張桂山，徐 晶,2，孫麗敏，白 曼，姜懷志*

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林長春 130060；2.長春科技學(xué)院，吉林長春 130118）

絨山羊皮膚毛囊miR-1298-5P靶基因預(yù)測及表達載體構(gòu)建

張桂山1，徐 晶1,2，孫麗敏1，白 曼1，姜懷志1*

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林長春 130060；2.長春科技學(xué)院，吉林長春 130118）

探討遼寧絨山羊皮膚毛囊不同發(fā)育時期miR-1298-5P的調(diào)控作用及其與靶基因的潛在關(guān)系，為miR-1298-5P與其靶基因?qū)ζつw毛囊發(fā)育作用提供理論依據(jù)。以遼寧絨山羊皮膚毛囊組織為材料，通過miRNA的分離、表達、靶基因預(yù)測篩選表達及靶位點3′UTR表達載體構(gòu)建，采用RT-PCR 進行表達檢測，用生物信息學(xué)方法預(yù)測miR-1298-5P的靶基因，并對其靶基因FgF2的靶位點進行克隆測序、缺失突變。miR-1298-5P及其靶基因在皮膚毛囊不同發(fā)育時期均呈現(xiàn)差異性表達，二者之間呈現(xiàn)一種負(fù)調(diào)控趨勢，其可能對皮膚毛囊周期性發(fā)育起到一定的調(diào)控作用。靶基因預(yù)測發(fā)現(xiàn)FgF2的3′UTR存在miR-1298-5P種子區(qū)結(jié)合位點，并成功構(gòu)建了FgF2 3′UTR表達載體，該載體的成功構(gòu)建為后期過表達轉(zhuǎn)染體系的建立和功能基因的驗證奠定了基礎(chǔ)。

遼寧絨山羊；皮膚毛囊；miR-1298-5P；FgF2；靶基因預(yù)測；表達載體構(gòu)建

miRNA在許多生物學(xué)領(lǐng)域都被認(rèn)為是一種重要的調(diào)控因子，參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等過程，還對組織器官正常發(fā)育、動物的多種行為表現(xiàn)、病毒復(fù)制和腫瘤形成增殖等起著重要作用。近年來，不少研究者采用高通量測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)和鑒定羊皮膚毛囊中存在的保守的及新的miRNAs，本實驗中miR-1298-5p通過高通量測序技術(shù)獲得，其在毛囊發(fā)育的3個時期（生長期、退行期、休止期）呈現(xiàn)差異性表達，并在實驗中得到了驗證。毛囊具有自我更新和周期性生長的特點，其周期性變化決定被毛的生長與脫落，并受多種因子調(diào)控，有研究表明成纖維細(xì)胞生長因子（Fibroblastgrowth Factors，F(xiàn)GFs）是潛在的調(diào)控因子之一[1]。且有文獻報道FGF2在參與毛發(fā)周期發(fā)育方面具有重要的作用，Reiter等[2]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF2表達下降時，毛囊意味著進入生長期，F(xiàn)GF2的表達上調(diào)，使休止期毛囊的數(shù)量增加，意味著毛囊進入休止期。Schmidt等[3]研究發(fā)現(xiàn)，miR-1298通過抑制Cx43的上調(diào)，固定靜態(tài)血管平滑肌細(xì)胞。Hu等[4]研究發(fā)現(xiàn)，miR-1298是由DNA甲基化調(diào)控的，并且通過靶向調(diào)節(jié)cx43影響血管平滑肌細(xì)胞的功能。

為了確定miR-1298-5p對靶基因FGF2是否具有調(diào)控作用，本研究利用定點突變技術(shù)構(gòu)建了野生型和突變型真核表達載體，為下一步進行細(xì)胞水平上的功能分析奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

實驗于2014年5月至2015年9月在吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院實驗室進行。

1.1 實驗動物及試劑 驗動物為來自吉林省亞亨牧業(yè)有限公司的遼寧絨山羊，樣品采集時間為2013年9月至2014年6月；分別采集絨山羊皮膚毛囊不同發(fā)育時期1 cm2肩胛部皮膚，保存于-80℃，用于總RNA的提取。

Trizol RNA提 取 液、 反 轉(zhuǎn) 錄 試 劑 盒、d NTP、NotⅠ、XhoⅠ、T4 DNAligase均購自寶生物工程（大連）有限公司；Taq DNA聚合酶、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞、DNA純化試劑盒等均購自天根生化科技（北京）有限公司，Psicheck-2載體、質(zhì)粒小提試劑盒等購自普洛麥格（北京）生物技術(shù)有限公司。

1.2 引物設(shè)計 采用Primer 5.0設(shè)計miR-1298-5p反轉(zhuǎn)錄莖環(huán)引物（RT-Primer）、熒光定量引物、FGF2 3′UTR引物（含有NotⅠ和XhoⅠ2個酶切位點）及內(nèi)參U6所用引物。采用Primer X設(shè)計突變型引物（含有NotⅠ和XhoⅠ2個酶切位點）。引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。實驗所用引物及序列見表1。

表1 引物及序列

1.3 高通量測序 提取絨山羊肩部皮膚組織總RNA，送交百邁克生物科技有限公司進行高通量測序檢測。

1.4 miR-1298-5p靶基因的預(yù)測 采用miRNA在線靶基因預(yù)測軟件Targetscan、miRanda、miRDB并結(jié)合文獻調(diào)控毛囊發(fā)育的相關(guān)通路，預(yù)測FGF2為miR-1298-5p的潛在靶基因。

1.5 miR-1298-5p與FGF2實時熒光定量PCR 20 μL反應(yīng)體系cDNA 2 μL，Master Mix 10 μL，F(xiàn)-Primer 1 μL，R-Primer 1 μL，RNase free H2O 6 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，66℃（58℃）退火10 s，72℃延伸15 s，循環(huán)30次。

1.6 靶基因FGF23′UTR表達載體構(gòu)建

1.6.1 靶基因FGF23′UTR PCR擴增 Trizol法提取絨山羊不同發(fā)育時期皮膚毛囊組織總RNA，采用莖環(huán)引物（RT-Primer）和反轉(zhuǎn)錄通用引物反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。20 μL擴增體系，cDNA 1 μL，Tag 0.2 μL，F(xiàn)-Primer 0.5 μL，R-Primer 0.5 μL，dNTP 3 μL，10×Buffer 2 μL，RNase free H2O 12.8 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性40 s，60℃退火30 s，72℃延伸2 min，循環(huán)35次。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，膠回收純化試劑盒回收純化目的片段，將純化的目的片段與T載體（PMD18T）連接，轉(zhuǎn)化到DH5α中，挑取單菌落，提質(zhì)粒，測序驗證。

1.6.2 野生型質(zhì)粒與突變型質(zhì)粒構(gòu)建 野生型質(zhì)粒構(gòu)建：利用限制性內(nèi)切酶NotⅠ和XhoⅠ分別將含有上述酶切位點的克隆質(zhì)粒與PsiCHECK-2載體雙酶切。反應(yīng)體系見表2。

表2 酶切體系

分別對酶切產(chǎn)物進行回收純化，純化后的目的片段與載體連接，20 μL連接體系：酶切目的片段6 μL（30 ng）酶切載體psicheck-2 5 μL（50 ng），10XT4 DNAligase Buffer 2 μL，T4 DNAligase 1 μL，ddH2O 6 μL。上述連接混合液16℃水浴2 h。將連接液轉(zhuǎn)入DH5α中，挑取單菌落搖菌，提質(zhì)粒，篩選出陽性克隆測序。

突變型質(zhì)粒構(gòu)建：采用兩步法PCR進行目的片段的擴增，以克隆質(zhì)粒為模板，分別用2對引物進行PCR擴增50 μL反應(yīng)體系：克隆質(zhì)粒10 μL，10× Pfu Buffer 5 μL，F(xiàn)1-Primer（F2-Primer ）2 μL，R1-Primer（R2-Primer） 2 μL，dNTP 1 μL，Pfu 0.4 μL，ddH2O 29.6 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min；94℃變性20 s，56℃退火20 s，72℃ 復(fù)性30 s，72℃延伸6 min，循環(huán)22次。以PCR產(chǎn)物為模板，完成目的片段的拼接，50 μL拼接反應(yīng)體系：PCR產(chǎn)物各2 μL，10×Pfu Buffer 5 μL，F(xiàn)1-Primer 2 μL，R2-Primer 2 μL，dNTP 1 μL， Pfu 0.4 μL，ddH2O 35.6 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min；94℃變性20 s，57℃退火20 s，72℃復(fù)性30 s，72℃延伸6 min，循環(huán)22次。擴增結(jié)束后取PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，膠回收純化試劑盒回收純化目的片段，連接、轉(zhuǎn)化及篩選克隆測序同上。

2 結(jié)果與分析

2.1 高通量測序及表達檢測 通過高通量Solexa測序法獲得了miR-1298-5p的成熟序列5′-uucauucggcuguccagaugua-3′，前體序列5′-gcugu ccagauguauccaaguacccugauauuuggcaauaaauacaucugggc aacugauugaacuuuucgcuuuucagacu-3′。通過Solexa高通量測序方法測定了絨山羊皮膚毛囊發(fā)育不同時期差異表達的miRNA，即篩選出miR-1298-5p，從圖1可見，miR-1298-5p的表達量從生長期到退行期上升，而從退行期到休止期下降。

圖1 不同時期miR-1298-5P相對表達

2.2 靶基因預(yù)測 采用miRNA在線靶基因預(yù)測軟件Targetscan、miRanda，miRDB并結(jié)合文獻調(diào)控皮膚毛囊發(fā)育的相關(guān)通路，預(yù)測FGF2 是miR-1298-5p的潛在靶基因。miR-1298-5p種子區(qū)與其靶基因FGF2 3′UTR結(jié)合位點如圖2。

圖2 miR-1298-5P種子區(qū)與其靶基因3'UTR

2.3 絨山羊皮膚毛囊不同發(fā)育時期miR-1298-5p和FGF2的實時定量PCR分析 熒光定量結(jié)果表明miR-1298-5p在絨山羊皮膚毛囊不同發(fā)育時期呈現(xiàn)差異性表達（見圖3），并且miR-1298-5p在絨山羊皮膚毛囊發(fā)育不同時期的表達趨勢與高通量檢測的表達趨勢相同，從而進一步驗證了miR-1298-5p在絨山羊皮膚毛囊發(fā)育不同時期確實呈現(xiàn)差異表達。從圖4中可見，F(xiàn)GF2 mRNA從生長期到退行期下調(diào)，而從退行期到休止期上調(diào)，且FGF2相對表達量與miR-1298-5p相對表達量呈現(xiàn)負(fù)調(diào)控趨勢，進一步說明FGF2可能為miR-1298-5p的潛在靶基因。

圖3 miR-1298-5P相對表達量

圖4 FgF2 mRNA相對表達量

2.4 miR-1298-5p靶基因FGF2 3′UTR表達載體構(gòu)建

圖5 總RNA瓊脂糖凝膠電泳

圖6 miR-1298-5p PCR擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳

圖7 靶基因3'UTR部分區(qū)域 PCR擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳

2.4.1 總RNA的提取檢測與miR-1298-5p PCR鑒定 圖5顯示RNA分子28S、18S 和5S 各條帶清晰，OD260/OD280均在2.0左右，說明總RNA質(zhì)量較好，能滿足后續(xù)實驗要求；圖6顯示目的條帶和內(nèi)參U6片段小于100 bp，成功擴增出目的miRNA片段。

2.4.2 靶位點PCR鑒定 采用野生型引物進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳得到1條大小為199 bp的清晰條帶，與預(yù)期大小一致（如圖7）。

2.4.3 質(zhì)粒測序圖譜 圖8為野生型質(zhì)粒測序圖譜，紅色區(qū)域為miR-1298-5p種子區(qū)結(jié)合位點GAATGAA。采用兩步法PCR進行缺失突變，將其原來靶位點突變?yōu)門GAA（如圖9紅色區(qū)域），進而獲得了突變型質(zhì)粒，從而成功構(gòu)建了靶基因FGF23′UTR表達載體。

2.4.3 質(zhì)粒測序圖譜 圖8為野生型質(zhì)粒測序圖譜，紅色區(qū)域為miR-1298-5p種子區(qū)結(jié)合位點GAATGAA。采用兩步法PCR進行缺失突變，將其原來靶位點突變?yōu)門GAA（如圖9紅色區(qū)域），進而獲得了突變型質(zhì)粒，從而成功構(gòu)建了靶基因FGF23′UTR表達載體。

圖8 野生型質(zhì)粒測序圖譜片段

圖9 突變型質(zhì)粒測序圖譜片段

3 討 論

miRNA 5′端2～8個堿基為其種子區(qū)，主要是通過與靶基因3′UTR結(jié)合，阻礙或抑制靶基因的翻譯，少數(shù)文獻有報道其與靶基因編碼區(qū)及5′UTR作用從而抑制靶基因的翻譯[5]。一個miRNA分子常常同時抑制多個具有識別序列的組織特異性mRNA的表達[6]。此外，利用靶基因預(yù)測軟件預(yù)測靶基因的過程中發(fā)現(xiàn)，同一個靶基因3′UTR同時存在多個不同miRNA的作用位點，也就是說多個miRNA可以同時調(diào)控一個靶基因。

大量的研究者逐漸將研究重點轉(zhuǎn)向miRNA與其靶基因的調(diào)控關(guān)系方面的研究。Wang等[7]在研究mir-133a及其靶基因?qū)Ψ切〖?xì)胞肺癌功能作用的過程中構(gòu)建了IGF1R及TGF-βR1的表達載體，并利用過表達mir-133a來驗證其與靶基因的互相調(diào)控作用。已有文獻報道FGF2具有促進細(xì)胞生長、增殖及抑制細(xì)胞凋亡的重要作用，此外FGF2也通過激活相關(guān)的信號通路因子進而發(fā)揮作用。Kiso等[8]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF2與PDGF在促進體外培養(yǎng)的小鼠觸須真皮乳頭細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)毛發(fā)再生方面具有協(xié)同作用。Hwang等[9]在研究腺苷對體外培養(yǎng)小鼠觸須毛囊真皮乳頭作用的過程中發(fā)現(xiàn)，腺苷通過提高FGF2與FGF的表達，從而促進真皮乳頭細(xì)胞的增殖。FGFR1在胎盤血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖方面具有重要作用，而FGF2恰恰通過FGFR1間接作用于胎盤血管內(nèi)皮細(xì)胞，同時，F(xiàn)GF2誘導(dǎo)激活PI3K/ AKT1和ERK1/2 信號通路，進而抑制細(xì)胞的凋亡[10-11]。Yang等[12]研究發(fā)現(xiàn)FGF2與FGF10通過激活MAPK信號通路為介質(zhì)，引起綿羊胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞遷移。Yang等[13]研究發(fā)現(xiàn)了5種miRNA作為預(yù)測膠質(zhì)瘤的分子靶點，其中25個miRNAs上調(diào) 包括hsa-mir-675，hsa-mir-196a-1，和hsamir-196a-2等，而8個miRNAs下調(diào)包括hsamir-1911、hsa-mir-1264、hsa-mir-1298等。因此，本實驗通過高通量測序技術(shù)找出在絨山羊皮膚毛囊發(fā)育不同時期呈現(xiàn)差異表達的miRNA（即miR-1298-5P），再通過靶基因預(yù)測軟件并結(jié)合毛囊發(fā)育相關(guān)通路預(yù)測了miR-1298-5p的靶基因，從中挑取5～6個靶基因進行驗證，F(xiàn)GF2是其中之一，通過構(gòu)建miR-1298-5P靶基因FGF2的表達載體為下一步進行細(xì)胞實驗的開展奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

miR-1298-5p與FGF2在遼寧絨山羊皮膚毛囊發(fā)育過程中均呈現(xiàn)差異性表達，并且二者之間呈現(xiàn)一種負(fù)調(diào)控趨勢，說明其可能對皮膚毛囊發(fā)育具有一定的調(diào)控作用，并成功構(gòu)建靶基因FGF2的表達載體。

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Target Gene Prediction of MiR-1298-5p and Expression Vector Construction in Skin and Hair Follicles of Cashmere Goat

ZHANG Gui-shan1, XU Jing1,2, SUN Li- min1, BAⅠ Man1, JⅠANG Huai-zhi1*
(1. College of Animal Science and Technology, Jilin Agricultural University, Jilin Changchun 130118,China 2. Changchun Sci-Tech University, Jilin Changchun 130060,China; )

To describe the mir-1298-5p regulation on skin and hair follicles development at diferent stage of Liaoning cashmere goat and potential relationship between mir-1298-5p and its target gene for obtaining theoretical basis on skin and hair follicles development. Using skin and hair follicles from Liaoning cashmere goat as materials, several experiments were conducted, such as isolation of miRNA by trizol, expression of miRNA and target gene by RT-PCR, target gene prediction and screen by predicting software on line and 3'UTR expression vector construction by cloning, sequencing and knocking down mutation. miR-1298-5p and FGF2 mRNA both presented diferential expression during the course of skin and hair follicles development, which may play an important role in skin and hair follicles periodic development. 3'UTR of FGF2 presented a binding site of miR-1298-5p. MiR-1298-5p and FGF2 presented negative regulation. And 3'UTR expression vectors of FGF2 were successfully constructed. The expression vectors laid a foundation for construction of over expression transfected system and functional verifcation of target gene

Liaoning cashmere goat; Skin and hair follicles; MiR-1298-5p; FGF2;Target gene prediction; Expression -vector construction

S827.5

A

10.19556/j.0258-7033.2017-01-028

2016-07-12；

2016-08-24

吉林省科技發(fā)展計劃項目（20150236）；吉林省教育廳項目（2015566）

張桂山（1978-），男，吉林榆樹人，講師，博士，主要從事羊遺傳育種研究，E-mail：zhangguishan204@aliyun.com

*通訊作者：姜懷志，E-mail: 513540644@qq.com