳元素含量為45.80%，氮元素含量為7.33%，氫元素含量為4.41%，其1H NMR及13C NMR結(jié)果見圖3。

A：T2-SO3(NH4)2的1H NMR；B：T2-SO3(NH4)2的13C NMR。

圖3 T2-SO3(NH4)2的結(jié)構(gòu)表征分析

2.3 水溶性比較 對(duì)T2、T2-SO3H·2H2O及T2-SO3(NH4)2的水溶性進(jìn)行考察，20 mg/mL T2，T2-SO3H·2H2O及 T2-SO3(NH4)2的水溶液照片如圖2D，T2-SO3H·2H2O及

表1 T2及其衍生物在水中溶解度測(cè)試結(jié)果比較

T2-SO3(NH4)2均為橙色澄清水溶液，T2為乳白色混懸液。3種化合物具體溶解度如表1，相比T2(溶解度：<0.1 mg/mL)，T2-SO3H·2H2O(溶解度：50.0 mg/mL)和T2-SO3(NH4)2(溶解度：1 000.0 mg/mL) 的水溶性明顯提高，尤其是T2-SO3(NH4)2達(dá)到了易溶的范圍。對(duì)各化合物溶解后的體系pH測(cè)定顯示，T2(pH：6～7)及T2-SO3(NH4)2(pH：7～8)的pH均在生理pH范圍內(nèi)，而T2-SO3H·2H2O溶解后呈強(qiáng)酸性環(huán)境(pH：2～4)。

2.4 抗腫瘤活性研究 研究T2水溶性改造對(duì)其抗腫瘤活性的影響，如圖4A所示，隨著濃度的增大，T2及T2-SO3(NH4)2對(duì)Hela細(xì)胞增殖抑制呈現(xiàn)濃度依賴式增加，20 μmol/L時(shí)細(xì)胞存活率僅40.0%～50.0%；而在濃度大于1 μmol/L時(shí)，T2-SO3(NH4)2對(duì)Hela細(xì)胞的損傷顯著強(qiáng)于T2(細(xì)胞存活率降低約5.1%～9.3%)。細(xì)胞凋亡分析如圖4B，隨著濃度的增大，T2及T2-SO3(NH4)2處理Hela細(xì)胞凋亡率呈現(xiàn)濃度依賴式增加，T2-SO3(NH4)2誘導(dǎo)Hela細(xì)胞總凋亡率顯著高于T2 (細(xì)胞總凋亡率增加3.08%～12.17%)。

A：T2及T2-SO3(NH4)2對(duì)Hela細(xì)胞增殖活性影響，*P<0.05，與相同濃度T2組比較；B：T2及T2-SO3(NH4)2對(duì)Hela細(xì)胞凋亡的影響。

圖4 T2及T2-SO3(NH4)2抗腫瘤活性比較

3 討 論

三羥基異黃酮因其獨(dú)特的化學(xué)結(jié)構(gòu)，對(duì)宮頸癌細(xì)胞的抑制作用最佳。但由于其水溶性差，難以做成注射劑，水溶性和脂溶性差,做成片劑在體內(nèi)也難以吸收，生物利用度不高，嚴(yán)重阻礙了其抑癌作用的新型藥物的開發(fā)。因此，對(duì)其進(jìn)行水溶性修飾改造，是有必要的。

T2與濃硫酸的磺化反應(yīng)屬于親電子取代反應(yīng)，反應(yīng)中濃硫酸既是磺化劑又是溶劑。異黃酮骨架的B芳環(huán)活化，而A芳環(huán)卻未被磺化。其機(jī)制為在磺化反應(yīng)過(guò)程中，濃硫酸提供的質(zhì)子可以與異黃酮骨架吡喃環(huán)(C環(huán))的氧原子結(jié)合生成佯鹽。C環(huán)氧原子的質(zhì)子化使氧原子帶部分正電荷，同時(shí)對(duì)A環(huán)產(chǎn)生吸電子效應(yīng)，使A環(huán)被鈍化，不發(fā)生磺化反應(yīng)。從而高選擇性地在原料B環(huán)中3＇位引入磺酸基，該基團(tuán)易被高濃度氨水氨化[5]，從而得到異黃酮衍生物T2-SO3(NH4)2。通過(guò)相應(yīng)的ESI MS、元素含量分析、結(jié)構(gòu)表征分析、1H NMR及13C NMR結(jié)果分析研究，從而確證T2的水溶性衍生物，即T2-SO3H·2H2O及T2-SO3(NH4)2的分子結(jié)構(gòu)，為進(jìn)一步探索其的水溶性和生物學(xué)活性奠定了基礎(chǔ)。由于磺酸水溶性很好，因此T2 B環(huán)中引入磺酸基能顯著提高化合物的水溶性。但由于磺酸基具有強(qiáng)酸性，因此T2-SO3H·2H2O溶解后pH較低，不適于生理pH環(huán)境。而氨基的引入，可以中和磺酸基的強(qiáng)酸性，因此T2-SO3(NH4)2兼具較高的水溶性及生物相容性，因此具有更廣的生物應(yīng)用前景。

大量研究證實(shí)，異黃酮及其衍生物通過(guò)誘導(dǎo)凋亡相關(guān)基因如抑癌基因p53及B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2，BCL-2)的表達(dá)[6-7]，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖與分化相關(guān)信號(hào)如ERK1/2和MAPK通路[8-9]，改變細(xì)胞周期相關(guān)蛋白如CDKs蛋白激酶、細(xì)胞周期蛋白cyclin A/B的表達(dá)[10-12]，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，延長(zhǎng)細(xì)胞周期阻滯時(shí)間，抑制腫瘤細(xì)胞增殖。本研究也證實(shí)了較低濃度的T2對(duì)能誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞發(fā)生凋亡，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。而其水溶性衍生物T2-SO3(NH4)2的抗腫瘤活性顯著增強(qiáng)，其機(jī)制可能與T2-SO3(NH4)2水溶性的改善，相同濃度進(jìn)入細(xì)胞的有效成分有所增加，因此細(xì)胞的生物利用度也相應(yīng)提高有關(guān)。而化合物中-SO3(NH4)2對(duì)細(xì)胞活性是否存在影響，還需進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究在T2的基礎(chǔ)上，創(chuàng)新性地引入磺酸氨基團(tuán)，改善了化合物的水溶性，提高了抗宮頸癌細(xì)胞增殖的效應(yīng)。對(duì)后期進(jìn)一步機(jī)制研究及異黃酮抗癌新藥的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)，具有重要的生物應(yīng)用前景。

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Synthesize of water-solubility derivant of 6,7,4′- trihydroxyisoflavone (T2) and study of its inhibition effect on human breast cancer cell proliferation*

YuanShaolong,LiRong△

(TeachingandResearchingSectionofProtectiveMedicineagainstNuclearWeapons,InstituteofCombinedInjury/StateKeyLaboratoryofTrauma/BurnsandCombinedInjury,CollegeofPreventiveMedicine,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400030,China)

Objective To synthesize of water-solubility derivant of 6,7,4′- trihydroxyisoflavone(T2),to characterize its structure and to evaluate its anti-tumor activity.Methods The sulfonic group(-SO3H) was grafted to 3＇position in loop B of T2 through sulfonation reaction,then strong aqua was added to above production,and obtained a water-solubility elevated compound named T2-SO3(NH4)2through ammoniation.The construction of T2-SO3(NH4)2was characterized by1H-NMR,13C NMR,MS and element analysis.Its activity for killing human breast cancer cells (Hela) was analyzed by CCK-8 assay and flow cytometry.Results The two kinds of water-solubility derivant of T2-SO3H·2H2O and T2-SO3(NH4)2were obtained through above methods,and their yield rates were 96% and 75% respectively.The biological experiments showed that the anti-tumor activity of T2-SO3(NH4)2was significantly enhanced.Conclusion Compared to T2,T2-SO3(NH4)2exhibit higher biocompatibility and anti-tumor activity with vast biological application prospect.

isoflavones;uterine cervical neoplasms;derivant of trihydroxyisoflavone;water-solubility;sulfonation reaction;anti-tumor

??·基礎(chǔ)研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.01.005

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81172601)。

袁少隆(1983-)，技師，本科，主要從事腫瘤化療相關(guān)臨床與基礎(chǔ)方面研究?！?/p>

E-mail:lrong361@126.com。

R

A

1671-8348(2017)01-0033-03

2016-07-15

2016-08-18)